细胞周期细胞凋亡操作步骤
简述细胞凋亡的过程
简述细胞凋亡的过程
细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,通常是在细胞受到损伤、感染或疾病等因素诱导下发生的。
细胞凋亡的过程可以概括为以下几个步骤:
1. 细胞受到损伤或感染时,会出现一些信号分子,如DNA损伤调节蛋白(DNA 损伤蛋白)和细胞周期控制蛋白(CDK4/CDK6)等,向细胞内传递损伤信号,促使细
胞发生凋亡。
2. 细胞收到损伤信号后,会启动细胞内的凋亡程序,通过调节一系列基因和蛋白质的表达来诱导细胞凋亡。
其中,细胞凋亡激活因子(例如BCL-2和Bax)和
凋亡诱导蛋白(例如P75和PID)等蛋白会被激活,促进细胞凋亡的发生。
3. 凋亡的发生会导致细胞膜的破裂和细胞核的释放,从而导致细胞凋亡。
同时,细胞核内的DNA会被降解和释放出,从而导致细胞的死亡。
4. 细胞凋亡的过程可以受到多种因素的影响,如细胞内外的压力、化学物质、药物等。
这些因素可以抑制凋亡的发生或加强凋亡的效应。
细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,对于维护细胞的正常功能和生物学特性具有重要意义。
研究细胞凋亡的过程和机制,对于治疗许多疾病和预防疾病的进展都具有重要的意义。
细胞周期细胞凋亡操作步骤
精品 Word 可修改 欢迎下载 1． 细胞周期a. 取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，接种于60mm 的皿，每个皿大约接种细胞1X10^6个。
37°C 5% CO2培养1-2天。
b. 当细胞融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，1100转离心3分钟。
c. 去掉上清，DPBS 洗1次，每次6mL ，1100转离心3分钟。
d. 去掉上清，0.5mL 冰冷的DPBS 重悬成单个细胞后，逐滴加入70%冰乙醇6mL ，边加边晃动，4度冰箱过夜（乙醇固定作用比较慢，最好多放几天，最好一周内继续做下面的步骤）。
e. 1800转离心5分钟，弃上清，用6mL DPBS 清洗两次，1800转离心5分钟。
f. 用0.5mL PBS 重悬（如果细胞过多，可用更多PBS 重悬，然后取0.5mL ），加入2uL Rnase（100mg/mL ），终浓度为（400mg/mL ），室温作用30分钟。
g. 加入10uL PI ，避光孵育15分钟，可上流式细胞仪检测。
2． Annexin V - FITC/PI 测细胞凋亡。
a. 取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，接种于6孔板，每个孔大约接种细胞5X10^5个。
37°C 5% CO2培养1-2天。
b. 当融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，每个孔用一个15ml 离心管单独收集，1000转离心3分钟。
c. 用2ml DPBS 重悬细胞， 1000转离心3分钟。
d. 用2ml 1 X Banding Buffer 重悬细胞， 并且计数，1000转离心3分钟。
e. 用1 X Banding Buffer 重悬细胞，使细胞密度为1X10^6个/ml 。
取100ul 到一个新的流式管中。
f. 选取正常的细胞三管为补偿管，①双阴性-正常细胞，不加入任何抗体。
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)
细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(PI法)产品简介：Leagene细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一种采用经典的碘化丙啶染色(PI staining)方法进行细胞周期与细胞凋亡分析的检测试剂盒。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种可以嵌合到双链DNA和RNA的碱基对中与直接和的荧光染料，无碱基特异性。
碘化丙啶与双链DNA结合后可以产生荧光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。
细胞内的DNA被Propidium Iodide染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，然后根据DNA含量的分布情况，可以进行细胞周期和细胞凋亡分析。
碘化丙啶染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
凋亡细胞由于细胞核发生浓缩以及发生DNA片段化(DNA fragmentation)导致部分基因组DNA片断在染色过程中丢失，因此凋亡细胞碘化丙啶染色后呈现明显的弱染，即荧光强度小于1，在流式检测的荧光图上出现所谓的sub-G1峰，即凋亡细胞峰。
细胞凋亡时，流式细胞检测可呈现亚二倍体核型的特征，根据光散射的特点，PI染色可以区分细胞凋亡和细胞坏死的细胞峰型。
细胞凋亡时，出现凋亡细胞皱缩、染色质浓缩、核碎裂，产生凋亡小体，使细胞的前向光散射低于正常。
在细胞凋亡的早期，细胞对前向角光散射的能力显著降低，对侧向光散射的能力增加或没有变化。
在细胞凋亡的晚期，前向和侧向光散射的信号均降低。
细胞坏死时细胞多表现为细胞肿胀，因此前向光散射高于正常，对侧向光散射高于正常。
Leagene Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit经常用于培养的贴壁或悬浮细胞的细胞周期与细胞凋亡检测，亦可用于区分细胞凋亡和细胞坏死。
细胞周期和细胞凋亡
性染料标记细胞的DNA和RNA ，通过观察这些
成分的含量变化来区分凋亡细胞。
PI染色后，由于凋亡细胞的DNA含量低于正
常的二倍体含量，会在二倍体峰前出现一个亚二
倍体峰（Sub-G1峰、凋亡峰、AP峰）。可根据
此峰的面积计算凋亡细胞的百分率。
区分细胞碎片和凋亡细胞
又称为程序性死亡
（programmed cell death, PCD）
一.细胞凋亡的特征
形态学特征： 细胞膜向外突起，细胞体积缩小 ↓ 染色质凝缩，然后断裂成碎片 ↓
形成数个大小不等的由膜包裹的凋亡小体
↓ 凋亡小体被邻近细胞吞噬
（2）细胞坏死（necrosis）
概念：细胞受到激烈的物理、化学刺激或 严重的病理性刺激后，引起的细胞损伤和 死亡。 特征：胞膜通透性增高，使细胞肿胀，细 胞器变形或肿大，细胞核破碎，最后细胞 溶解破裂，溶酶体泄漏，引起炎症反应。
凋亡细胞表面有 众多凋亡小体
3、流 式 细 胞 分 析 仪
（Flow Cytometry，FCM）
概念：
流式细胞仪是将流体喷射技术、激光技 术、空气计数、γ-射线能谱术及电子计算机 等技术与显微荧光光度计结合的一种大型的 精密仪器，它通过测量在一定波长的激光激 发快速流动的粒子（细胞或微粒）荧光和散 射激光来获得粒子的一些成分及其变化情况， 进行多参数的、快速的定量分析和分选的技 术。 FCM应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫 学等进入了细胞和分子水平的研究。
ER膜、mi膜上。
②促进细胞增殖的基因
如：c-myc、c-abl、ras相关基因
2.死亡基因
(1)促进细胞死亡的基因 caspase基因家族： Bax基因：Bax过度表达，可拮抗bcl-2的 促进细胞增殖作用及抑制程序性细胞死 亡。
细胞凋亡周期
3细胞凋亡之 caspase检测
• 背景知识
– 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程 的蛋白叫做Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶） – Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的重要组分，即Caspase 3激活==细胞凋亡
细胞凋亡之 凋亡相关酶检测
名称
Caspase-1
品牌
CST CST
细胞凋亡之 caspase-3
Jurkat T-Cells
6 µM camptothecin for 4 h
untreated
细胞凋亡之 caspase-3
Jurkat T-Cells
Mouse Thymocytes
固定、破膜过程
细胞凋亡之 caspase-3
产品编号
9602S
原理：JC-1有有单体和多聚体两种存在形式，高浓度时多聚体，发红色荧光（FL2检测）， 低浓度时单体形式，发绿色荧光（FL-1检测）。 正常细胞：膜电位正常，JC-1靠线粒体膜极性进入线粒体内，随浓度升高多聚体，红光 凋亡细胞：线粒体膜电位去极化，JC-1从线粒体释放，浓度降低，转为单体，绿光 通过检测绿色和红色荧光：
细胞
检测方法
免疫荧光
TUNEL法 Annexin V/PI Caspase 通路 线粒体膜电位
核酸
细胞膜 胞内通路
线粒体
细胞生命活动之：细胞周期
2.1细胞周期
细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为 间期与分裂期两个阶段。
2.1.1细胞周期检测原理
利用特殊的荧光染料(PI等)与 细胞内DNA碱基结合，被这些 荧光染料染色的细胞在激光 照射下发射出荧光，荧光强 度与DNA含量成正比。流式细 胞仪通过测定细胞的荧光强 度推算出细胞的DNA含量。
细胞凋亡和细胞周期的调控和信号传导机制
细胞凋亡和细胞周期的调控和信号传导机制细胞是生命体系的基本单位。
在生物体的发育和维护过程中，细胞需要遵循一定的生长和分裂规律。
其中细胞周期和细胞凋亡是最为基本的两种细胞行为。
细胞周期是指细胞从分裂到再生一个新细胞的过程，而细胞凋亡则是细胞主动死亡的过程。
这两种过程的规律和机制的了解对于许多疾病的治疗和研究都具有非常重要的意义。
本文将对细胞周期和细胞凋亡的调控和信号传导机制进行介绍。
一、细胞周期调控和信号传导机制1. 细胞周期的四个阶段细胞周期分为四个阶段：G1期、S期、G2期和M期。
G1期是细胞末次分裂后到DNA复制开始的一个时期，这个时期是细胞可以共沉积配体吸收营养物质的一段生长发育期，由于细胞代谢和复制准备的过程，故G1阶段为整个细胞周期中的最长期。
S期是核内DNA复制的期间，G2期为S期到有丝分裂前的间隔期间，M期是细胞周期的有丝分裂期，完成有丝分裂，分裂成为两个相同的细胞。
2. 细胞周期调控细胞周期的进展是通过CDK蛋白激酶的活化和解除来控制的。
激酶能够与细胞周期蛋白进行特异性配对，并引起细胞周期蛋白的磷酸化。
当细胞周期蛋白与CDK激酶结合后，CDK激酶则会引起细胞周期蛋白的磷酸化和激活。
3. 细胞周期的信号传导生长因子信号和环境信号都可影响细胞周期的进展速度。
例如，生长因子与特定受体结合，可激活Ras信号转导路径，最终导致与细胞周期有关的蛋白激酶CDK的激活。
环境信号也能影响细胞周期的进展，例如，过量的辐射或一些化学物质都能引起细胞周期的停滞或抑制。
二、细胞凋亡调控和信号传导机制1. 细胞凋亡的三大途径细胞凋亡是程序性细胞死亡，凋亡的方式主要有三个途径：内质网应激途径、线粒体途径和死受体途径。
在内质网应激过程中，内质网早期蛋白（ER）的异常积聚可引起细胞周期阻滞和细胞凋亡。
线粒体途径包括线粒体膜潜在分裂和Bcl-2家族蛋白质表达调节。
死受体途径是通过受体-配体作用引起一系列生化反应，并最终激活真核酸酶，导致DNA降解和凋亡。
生物中的细胞周期与凋亡
生物中的细胞周期与凋亡细胞是生命的基本单位，而细胞周期和细胞凋亡是细胞生命中两个极为重要的过程。
细胞周期是指从一个细胞分裂到下一个细胞分裂的整个过程。
一个典型的细胞周期包括四个阶段：G1期、S期、G2期和M期。
在G1期，细胞正在增长，细胞器和分子正在进行复制。
在这个阶段，细胞需要决定是否进入下一个阶段，即S期。
如果细胞决定进入S期，它就会开始复制其DNA。
在S期，细胞复制其DNA，并准备进入下一个阶段，G2期。
在G2期，细胞再次增长并准备进入M期。
在M期，细胞进行有丝分裂或无丝分裂，将其DNA平均地分配到两个新细胞中，并最终分裂成两个新细胞。
细胞周期对生命的维持是极为重要的。
正常的细胞周期对我们的身体健康非常重要，因为它帮助我们的组织、器官和身体部位正常生长和更新。
不同类型的细胞不同的周期长度，例如皮肤细胞约为24小时，肠道上皮细胞约为2至3天，肝脏细胞长达1至2年。
在某些情况下，细胞周期可能发生异常，导致癌症等疾病的发生。
当细胞周期发生异常时，可能会导致细胞凋亡。
细胞凋亡是一个非常重要的生物学过程，它是一个自我毁灭过程，可帮助体内细胞维护平衡，并消除受损或不需要的细胞。
相比于细胞死亡，细胞凋亡是一种有序且可控的过程。
细胞凋亡可以通过两个不同的途径实现：外源性途径和内源性途径。
外源性凋亡途径在细胞的外部发生，由于细胞周围环境的变化，如细胞暴露于化学物质、辐射等有害物质，也可能引起细胞凋亡。
内源性凋亡途径可由细胞内部产生信号引起，这些信号是在细胞周期异常或细胞损伤或其他细胞病理学状况下产生的。
当这些内在信号引起细胞凋亡时，依赖的途径是线粒体途径。
线粒体途径的分子调控网络非常复杂，包括许多的蛋白质以及多种信号分子。
当细胞受到刺激时，这些信号分子会激活一系列的受体，在受体的介导下，信号转移到线粒体，使线粒体的膜通透性发生改变，释放出线粒体内部的多种信号物质，这些信号物质进一步引发一系列的下一步反应，最终导致细胞死亡。
细胞周期实验标准操作流程
细胞周期实验标准操作流程1.种板细胞个数：5mL含5×106个的细胞悬液种在75mL培养瓶中。
2.加药处理足够的时间后，终止反应；3.收集细胞（加药后细胞还需收集培养液中的细胞）；4.PBS洗2次，1000r/min离心10min；5.用1mL的PBS悬浮细胞后置入15mL离心管中，在漩涡振荡器上，边振荡边缓慢加入共9mL体积的70%的预冷冰乙醇。
盖上盖子；6.将固定好的细胞放入-20℃保存（可长期保存，但至少要过夜）；7.使用前，1000r/min离心10min弃去70%冰乙醇，用预冷的PBS洗涤2次；8.用0.5mL的50µg/mLRNase（用PBS配）悬浮细胞后，置37℃水浴中30min；9.最后加入25µL1mg/mLPI（用PBS配），避光染色30min；10.上流式细胞仪Ari aⅢ检测细胞周期。
注意事项：1.做早期凋亡（annexin V和PI双染）实验，需要准备一管未染色的细胞；细胞周期全部样品都需要加入PI染料；2.如果用试剂盒或者之前已经配好Rnase和PI浓度也不要紧。
原则是要求：Rnase和PI的终浓度都能达到50µg/mL。
雪 2011-12-8 9:26:21小莫，做细胞周期实验需要养细胞洪雪 2011-12-8 9:26:29把药物加到细胞里面洪雪 2011-12-8 9:26:38用细胞来测周期的洪雪 2011-12-8 9:27:12你让你老婆先了解一下大概的情况，要是真的想做，再联系我洪雪 2011-12-8 9:27:24我们仪器试运行到这个学期期末洪雪 2011-12-8 9:27:42试运行期间不收费洪雪 2011-12-8 9:28:21不收测试费，但是需要自己准备染料等其他的。
我们只帮测和分析数据缘 10:00:57好的，谢谢缘 10:01:07是你在测吗洪雪 10:03:08是的洪雪 10:03:20她有学生在养细胞吗？缘 10:03:27有啊洪雪 10:03:44在哪里养缘 10:03:48刘观艳在养缘 10:03:54在六楼洪雪 10:04:24那她要测的那几个化合物做过MTT吗？缘 10:04:37做过了10:04:53成功接收文件打开文件打开所在文件夹洪雪 10:04:55那你把这个给她缘 10:04:57好像是在中国药科大学做的洪雪 10:05:06让她按这个来准备做周期的样品洪雪 10:05:35但是她还没有RNA酶和PI呀，这个得买缘 10:05:47这个要多少钱洪雪 10:06:02看你要什么公司的了缘 10:06:10你们经常用的洪雪 10:06:24我们这边用的是SIGMA的洪雪 10:06:47但是这个要至少一个月才买得回来，有点久洪雪 10:07:03你想下其他的办法缘 10:07:06好的洪雪 10:07:18或者去和彭老师借一点洪雪 10:07:26阿远之前用过的洪雪 10:07:30她做过洪雪 10:07:36我之前配了好多洪雪 10:07:40在细胞房缘 10:07:47好的，那我问一下洪雪 10:07:52恩洪雪 10:08:11我们这边上班时间的下午开机。
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1．细胞周期
a.取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，
接种于60mm的皿，每个皿大约接种细胞1X10^6个。
37°C 5% CO2培养1-2天。
b.当细胞融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，
1100转离心3分钟。
c.去掉上清，DPBS洗1次，每次6mL，1100转离心3分钟。
d.去掉上清，0.5mL冰冷的DPBS重悬成单个细胞后，逐滴加入70%冰乙醇6mL，边加
边晃动，4度冰箱过夜（乙醇固定作用比较慢，最好多放几天，最好一周内继续做下面的步骤）。
e.1800转离心5分钟，弃上清，用6mL DPBS清洗两次，1800转离心5分钟。
f.用0.5mL PBS重悬（如果细胞过多，可用更多PBS重悬，然后取0.5mL），加入2uL Rnase
（100mg/mL），终浓度为（400mg/mL），室温作用30分钟。
g.加入10uL PI，避光孵育15分钟，可上流式细胞仪检测。
2．Annexin V- FITC/PI测细胞凋亡。
a.取生长状态良好的细胞，用0.25%胰酶消化为单个细胞，用正常培养基重悬计数，
接种于6孔板，每个孔大约接种细胞5X10^5个。
37°C 5% CO2培养1-2天。
b.当融合度大约80%，细胞处于对数增长期时，用0.25%胰酶消化为单个细胞，每个
孔用一个15ml离心管单独收集，1000转离心3分钟。
c.用2ml DPBS重悬细胞，1000转离心3分钟。
d.用2ml 1 X Banding Buffer重悬细胞，并且计数，1000转离心3分钟。
e.用1 X Banding Buffer重悬细胞，使细胞密度为1X10^6个/ml。
取100ul到一个新的
流式管中。
f.选取正常的细胞三管为补偿管，①双阴性-正常细胞，不加入任何抗体。
②Annexin V-
FITC补偿管，加入Annexin V- FITC抗体5ul。
③PI补偿管，加入PI抗体5ul。
g.样本管为处理过的细胞，对照组为正常细胞，分别加入Annexin V-FITC抗体5ul和
PI抗体5ul。
避光室温15min。
h.加入400ul 1 X Binding Buffer。
尽快上流式细胞仪检测。