基因工程的基本操作程序主要基本步骤

直接分离 片段→不同受体细
有盲目性，
法
胞→DNA片段扩增→ 操作简便 目的基因含
（鸟枪法）目的基因细胞→目 的基因
有不表达的 内含子
反转录法
mRNA →单链DNA →双链DNA
专一性强，操作过程麻
目的基因 烦，mRNA
不含内含 生存时间短，
子
技术要求高
据已知的 氨基酸序 列合成
氨基酸序列 mRNA 双链DNA
专一性最 强，目的 基因不含 内含子
目前复杂的 尚不知的核 苷酸序列不 能合成
2目的基因与运载体结合
首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现 一个切口，露出黏性末端。
然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生 相同的黏性末端。
将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处， 再加入适量DNA连接酶，质粒的黏性末端与 目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基互 补配对而结合，形成了一个重组DNA分子。
步骤三：目的基因导入受体细胞---转化
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
酵母菌和动植物细胞等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
3将目的基因导 入受体细胞
受体细胞：细菌
氯化钙
基因工程中常用的 细胞壁的通透性增大 受体细胞有大肠杆 菌、枯草杆菌、土 壤农杆菌、酵母菌 重组质粒进入受体细胞 和动植物细胞等。
1）高产、稳产和具优良品质的品种 用基因工程的方法可以改善粮食作物的
蛋白质含量。如“向日葵豆”植株。 2）抗逆性品种
将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗 盐碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作 物体内，将从根本上改变作物的特性。如转 基因抗虫棉。
迄今为止，人们已获得了 数百种转基因植物：抗病、 抗虫、抗除草剂、抗逆、作 物的高产优质、果蔬储存、 作物的固氮能力、药物生产 及环境美化等
4、结果：形成两种末端 粘性末端
平末端
二、 “分子缝合针” —— DNA连接酶
1、种类：两类
E·coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
2、作用部位：磷酸二酯键
DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙 “缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连 接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。
“分子缝合针”——DNA连接酶
基因工程
一、 “分子手术刀” ——限制性核酸内切 酶
1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的一
种酶。能将外来的DNA切断，由于这种 切割作用是在DNA分子内部进行的，故 名限制性内切酶。
2、种类：4000种。
3、作用：识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸
序列，并且使每一条链中特定部位的两 个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
思考：检测mRNA 是否合成，可以用分子杂交的方法吗？
##检测目的基因是否翻译成蛋白质— 抗原—抗体杂交
##个体生物学水平的鉴定——
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因 完成了表达吗？
不能，受体细胞必须表现出特定的性状， 才能说明目的基因完成了表达。
若不能表达， 要对抗虫基因 再进行修饰。
转基因马铃薯
1.抗虫转基因植物
2.抗病转基因植物
3.其他抗逆转基因植物
4.利用转基因改良植物的品质
动物基因工程前景广阔
畜牧养殖业：培养具有各种优良品质的 转基因动物（具有抗病能力、高产仔率、 高产奶率、高质量的皮毛）
方法：将某些特定基因与病毒DNA构
成重组DNA，然后通过感染或显微注射 技术将重组DNA转移到动物受精卵中
目的基因随受体细胞的繁殖而复制
受体细胞的选择
1、原核生物细胞：
（1）优点：容易摄取外界的基因（目的基因），
繁殖快，便于培养和基因操作
（2）主要生物：大肠杆菌、蓝藻
2、真核生物细胞：
酵母
主 要 生 物
植物细胞——活的植物离体体细胞在 合适的培养条件下比较容易再分化成 植株（转基因植物）
动物细胞——常采用生殖细胞、受精 返
1、作用：恢复被限制性内切酶切开了的两个 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
2、分类：从大肠杆菌中分离得到 从T4噬菌体分离得到
3、区别：E.coli连接黏性末端 T4既能连接黏性末端，又可以连接 平末端（效率低）
“分子运输车”——基因进入细胞的载体
1、常用载体：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒
2、质粒：最常用的载体 是一种裸露的、结构简单、独立于拟核 之外、并具有自我复制能力的双链DNA 分子
例：100克/2000升大肠杆菌培养液
（2）优点：高质量、低成本
（3）基因工程药品：60余种
生长激素释放抑制素——参与生长的调节 可用来治疗肢端肥大症、急性胰腺炎等疾病
胰岛素——治疗糖尿病 TPA（组织纤维酶原激活剂） ——治疗心脏、
二、动物基因工程前景广阔
1.用于提高动物生长速度
2.用于改善畜产品的品质 3.用转基因的动物生产药物
1、传统制药：直接从生物体 的组织、细胞或血液中提取
例：4~5克/100公斤猪、牛的胰腺
缺点：产量低、价格昂贵
2.“工程菌”制药
（1）什么叫“工程菌”？ 用基因工程的方法，使外源基因得
到高效表达的菌类细胞株系。（如： 含有人胰岛素基因的大肠杆菌菌株、 含有抗虫基因的土壤农杆菌菌株）
1973年,由美国科学家科恩等人用重组 DNA技术首次获得转基因大肠杆菌。从此 以后，基因工程作为一个新兴的研究领域
得到了迅速的发展: 农牧业
工业
环境保护 能源
医药卫生
一、植物基因工程硕果累累
转基因工程技术主要用于提高浓作物的抗逆能力,以及改 良农作物的品质和利用植物生产药物等方面.
基因工程在农业上的应用：
卵细胞或胚胎细胞（转基因动物） 回
步骤四：目的基因的检测与鉴定
氨苄青霉 素抗性基因
四环素 抗性基因
Leabharlann Baidu
四、目的基因的检测与鉴定
1、检测与鉴定的目的 目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持 和表达其遗传特性
2、 检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上
检测目的基因是否转录出了mRNA
检测目的基因是否翻译成蛋白质 另外：个体生物学水平的鉴定
质粒作为 载体的条件:
能在宿主细胞内复制并稳定 的遗传 具有多个限制酶切点
具有某些遗传标记基因（标记基因
基因工程的基本操作程序主要包括 四个基本步骤：
1）目的基因的获取 2）基因表达载体的构建 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测与鉴定
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过程
优点
缺点
供体细胞DNA →DNA
工作量大，