Westernblot问题及解决办法

问题

可能原因

验证或解决办法

转膜不充分

膜没有完全均匀湿透

使用100% methanol（甲醇）浸透膜。

靶蛋白分子量小于10,000

选择小孔径的膜，缩短转移时间。

靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值

可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5）或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液。

甲醇浓度过高

过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。

转移时间不够Thick gel

对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。

背景高

膜没有完全均匀湿透

使用100% methanol（甲醇）浸透膜。

洗膜不充分

增加洗液体积和洗涤次数。

阻断不充分

增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。

二抗浓度过高

降低二抗浓度。

检测过程中膜干燥

保证充分的反应液，避免出现干膜现象。

曝光过度

缩短曝光时间。

抗体与阻断蛋白有交叉反应

检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。

没有阳性条带

抗体染色不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间。

酶失活

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。

试剂不匹配

一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照物可以验证二级检测系统的有效性。

一抗失效

选择在有效期内的抗体；并选择现配现用的工作液。

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

有阳性条带，但条带比较弱

抗体染色不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间。

酶活性降低

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

标本中靶蛋白含量太低

增加标本上样量。

洗膜过度

缩短洗涤时间。

HRP抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

抗体活性降低

选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。

蛋白转移不充分

见上述。

封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。

曝光时间过短

延长曝光时间。

条带位置（大小）不对；或有非特异性条带

二抗的非特异结合

增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）。

一抗的特异性不够

使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性。

蛋白降解

使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂。

二聚体或多聚体存在

增加蛋白质变性过程及强度。

抗体浓度过高

降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带。

蛋白上样量过大

降低上样量。

背景有斑点

封闭剂中有聚集体

使用前过滤封闭试剂。

HRP耦联二抗中有聚集体

过滤二抗试剂，去除聚集体。

膜上出现反像（暗背景上白色带）

HRP含量过高

降低酶联二抗的浓度。

问题

可能原因

建议解决方法

推荐电压条件下电泳时间过长

电泳缓冲液过稀

配制新鲜缓冲液，使用1 X稀释液。

推荐电压条件下电流过高，热量过大

电泳缓冲液过稀

配制新鲜缓冲液，使用1 X稀释液。

推荐电压条件下电流过低或无电流

接触不良

在电泳前移除胶盒底部的封条；确认缓冲液没过加样孔；检查buffer core上导线连接。

蛋白带型条状

（streak）

上样过量

样品中盐浓度过高

降低蛋白上样量。

通过透析或凝胶过滤降低样品中盐浓度。

样品沉淀

加大样品中SDS的浓度。

样品中的污染，如脂类或DNA复合物

离心或过滤样品以除去特定污染。

制胶不佳

确保灌胶均匀，一次完成。

条带模糊

蛋白样品部分变性

完全变性蛋白。

蛋白样品部分还原

确保加入足量的DTT或β巯基乙醇。

电泳时间过长

观察前面的指示剂染料，掌握恰当的电泳时间。

哑铃形条带或“微笑”条带

上样体积过大导致不完全堆积

使用恰当的上样体积。如果样品过稀，使用超滤浓缩。

电泳过程中电场不均匀

如果蛋白浓度已知，上样时确保对称。

分离胶表面不平

在制胶时使分离胶表面水平。

凝胶过期

在指定的失效期前使用凝胶。