牛睾丸支持细胞分离、纯化及体外生长行为的研究

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《2024年牛精原干细胞分离纯化及长期培养研究》范文

《牛精原干细胞分离纯化及长期培养研究》篇一一、引言随着干细胞研究领域的发展，特别是精原干细胞的深入探讨，牛精原干细胞因其在畜牧业、医药研发等领域具有广泛的应用潜力而受到重视。

精原干细胞具备自我更新能力和多向分化潜能，可被用于研究雄性生殖系统的发育机制，并有望在再生医学中发挥重要作用。

本文将就牛精原干细胞的分离纯化及长期培养进行详细的研究与探讨。

二、材料与方法1. 材料本实验所使用的牛精原干细胞取自健康成年公牛的睾丸组织。

实验过程中使用的试剂和耗材均需符合无菌、无热原等要求。

2. 方法（1）干细胞分离纯化：采用酶消化法对睾丸组织进行消化处理，获取单细胞悬液，通过密度梯度离心法及流式细胞仪等方法进行干细胞的分离纯化。

（2）长期培养：将纯化后的干细胞接种于特定培养基中，进行长期培养，观察其生长情况及分化能力。

三、实验结果1. 干细胞分离纯化通过酶消化法处理睾丸组织，获取的单细胞悬液中包含多种细胞类型。

经过密度梯度离心及流式细胞仪的分离纯化，成功获得较高纯度的牛精原干细胞。

2. 长期培养将纯化后的牛精原干细胞接种于特定培养基中，通过显微镜观察，干细胞在培养基中呈现良好的生长状态，具有较高的增殖能力。

经过一定时间的培养，干细胞仍保持其多向分化的潜能。

四、讨论本实验研究了牛精原干细胞的分离纯化及长期培养，实验结果表明，通过酶消化法、密度梯度离心及流式细胞仪等方法，可成功获取较高纯度的牛精原干细胞。

在特定培养基中，干细胞呈现良好的生长状态，具有较高的增殖能力及多向分化潜能。

这为进一步研究牛精原干细胞的生物学特性、功能及其在再生医学中的应用提供了有力支持。

在实验过程中，我们还需要注意以下几点：首先，实验所使用的试剂和耗材需符合无菌、无热原等要求，以确保实验结果的准确性；其次，流式细胞仪等仪器的操作需严格按照规范进行，以确保干细胞的分离纯化效果；最后，在长期培养过程中，需定期观察干细胞的生长状态及分化能力，以评估其生物学特性和应用潜力。

试论牛卵母细胞体外受精技术

试论牛卵母细胞体外受精技术牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下，人为创造母牛体内繁殖条件，在牛体外完成精卵结合，培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段，将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。

体外受精是繁育犊牛的重要技术，在牛繁殖领域应用普遍，涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断，牛精子的筛选、获能，以及具体的受精操作等。

针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究，最终达到获取高质量胚胎的目的，助力于养牛业的高质量发展。

1 牛卵母细胞体外采集与培养技术1.1 牛卵母细胞体外采集技术1.1.1 采集方式常用的动物卵母细胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母细胞，采用超排技术从动物的输卵管采集，但不适用于牛这种大型动物；（2）活体采卵，选择繁殖性能优秀的母牛，借助腹腔镜直接采集，对采集母牛的繁殖性能影响较小；（3）从屠宰场获取，宰杀母牛后直接采集牛卵巢。

该采集方式简单、直接、成本低，可大批量采集。

1.1.2 采集技术在从屠宰场获取牛卵巢后，将其放入保温瓶中，瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素，温度大约是30 ℃，用于保持牛卵巢的新鲜度。

在1 h 内完成卵泡的收集，在实验室环境下，使用生理盐水清洗干净牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，获取卵泡液，准备进行体外成熟培养。

1.2 体外成熟培养使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养，将筛选出的卵母细胞放入培养液中，培养液中含有17-E2 的中央记忆型T 细胞1.5 μg/mL；胎牛血清10%，促黄体生成素20%；卵泡刺激素20 μg/mL。

将培养液放入经过温度校正后的培养箱中，温度调整至38～39 ℃，气象条件为5%的CO2，培养时间22～24 h，需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况，适当延长1～2 h，但不可超过26 h，一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。

1.3 体外成熟判定在培养24 h 后进行牛卵母细胞的成熟检查，当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。

性别控制技术的研究与应用进展

性别控制技术的研究与应用进展蔡健锋1，潘淳烨1，黎文聪1，陈慧芳1，张献伟2，白银山1*（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231；2.温氏食品集团股份有限公司，广东新兴 527439）摘要：性别控制指通过人为干预使动物的繁育按照人们所希望的性别繁殖后代的技术。

随着畜牧业生产智能化的迅速发展，高效准确的性别调控技术成为提高畜禽生产经济效益的重要研究方向。

本文主要综述了性别分化调控、性别反转和X、Y精子分离技术，以期促进畜牧业养殖性别控制技术的发展和应用。

关键词：性别控制；性别分化；性别反转；X、Y精子分离中图分类号：S814 文献标识码：A DOI编号：10.19556/j.0258-7033.20200512-09性别控制是使动物按照人们所希望的性别繁殖后代的技术[1-2]。

随着畜牧业智能化的发展，人类对特定性别的畜禽需求显著增大，因此性别控制技术在畜禽繁殖中有重要的研究价值。

根据X、Y精子DNA含量的差异，运用流式细胞技术可以有效分离X、Y精子[3-5]。

在奶牛繁育中，运用流式细胞仪分选X、Y精子进行性别控制，获得的母犊率超过90%，且成活率、体重等与自然交配后代无显著差异，极大地提高了经济效益[6]。

研究显示，通过调控X、Y精子活力的分离方法以及根据X、Y精子蛋白特异性表达通过免疫学技术分离X、Y精子的方法，都能获得较好效果[7-8]。

这些技术是在配子水平上进行性别控制，不影响基因表达和生殖发育，但目前研究并不完善。

性别差异使畜禽肉品质存在显著不同，根据性别分化规律人为干预性别分化基因的表达，可实现畜禽性别反转，促进肉品质改善，这将成为畜禽生产中有应用前景的技术[9-10]。

通过基因编辑技术使性连锁基因缺失也能改变后代性别的比例[11-12]，表明通过改变基因表达获得特定性别后代的可行性。

本文综述了性别决定基因调控分子机制，探讨了性别反转技术机制及应用前景，汇总了最新的X、Y精子分离技术的方法并分析其优缺点，以促进性别控制技术的应用和推广。

牛精原干细胞研究进展

牛精原干细胞研究进展王春伟;扶晓波;吕妍;赵军;郭秋萍;张卫艺;胡建宏【摘要】精原干细胞(SSCs)是雄性生殖系干细胞,位于睾丸曲细精管基底膜上,具有自我更新和定向分化的潜能,是自然状态下出生后动物体内在整个生命过程中进行自我更新并能将基因传递至子代的惟一成体干细胞.本文在阐述精原干细胞发生的基础上,通过分析犊牛精原干细胞分离纯化、培养鉴定、冷冻保存和诱导分化的现状,分析了牛精原干细胞研究领域目前存在的主要问题,展望了牛精原干细胞的应用前景,以期为精原干细胞的研究提供参考.【期刊名称】《家畜生态学报》【年(卷),期】2013(034)010【总页数】4页(P6-9)【关键词】牛;精原干细胞;研究进展;存在问题;发展前景【作者】王春伟;扶晓波;吕妍;赵军;郭秋萍;张卫艺;胡建宏【作者单位】西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S811.6精子发生是雄性动物终身产生大量精子的一个过程，其特点是由二倍体生殖细胞(精原干细胞)的单向分化，通过减数分裂形成精母细胞，最后产生单倍体配子精子[1]。

精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)是哺乳动物出生后唯一能进行自我更新并将遗传信息传递给后代的具有像胚胎干细胞一样增殖和分化潜能的干细胞[2]。

精原干细胞的建立，不仅提供了一种新的工具来分析精子发生或干细胞的自我更新，同时也开辟了干细胞实际应用的新领域。

本文通过分析牛精原干细胞分离纯化、培养鉴定、冷冻保存和诱导分化的研究现状，指出目前存在的主要问题，并展望其应用前景，以期为精原干细胞的研究提供借鉴。

睾丸支持细胞结构、功能及研究进展

维普资讯
４０
ｊｕｎｌｏｉｌＳｉｎｅａｄＶｅｅｉａｙＭｅｉｉｅｏｒａｆＡｎｍａｃｃｎｔｒｒｄｃｎｅｎ
Ｖｏ．７１２
Ｎｏ１．
２００８
睾丸支持细胞结构、能及研究进展功
ＧＵＯｉ，ＡＮＧｎｚｕ，ｈｎ —ｈＲＥＮｉｑａｇＪｅＦＮａ－ｈ ¨ ＬＩＺｏｇｓｕ，Ｌ — ｉｎ。
（．ｐｒｍｅｔｆＡｎｍａｃｎｅＡｇｉｕｔｒｌｏｌｇｆＹｎｉｎＵｉｅｓｙｏｇｉｉｎ１３０，ｈｎ｝１Ｄｅａｔｎｏｉｌｉｃ，ｒｃｌａＣｌｅｏａｂａｎｖｒｉ，ＬｎＪｎＪｌ３４０ＣｉａＳｅｕｅｔｉ２ＣｌｇｆｆｏｃｅｃｆｓａｇａｉｅｉｎｖｒｉＳａｇａ０００Ｃｉａ．ｏｉｅｏｄｓｉｅｏｎｈｉｓｒｅｕｉｅｓｔｈｎｈｉ０９，ｈｎ）ｅｏｎｈｆｈｓｙ，２ＡｂｔａｔＴｈｒａｅｇｒｃｌｎｅｔｌｃｌｘｓｎｔｅｓｍｉｉｒｕｐｔｅｉｍｆｓｍｉｉｒｕｕｕｅｉｅｔｌ．Ｔｈｓｒｃ：ｅｅｈｖｅｍｅｌａｄｓｒｏｉｅｌｅｉｔｉｈｅｎｆｏｓｅｉｈｌｓｓｅｕｏｅｎｆｏｓｔｂｌｎｔｓｉｅｅｃｅｔｐｆＳｒｏｉｅｌｓｉｒｇｌｒｙ，ｎｃｅｓｉｌｎｅｎｓ，ｎｅｅｌｓｉｌｒｅｓｒａｅａｅｓｅｏｍｏｓＳｒｏｉｃｌｕｒｕｄｙｅｏｅｔｌｃｌｉｒｅｕａｉｓｔｕｌｕｓｓｅｄｒｅｓｕｌｏｕｓａｇ，ｕｆｃｒａｉｎｒｕ．ｅｔｌｅｌｓｒｏｎｓｇｒｃｌ，ｓｒｏｉｅｌｓｒｎｆｒｔｅｅｖｓｔｕｔｉｅｍｅｌｄｒｎｅｍｅｌｄｖｌｐｎｎｖｍｅｔＳｒｏｉｅｍｅｌｓｅｔｌｃｌｍｕｔｔａｓｏｍｈｍｓｌｅＯｓｓａｎｇｒｃｌｕｉｇｇｒｃｌｅｅｏｍｅｔａｄｍｏｅｎ．ｅｔｌｓｓｃｌｓｃｅｅｍａｙｆｃｏｓｏｎｙｓｐｌｅｍｅｌｂｔｃｎｐｏｉｅａｎｉｏｍｅｔｗｉｍｍｕｅｐｉｉｇｏｅｍｅｌ．Ｒｅｅｌｅｒｔｎａｔｒ，ｎｔｏｌｕｐｙｇｒｃｌｕａｒｖｄｎｅｖｒｎｎｔｉｓｈｎｒｖｌｅｆｒｇｒｃｌｅｓ — ｅｎｌｅｔｙ，ｓｉｎｉｔｅｒｅｏｎｗｌｄｅｂｕｔｕｔｒｎｕｃｉｎｆｓｒｏｉｅｌ．Ｎｏｗｅｒｖｅｄｃｒｅｔｐｏｒｓｃｅｔｓｓｌａｎｄｓｍｅｋｏｅｇｓａｏｔｓｒｃｕｅａｄｆｎｔｓｏｅｔｌｃｌｏｓｗｅｉｗｅｕｒｎｒｇｅｓｉｎｔｅｆｎｔｎｎｐｌａｉｎｏｅｔｌｃｌ．ｈｕｃｉｓａｄａｐｉｔｆｓｒｏｉｅｌｏｃｏｓＫｅｒｓＳｒｏｉｅｌｙｗｏｄ：ｅｔｌｃｌ；ｍｏｐｏｓａｄｃｎｔｕｔｎｕｃｉｎ；ｐｏｒｓｆｉｖｓｉａｅｒｈｕｎｏｓｒｃｉｌｆｎｔｏｏｒｇｅｓｏｎｅｔｔｇ

SD大鼠睾丸支持细胞的分离、培养、纯化及鉴定

ｃｌｅｒａｅｆｅ６ｈＴｅｌｇｒｍｉｒｗｈｄｒｔｎｏｅｌｓｆｕｄｔｎｅｓｄｃｓｄａｔｒ９．ｈｏａｉｅｈｔｃｇｏｔｕａｉｆｃｌｗａｏｎｏｂ — ａｓａｏｎｎｖｔｇｏｕａｉｏｔｏ
ｔｎｕｉｇｔｒｅｅｚｍｅｄｄｆｒｎｉｔｄａｃｏｎｔ０．ｈｈａｔｃｕｅｏｅｏｅａｄｎｉｅｓｎｉｓｅｎｙｓａｉｅｅｔｅｈｒｇｍｅｌｄＴｅｕｒｓｒｔｒｆｓａｈｃｌｗｓｉｅｔｄｕｉｇＨＥ．ｌｏｎｈｎａｎｉｌｕｉｆＯｉ
ｔｌｓｕｔｈｕｖｖａｅａｏｅ９％．ｅｃｌｂｇｎｔｎｈｒａｔｒ５ｈｕｓ／／ｏｃｌｒ．ｎｈｒｗｈｒｔｆｉｅｔｓｅｗｉｔｅｓｒｉａｒｔｂｖ０Ｔｅｌｅａａｃｏｆｏｒｎｖｔｕｔｅａｄｔｅｇｏｔａｅｏｃｉｈｌｈｏｅｒｕ
构与支持细胞的形态特征一致。可见，采用三酶两步消化法和差异贴壁法，可达到分离、培养、纯化Ｓ大鼠支持细胞的Ｄ
目的。
关键词：睾丸；支持细胞；体外培养；鉴定；Ｄ鼠Ｓ大
中图分类号：８２１Ｑ５．— ３１￥５．；９４６３＋文献标识码：Ａ文章编号：０２８６（００Ｏ — ２９０１０ — １１２１）３０５ — ４
（ＣｒｇｆｎｍｌｃｅｃｎｅｈｏｏｙＧａｇｉｎｖｒｔ，ａｎｎ３０５Ｃｉ；ｉｅＢｏｃｎｌ１ｏｅｅｉａＳｉｅａｄＴｃｎｌ，ｕｎｘＵｉｓｙＮｎｉ５００，ｈｎ２ＷｅｉｉｅｈｏｇｔｏＡｎｇｅｉｇａｍｔｏｙ

黄芩苷和黄芩素的生物学功能及其在动物生产中的应用

黄芩苷和黄芩素的生物学功能及其在动物生产中的应用代重山;汤树生;张青杰;李道稳;肖希龙【摘要】黄芩苷及黄芩素是中草药黄芩发挥功效的主要活性成分。

本文归纳总结了黄芩苷及黄芩素的抗氧化、抗炎、抗微生物及免疫调节等生物学功能，以期为其更好地应用于动物生产提供一定理论依据。

%Baicalin and baicalein are major effective flavones in the root of Scutellaria baicalensis Georgi.This article summarized the biological functions of baicalin and baicalein,including the anti-oxidation,anti-inflammatory,anti-micro-bial activity and immunomodulatory to take reference for its further applications in animal production.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2015(000)008【总页数】5页(P11-14,18)【关键词】黄芩苷;黄芩素;生物学功能;动物生产【作者】代重山;汤树生;张青杰;李道稳;肖希龙【作者单位】中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193;中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193;中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193;中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193;中国农业大学动物医学院，北京海淀 100193【正文语种】中文【中图分类】S816.7黄芩属唇形科黄芩属多年生草本植物，黄芩苷和黄芩素是其主要活性成分。

研究表明，黄芩苷口服不易吸收，需在肠道经酶水解为黄芩素后方可吸收入血，黄芩素进入动物体内后，在血液中迅速转化为黄芩苷及其他代谢物，二者往往同时存在、相互转化，并具有多种生物学功能（辛文妤等，2013）。

睾丸细胞的生物学特征及研究进展

睾丸细胞的生物学特征及研究进展周文钧摘要：睾丸形态与功能的维持主要依靠生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞发挥作用。

生精细胞、支持细胞功能的正常是精子发生的基础，管周肌样细胞的收缩促使精子排出至睾丸网，间质细胞是睾酮的主要来源。

目前，睾丸细胞研究主要集中在细胞体外培养、细胞基因组学、细胞应用三大领域。

本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。

关键词：生精细胞；支持细胞；管周肌样细胞；间质细胞；生物学；应用睾丸由生精小管和间质构成，1～4条生精小管（seminiferous tubule）高度盘曲于睾丸小叶中。

管壁上皮为特殊的生精上皮，是精子发生的场所，主要由支持细胞（Sertoli cell）、生精细胞（spermatogenic cell）组成。

小管上皮基膜外有胶原纤维和管周肌样细胞（peritubularmyoid，PTM）。

睾丸间质是含有大量的血管及淋巴管的疏松结缔组织，其中含有大量的间质细胞（Leydig cell），其主要功能为合成和分泌雄激素。

本次研究将分别探讨生精细胞、支持细胞、管周肌样细胞、间质细胞的的生物学特征及其研究进展。

1 睾丸细胞生物学特点1.1生精细胞精子发生既是一个复杂的生物形态与遗传变化过程，又是一个复杂、特异的细胞分化过程，是生命周期循环的重要环节之一，其中生精细胞生物学变化起到关键作用。

人的精子发生需要（64±4.5）d，需要经过精原细胞增殖分化、精母细胞减速分裂、形成精子三个阶段。

精原细胞位于生精小管基底室，基膜与之相接触。

其分化起始于胚胎时期的原始生殖细胞，分化形成生殖母细胞并逐渐迁移至生精上皮基膜，经过细胞分裂分化成为以精原干细胞（SSCs）为主的精原细胞，SSCs可自我更新，又能定向分化成精母细胞。

大鼠的精原细胞可分为A型、中间型、B型精原细胞，Huckins提出将大鼠的精原细胞分为三部分，即贮备型精原干细胞（As），更新或增值型精原细胞（Apr-Aal）和分化型精原细胞（A1～A4-In-B）[1]，前两者也可以称之为未分化型精原细胞。

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摘要了解牛睾丸支持细胞体外培养的生物学特性，试验采用组合酶消化和选择贴壁法，将５月龄、６月龄牛胎儿及新生牛睾丸支持细胞分离纯化后进行体外培养。试验结果显示，这一阶段牛睾丸适宜支持细胞分离纯化用；采用０．２５％胰蛋白酶＋０．０２％ＥＤＴＡ二次消化法是一种经济有效的牛胎儿睾丸支持细胞分离方案；试验发现，牛胎儿睾丸支持细胞体外研究时间应控制在３～２０天内，处于对数生长期的牛胎儿睾丸支持细胞，对牛体外受精卵体外发育有明显的促进作用。关键词牛睾丸支持细胞体外培养生长行为中图分类号Ｑ９５４．４
激素结合蛋白（ａｎｄｒｏｇｅｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＢＰ）、苗勒氏管抑制物质（ｍｕｌｌｅｒｉａｎｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ＭＩＳ）、抑制素（ｉｎｈｉｂｉｎ）、激活素（ａｃｔｉｖｉｎ）、转化生长因子 β （ＴＧＦ）、胰岛素样生长因子１（ＩＧＦ１）、白介素１和６ β
）表１酶消化法分离牛胎儿睾丸支持细胞的结果ａ
件，牛睾丸支持细胞贴壁效果优于３７ ℃，但差异不显著Ｐ＞０．０５）。试验结果见表３。（
表３温度对原代支持细胞贴壁效果的研究
５（细胞数： × １０）（Ｍｅａｎ± ＳＤ）
Ｔａｂｌｅ３Ｅｆｆｅｃｔｉｏｎｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｏａｔｔａｃｈｉｎｇ
５ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｒｉｍａｒｙＳＣｓ（ｃｅｌｌｓ：× １０）
对比因素３７ ℃ ３８．５ ℃
接种密度１０１０
贴壁细胞数３．８３± ０．８５５．１５± ０．６６
贴壁率％
ａ３８．２９± ８．５４ａ５１．５３± ６．５７
９８
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｏｌ．２７Ｎｏ．５２００７
２．２酶消化法对支持细胞分离效果比较试验中对比了ＩＶ胶原酶（Ａ组）与胰蛋白酶＋ＥＤＴＡ（Ｂ组）对牛胎儿睾丸支持细胞的分离效果。结果显示，Ａ组细胞总数与细胞存活率均极显著高于Ｂ组（Ｐ＜０．０１），分离效果较好，见表１；但其细胞贴壁率Ｐ＞０．０５），见表２。略低于Ｂ组（
Ａ：５月龄牛胎儿睾丸织织ＨＥ染色（６００× ）；Ｂ：６月龄牛胎儿睾丸组织ＨＥ染色（６００× ）；Ｃ：新生牛睾丸组织ＨＥ染色（４００× ）
Ｆｉｇ．１ＢｏｖｉｎｅｔｅｓｔｉｓｔｉｓｓｕｅｓｔａｉｎｅｄｂｙＨＥ
（细胞数： × １０）（Ｍｅａｎ± ＳＤ）Ｔａｂｌｅ１ＩｓｏｌａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂｏｖｉｎｅｆｅｔａｌＳＣｓｂｙ
６
中，分别置于３７ ℃ 和３８．５ ℃、５％ＣＯ、饱和湿度条件下２培养，定时观察细胞贴壁情况，当见到细胞开始贴壁时（体外培养约５ｈ后）小心倾斜培养皿，将尚未贴壁的生殖细胞随培养液一起吸去，用ＰＢＳＡ冲洗后，重新加入培养液继续培养，即可获得贴壁牛胎儿睾丸支持细胞。试验自接种起，每隔２４ｈ各取３个孔，用血球计数板分别计数贴壁支持细胞数目，取平均值，连续进行７天。１．２．６支持细胞单层的制备选择接种７２ｈ后牛胎ＢＳＡ冲洗３儿睾丸支持细胞单层，吸除培养液并用Ｐ次，加入１ｍｌ０．２５％胰蛋白酶＋０．０２％ＥＤＴＡ消化至６０％细胞脱落，加入等量ＤＭＥＭ＋１０％心５ｍｉｎ，弃上清。加入牛胚胎培养液调整
睾丸支持细胞（ｓｅｒｔｏｌｉｃｅｌｌ，ＳＣ）及结构是Ｅｎｒｉｃａｌ在１８６５年首次描述的，因其在结构上为生精细胞分化提供支持，为生精过程提供能量及营养，因此称为生精细胞的“ 保姆细胞” 。在复杂动态生精过程中，支持细胞扮演重要角色，不但在向生精上皮传递促性腺激素过程中发挥中枢作用，控制生精细胞的有丝分裂、减数分裂及后续分化一系列动态过程，而且具有支持、营养、吞噬、释放、分泌等多种功能；同时，支持细胞之间形成的紧密连结构成血睾屏障，除阻止外来抗原进入睾丸，引发免疫应答外，还可防止自身抗原（生精细胞）与机
收稿日期：２００７０１２３修回日期：２００７０３０８２００１３１１０２）新疆维吾尔自治区科技攻关项目（电子信箱：ｃｈｅｎｊｉｎｇｂｏ１２６＠１２６．ｃｏｍ通讯作者， — —兰州军区乌鲁木齐总医院实验科现工作单位—
保证了精子发生正常有序地进行。近年来，随着对支持细胞研究的深入，其强大的内分泌调节功能引起越来越多的关注。研究表明支持细胞天然、稳定和高表
２］达ＦａｓＬ，是产生免疫耐受的功能细胞［，并能分泌雄
１材料与方法
１．１材料１．１．１材料来源４个５月龄牛胎儿睾丸、２个６月龄牛胎儿睾丸，采自乌鲁木齐天鹰屠宰场，月龄判断标准１个新生牛睾丸，由新参照秦鹏春《哺乳动物胚胎学》；疆乌鲁木齐种牛场一分厂提供。１．１．２试剂及器械Ｌ谷氨酸盐（Ｓｉｇｍａ）、谷胱甘肽（Ｓｉｇｍａ）、卡那霉素（Ｓｉｇｍａ）、胶原酶ＩＶ（ＣＬＳ，Ｓｉｇｍａ），胰蛋白酶（Ｓｉｇｍａ），新生牛血清（ＮＢＳ，Ｇｉｂｃｏ），ＤＭＥＭ培养基（Ｇｉｂｃｏ），瑞氏姬姆萨染色液（珠海贝索生物），其他化学试剂均为国产分析纯，实验用金属及玻璃器皿用前均清洗干净并高压灭菌处理。
２００７，２７（５）
１．２方法
赵云程等：牛睾丸支持细胞分离、纯化及体外生长行为的研究
９７
× １００％加入新培养１．２．５生长曲线测定取适量细胞悬液，
５液调整细胞密度为８× １０个／ｍｌ，接种于两块２４孔板
１．２．１取材与曲细精管离散取牛睾丸，一侧除去鞘膜及白膜，切取成约０．５～１．０ｃｍ的小块，立即置入多聚甲醛固定液中，按常规步骤制作石蜡切片，ＨＥ染色。另一侧或两侧连同阴囊置冰块中保存，２ｈ内带回实验５％的乙醇中浸泡室，剥离阴囊及鞘膜后，将睾丸置于７２ｍｉｎ，然后用加有双抗的无钙镁磷酸缓冲液（ＰＢＳ）冲洗３遍，在睾丸白膜上做Ｔ字形切口，取出睾丸实质组织，用添加双抗的ＰＢＳ漂洗３次，洗去血污后置平皿中。１．２．２支持细胞的酶解分离组织块离散后剪碎，采用两步酶消化法分离睾丸细胞。第一步消化时，Ａ组ｍｇ／ｍｌ胶原酶ＩＶ，Ｂ组（右侧睾丸）以（左侧睾丸）以１０．２５％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ室温下振荡消化１５ｍｉｎ，加入ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ终止消化，５００ｒ／ｍｉｎ离ｍｉｎ弃上清。第二步消化均以０．２５％胰蛋白酶和心５０．０２％ＥＤＴＡ室温下消化１５ｍｉｎ，加入ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ终止消化，１００目滤网过滤，１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清。Ａ、Ｂ两组各取等体积睾丸细胞悬液，进行存活率测定，团块、碎片数测定，及贴壁率测定。１．２．３细胞计数取细胞悬液与０．５％台盼蓝１ ∶ １混匀后，在倒置显微镜下，用血球计数板计数圆形透明的活细胞数及染成蓝色的死细胞数，计算总数、存活率、细胞碎片及团块数。１．２．４细胞贴壁率取适量细胞悬液，加入新鲜培养１０个／ｍｌ接种，定时观察细胞液调整细胞密度为１× ｈ贴壁情况，当见到细胞开始贴壁时（体外培养约５后）小心倾斜培养皿，将尚未贴壁的生殖细胞随培养液一起吸去，用ＰＢＳＡ冲洗，加０．２５％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ消化已贴壁细胞５ｍｉｎ，加入等体积ＤＭＥＭ＋１０％ＮＣＳ终止消化，取细胞悬液计数后，代入以下公式计算贴壁率：细胞贴壁率（％）＝（贴壁细胞数／接种细胞总数）
４细胞密度为１～２．０× １０个／ｍｌ，接种于２４孔培养板，
５ｈ后即可获得传代牛胎儿睾丸支持细胞单层。１．２．７牛胎儿睾丸支持细胞与胚胎共培养制备的牛胎儿睾丸支持细胞单层，使用前用胚胎培养液吹洗３次，以去除混杂于支持细胞间尚未贴壁的生殖细胞。加入５００ｌ胚胎培养液，移入受精卵，进行共培养，每隔４８ｈ μ 换液。观察受精卵发育情况及支持细胞生长情况。１．２．８数据处理与统计分析试验数据用ＳＰＳＳ１３．０处理，统计分析结果。
中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（５）：９６～１００