人工合成靶序列快速构建多靶标RNAi表达载体
RNAi的实验设计及使用步骤
RNAi的实验设计及使⽤步骤RNAi的实验设计及使⽤步骤RNA ⼲扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的⼴泛存在于⽣物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之⼀的，dsRNA 特异性的核酸酶Dicer 将dsRNA 裂解成由21-25 个核苷酸组成的⼩⼲扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA 作为介导⼦引起特异性地降解相同序列的mRNA，从⽽阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
siRNA 设计A.哺乳动物siRNA 设计基因抑制的有效性很⼤程度取决于⽬的基因序列的选择。
⽬的序列可以随机选择也可以通过在⽬的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。
哺乳动物siRNA设计需要注意的⼏个⽅⾯1．从转录本（mRNA）的AUG 起始密码开始，寻找“AA”⼆连序列，并记下其3'端的19 个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。
正义链和反义链都采⽤这19 个碱基(不包括AA 重复)来设计。
2．避免在起始密码⼦或⽆义区域附近选择⽬的序列。
3．siRNA 序列的GC 含量应为30%-60%左右。
4．在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的⾮编码区（untranslatedregions，UTRs），原因是这些地⽅有丰富的调控蛋⽩结合区域，⽽这些UTR 结合蛋⽩或者翻译起始复合物可能会影响siRNA 核酸内切酶复合物结合mRNA 从⽽影响siRNA 的效果。
5．将挑选的序列在公共数据库中进⾏⽐较以确保⽬的序列与其它基因没有同源性。
将潜在的序列和相应的基因组数据库（⼈，或者⼩⿏，⼤⿏等等）进⾏⽐较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使⽤BLAST （/doc/e0a96be6591b6bd97f192279168884868662b862.html /BLAST/）。
细胞外基质金属蛋白酶诱导因子RNAi慢病毒载体的构建
定 了实 验 基 础 。
合成 的
应用基 因工程技
术成功构建 了可供感染 的 Ｅ Ｐ Ｉ 因 Ｒ Ａ 慢病 毒载体 ， ＭＭ Ｒ Ｎ基 Ｎ ｉ 此为进一步研究 Ｅ Ｐ Ｉ ＭＭ Ｒ Ｎ在急性 白血病 中的作用奠 关键词 ： 细胞外基质金属蛋 白酶诱 导因子 ； Ｎ Ｒ Ａ干扰 ； 慢病毒载体 中图分类号 ： ７ ３ ７ Ｒ ３ ． 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２２ ６ （ ０ １ ３ － １－３ １０ —６ Ｘ ２ １ ） ３０ ６０ ０
８ ０℃冻存 。
将 ２３ ９ Ｔ细 胞 接 种 于 ９ ６
１ ２ ５ 慢病 毒滴 度 测 定 ． ．
Ｇ Ａ Ｇ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ ｒ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ Ｉ 经 退 火 形 成 Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ＂ 。
孔板中， 每孔 ４×１ 个 细胞 ， 积 为 １０ ｌ ０ 体 ０ 。将 病 毒 上清 １ 倍 比稀 释 ， 去 ９ ０倍 吸 ６孔 板 中 培 养 基 ９ Ｏ １加入 稀 释好 的病 毒 ９ １ ， ０ 。放入 培养 箱 培养 。２ ４ ｈ后 加入 完全 培 养 基 １０ ｌ ０ 。４ｄ后 在荧 光 倒 置 显 微镜 下检 测发 绿 色荧光 的细 胞 数 ， 得 到 的数 值 除 将 以相应 的病 毒稀 释倍 数 就 得 到 了病 毒 原 液 的 滴 度
3个水稻RNAi载体的构建与应用
3个水稻RNAi载体的构建与应用柯建浩;廖耀平;王骆艺;穆虹【摘要】利用RNAi(RNA interference)干扰技术,构建了启动子和干涉区域不同的3种水稻干涉载体,通过农杆菌介导转化水稻粳稻品种中花11.表型和分子分析表明,3种载体都能有效降解靶基因OsUGP2,暗示pRNAi-ubi-UGP2载体能同时沉默OsUGP2家族基因,pRNAi-ubi-UGP2PRO载体能特异沉默OsUGP2,pRNAi-IP-UGP2载体对OsUGP2基因的沉默不具特异性,但其沉默具有人为可调控性.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)009【总页数】4页(P1-3,封2)【关键词】水稻;RNAi;载体构建;OsUGP2【作者】柯建浩;廖耀平;王骆艺;穆虹【作者单位】广东省农科院水稻研究所,广东广州510640;华南农业大学生命科学学院,广东广州510640;广东省农科院水稻研究所,广东广州510640;广东省农科院水稻研究所,广东广州510640;华南农业大学生命科学学院,广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】S511;Q785水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球一半以上的人口以稻米为主食。
水稻是我国最重要的粮食作物，总面积、总产量及单位面积产量均居全国粮食作物首位。
同时，水稻也是单子叶植物研究的模式植物，其基因组在禾谷类作物中是最小的，约由4.3亿个碱基对组成[1-2]。
目前，水稻全基因组测序已基本完成，对其基因进行功能分析已成为世界研究热点。
对基因功能进行分析可采取正向遗传学和反向遗传学两种策略[3-4]。
其中，RNAi 作为反向遗传学策略的一种方法，已成为揭示水稻基因功能的一件重要利器。
植物中常用的 RNAi技术包括转录后基因沉默技术（posttranscriptional gene silencing，PTGS）和转录基因沉默技术（transcriptional gene silencing，TGS）[5]。
分子生物学RNA干扰(RNAi)
Craig Mello A professor of Molecular Medicine University of Massachusetts Medical School
In 1998: Fire & Mello in Nature 证实在RNAi 中，真正起作用的是dsRNA
表达与C. elegant worm unc-22基因同源的dsRNA的 细菌喂食线虫，则线虫表现出类似unc-22缺失的表型
•Dicer protein :
Kenneth Kemphues Professor of Genetics
Su Guo Cornell graduate student
Two-cell
Four-cell for distribution of Two-cell to visualize germline-specific mitotic spindles granules.
( The discovery of RNA-mediated interference )
In 1990: Dr. Jorgensen 共抑制现象(cosuppression)
Richard Jorgensen, PhD. Univ. of Arizona RNAi Innovator Awardee
Negative control
Endogenous mex-3 RNA
Injected with mex-3 antisense RNA
Injected with dsRNA corresponding to mex-3
Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA
神经病靶标酯酶
神经病靶标酯酶
李明;伍一军;冷欣夫
【期刊名称】《生命的化学》
【年(卷),期】2001(21)3
【总页数】4页(P189-192)
【关键词】神经病靶标酯酶;分子克隆;迟发性多神经病;蛋白质家族;神经发育
【作者】李明;伍一军;冷欣夫
【作者单位】中国科学院动物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R741.02
【相关文献】
1.人神经病靶标酯酶RNAi表达载体的构建及其对哺乳动物细胞中NTE表达的抑制 [J], 常平安;陈瑞;李薇;伍一军
2.脑苷肌肽对有机磷中毒性迟发性神经病变大鼠学习记忆能力及血浆钙激活的中性蛋白酶、神经疾病靶标酯酶影响研究 [J], 王宁;张艳盛;王梦梦
3.神经病靶标酯酶相关性运动神经元疾病 [J], 常新荣;龙鼎新;常平安;
4.神经病靶标酯酶相关性运动神经元疾病 [J], 常新荣;龙鼎新;常平安
5.反向重复序列法构建神经病靶标酯酶RNA干涉表达质粒 [J], 常平安;伍一军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大豆类受体蛋白激酶基因(rlpk2)RNAi双元表达载体的构建及其转基因
大豆类受体蛋白激酶基因(rlpk2)RNAi双元表达载体的构建及其转基因李小平;邓楠;马媛媛;李鹏丽;王勇;张韧;王宁宁【期刊名称】《分子细胞生物学报（英文版）》【年(卷),期】2006(039)001【摘要】植物类受体蛋白激酶(plant receptor-like kinases RLKs)以其特有的结构在植物的生长、发育和防御等多种生理生化过程中发挥着重要的作用.利用RNA 干扰技术(RNA interference RNAi)来研究RLKs的功能已日趋成熟.本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理,以大豆类受体蛋白激酶基因rlpk2为靶基因,在rlpk2-cDNA序列3'端选择312bp作为构建RNAi的序列,借助中间克隆载体,经过三次亚克隆,最后形成含rlpk2-RNAi表达盒的双元表达载体pART27-R2,并转入农杆菌LBA4404.采用农杆菌介导大豆子叶节转化方法,共获得了三株转基因植株.转基因植株RT-PCR分析表明rlpk2基因已被成功敲减(knock-down),并且发现敲减大豆叶片中的rlpk2基因表达明显改善大豆叶片的光合能力,结合前期研究结果,表明rlpk2基因可能在维持叶绿体的结构及保护叶绿体膜系统的完整性方面起负调节作用.【总页数】8页(P1-8)【作者】李小平;邓楠;马媛媛;李鹏丽;王勇;张韧;王宁宁【作者单位】南开大学,植物生物学及生态学系,天津,300071;南开大学,植物生物学及生态学系,天津,300071;南开大学,植物生物学及生态学系,天津,300071;南开大学,植物生物学及生态学系,天津,300071;南开大学,植物生物学及生态学系,天津,300071;Department of Biological Sciences,University of Wollongong,NSW2522,Australia;南开大学,植物生物学及生态学系,天津,300071【正文语种】中文【中图分类】Q2因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
HIF-1α基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定【摘要】目的构建HIF-1α基因RNA干扰慢病毒载体。
方法选定HIF-1α基因RNAi靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoⅠ和HpaⅠ双酶切后的慢病毒载体pLentilox3.7(pLL3.7)连接,产生pLL3.7 HIF-1α慢病毒载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽取质粒后,用限制性内切酶XbaⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定,将阳性克隆送金斯特公司进行测序鉴定;用PHR、pVSVG和pLL3.7慢病毒载体共转染包装细胞293T细胞(磷酸钙转染法),包装产生慢病毒, 将收集的病毒上清经高速离心浓缩后,按一定比例稀释,然后感染293T细胞,用流式细胞仪检测293T细胞GFP蛋白的表达水平,从而测定病毒滴度。
结果酶切和测序证实,构建出HIF-1αshRNA的慢病毒载体pLL3.7 HIF-1α;包装慢病毒,测得离心的浓缩病毒悬液的滴度为2×108 TU/ml。
结论成功构建HIF-1α基因RNAi慢病毒载体。
【Abstract】Objective To construct a lentiviral vector of RNA interfered(RNAi)HIF-1αgene. Methods To confirm the targeting sequence of HIF-1α gene that can be effectively silenced by RNA inference. The cDNA containing both sense and antisense Oligo DNA fragments of the targeting sequence was designed, and cloned into the pLentilox3.7(pLL3.7) vector which was digested by XhoI and HpaI. The obtained lentiviral基金项目:厦门市卫生局资助项目(项目编号:3502Z20077055);厦门市科技局资助项目(项目编号:3502Z20089001)vector containing HIF-1α shRNA was confirmed by digestion and sequencing. Using lentiviral vector PHR、pVSVG and pLL3.7 HIF-1α to cotransfect 293T cells, then the collected lentivirus. The titer of virus was tested according to the expression level of GFP. Results Digestion and DNA sequencing demonstrated that the constructed lentivirus vector pLL3.7 HIF-1α which can produce HIF-1α shRNA. The titer of concentrated virus was 2×108 TU/ml. Conclusion The lentivirus RNAi vector targeting HIF-1α is constructed successfully.【Key words】HIF-1α;RNAi;Lentivirus缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是目前所发现的正常细胞以及肿瘤细胞适应缺氧的最关键的转录因子[1],其基因的功能研究具有非常重要的意义。
RNAi技术原理与表达载体的构建
RNAi表达载体构建近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA.RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程.现在越来越多的研究人员开始采用RNAi 来研究生物体的基因表达.RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病治疗等等。
目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：1.化学合成2.体外转录3.长片断dsRNAs经RNase III 类降解(e.g. Dicer, E. coli, RNase III)4.siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs5.PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步,而转染的效率则是非常关键的因素。
一、基本概念1.RNAi：（RNA interference）RNA干扰内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的能诱导细胞内与其序列同源的特异基因表达沉默或抑制的效应,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰,它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制.2.siRNA ：(small interfering RNAs)小干扰RNA由长dsRNA裂解而成的一种19-25nt的短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的RNA为靶目标降解特定的mRNA, RNAi的关键效应分子.3.shRNAs:(small hairpin RNA )小发夹RNA是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,shRNA需通过载体导入细胞后,然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用.4.Dicer：属于RNaseⅢ家族,是dsRNA的特异性核酸内切酶5.RISC：(RNA-inducing silencing complex) RNA诱导的沉默复合体,具有核酸内切、外切以及解旋酶活性二、机制目前普遍认为,共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制,都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达. 即RNAi、共抑制、quelling均属于PTGS！现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步.1.第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）.2.第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC).siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RISC）。
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人工合成靶序列快速构建多靶标RNAi表达载体张秀春;吴坤鑫;赵平娟;刘志昕【摘要】番木瓜环斑病毒(PRSV)正引起番木瓜毁灭性严重病害,番木瓜叶扭曲花叶病毒(PLDMV)也在威胁着目前转基因番木瓜的推广和应用.通过人工合成包含PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列作为模板,扩增两条长短不同但大部分重叠的靶序列,并通过引物设计时添加的特定酶切位点两个靶序列反向连接,形成以长靶序列的5’一部分序列作为发夹结构的环,不需要另外插入内含子序列的反向重复发夹结构的RNAi表达载体pPTN-LS.该方法构建的RNAi表达载体,不仅具有快速、稳定性高等优点,还能同时靶标PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列,能有效提高沉默效率,为利用RNAi技术培育广谱、高效、稳定且安全性高,同时抗PRSV和PLDMV病毒病的转基因番木瓜新种质的奠定基础.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2016(043)007【总页数】6页(P81-86)【关键词】人工合成靶序列;番木瓜环斑病毒;番木瓜叶扭曲花叶病毒;RNAi表达载体【作者】张秀春;吴坤鑫;赵平娟;刘志昕【作者单位】中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室,海南海口571101【正文语种】中文【中图分类】S667.9张秀春，吴坤鑫，赵平娟，等. 人工合成靶序列快速构建多靶标RNAi表达载体［J］.广东农业科学，2016，43（7）：81-86.番木瓜（Carica papaya L.）主要分布于热带和亚热带地区，是人们喜爱的果蔬兼药用的热带水果，在我国南方有“万寿果”和“岭南佳果”的美誉。
番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）严重影响着番木瓜产业的健康发展［1］。
随着基因工程抗病分子育种的发展，国内外研究人员先后将PRSV外壳蛋白、复制酶等基因导入番木瓜获得不同的抗PRSV的转基因株系［2-4］。
由于转基因番木瓜对病毒的抗性有株系专化性，但研究结果发现由于各地区PRSV病毒株存在差异，导致一个地区的转基因植物在另一个地区种植表现出的抗病能力减弱，甚至抗性丧失，因而限制了抗PRSV转基因番木瓜的推广和应用。
此外，番木瓜畸形花叶病毒病（Papaya leaf-distortion mosaic virus，PLDMV）是另一种严重危害番木瓜的病原，最早出现在日本，给当地的番木瓜种植业造成很大的损失［5］，20世纪90年代在巴西、台湾等地也有发现［6-7］。
抗PRSV转基因番木瓜品种不具备对PLDMV的抗性，虽然2001年对我国华南地区番木瓜PLDMV发病情况的调查表明尚未发现有相关病例，但2013年杨勇等［8］、张雨良等［9］相继报道在海南发现该病毒，对番木瓜生产构成潜在威胁。
因此，培育稳定、高抗、谱抗且安全性好的新品种对我国番木瓜产业发展具有重要意义。
RNA沉默是利用siRNA指导同源RNA降解或抑制其翻译或修饰同源DNA抑制其转录。
由于不需要产生新的蛋白，因此应用RNA沉默技术在育种中具有高效、特异和安全等特点。
另外，由于反向重复序列片段小，有利于构建含多个病毒基因的嵌合基因，获得同时抗多种病毒的转基因植株。
RNA沉默技术的应用，为我们提供了一条更为有效、安全的抗病毒新策略。
目前利用RNA沉默技术已成功获得高抗、稳定且安全性高的抗病毒转基因大豆、马铃薯、番木瓜等作物［10-11］。
本研究通过比对GenBank中危害番木瓜的两种主要病毒PRSV和PLDMV的多条基因组全长序列，人工合成包含PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列。
以人工合成靶序列为模板，设计扩增长短不同但大部分重叠的两对引物，最后通过引物设计时添加的特定酶切位点使长短不同的两个靶序列反向连接，形成以长靶序列的5’一部分序列作为发夹结构的环，不需要另外插入内含子序列的反向重复发夹结构的RNAi表达载体。
该方法构建RNAi表达载体，不仅具有快速、稳定性高等优点，而且较短的序列就能包含更多的保守序列，具有反向重复发夹结构RNAi载体产生dsRNA的效率更高，并且非反向重复部分的序列也是病毒来源的保守序列，在转基因植物中也能产生dsRNA，因此能有效地提高RNAi载体的抗病毒效率。
本研究构建的RNAi表达载体同时靶标PRSV和PLDMV两种病毒的NIb和Hc-Pro基因多个保守区域的靶序列，能有效提高沉默效率，为利用RNAi技术培育广谱、高效、稳定且安全性高、同时抗PRSV 和PLDMV病毒病的转基因番木瓜新种质奠定基础。
1.1 试验材料菌株与质粒：大肠杆菌Escherichia coli DH5α 菌株、克隆载体pRTL-SalI和植物表达载体pPTN200 均由本实验室保存。
酶与试剂：各种限制性内切酶购自Ferments公司，PCR Mix购自TaKaRa公司，克隆载体pMD18、pMD19及质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司。
1.2 试验方法1.2.1 合成序列设计搜索GenBank中PRSV和PLDMV两种病毒的基因组序列，用DNAMAN软件分别进行序列比对后选取PRSV 和PLDMV的Nib和Hc-Pro基因的多个保守区域，总长为621 bp（图 1）。
靶序列由TaKaRa 公司合成。
1.2.2 靶序列克隆根据上述人工合成的靶序列设计两对引物（表1），分别扩增长短不同但大部分序列重叠的两个靶序列，在合成靶序列中的位置如图1所示，引物由TaKaRa 公司合成。
以上述合成靶序列为模板，用LF/LR和SF/SR为引物，进行PCR扩增，获得大小分别为598 bp和530 bp的靶序列L和S。
PCR扩增体系：5 ng/μL合成靶序列1 μL，10 X Pfu Buffer，d NTP Mix 4 μL（2.5 μmol/L），上游和下游引物各1μL，Pfu 0.5 μL，补ddH2O至总体积50 μL。
扩增条件：98℃，30 s；98℃，8 s，65℃，10 s，72℃，30 s，35个循环；72℃，10 min。
PCR产物L和R分别与克隆载体pMD19和 pMD18连接，具体操作方法参照QIAGEN公司连接试剂盒说明书。
连接产物分别转化大肠杆菌Ecoil DH5α，提取质粒，获得pMD19-L和pMD18-S重组子。
用LF/SR为引物进行菌PCR检测，反应体系30 μL，PCR扩增条件：94℃，3 min；94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min，35个循环；72℃，10 min。
PCR检测阳性的pMD19-L重组子进一步用EcoRⅠ/KpnⅠ双酶切和测序鉴定。
PCR检测阳性的pMD18-S重组子用EcoR Ⅰ/NcoⅠ进行双酶切鉴定，由于pMD18-T载体5’端有EcoRⅠ位点而靶序列S正向引物已添加NcoⅠ位点，如果靶序列S是反向插入，则pMD18-S重组子中EcoRⅠ和NcoⅠ分别位于靶序列两侧，EcoRⅠ/NcoⅠ双酶切能切下约500 bp的目的片段；而如果靶序列S是正向插入，则pMD18-S重组子中EcoRⅠ和NcoⅠ位于靶序列同一侧，EcoRⅠ/NcoⅠ双酶切只能将载体线性化。
选取靶序列S为反向插入的pMD18-S重组子进行测序鉴定。
1.2.3 RNAi克隆载体pMD18-LS构建选择靶序列S为反向插入的克隆pMD18-S，并利用pMD18载体上5’端自带的EcoRⅠ和KpnⅠ将pMD18-S质粒DNA线性化。
将EcoRⅠ/KpnⅠ酶切pMD19-L质粒DNA，回收靶序列L并与线性化的pMD18-S连接，使靶序列L定向插入pMD18-S构建成靶序列L和S反向连接的RNAi克隆载体pMD18-LS，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
重组质粒用EcoRⅠ/NcoⅠ进行双酶切鉴定。
1.2.4 RNAi中间表达载体构建 pMD18-LS质粒DNA经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切，切出约1 100 bp靶序列LS，回收目的片段并与EcoRⅠ/SalⅠ双酶切线性化后的中间表达载体pRTL-SalⅠ连接，转化大肠杆菌DH5α，构建RNAi中间表达载体pRTL-LS。
重组质粒用PstⅠ单酶切鉴定。
1.2.5 RNAi表达载体构建PstⅠ单酶切pRTLLS质粒DNA，切出约1 600 bp的片段，回收目的片段，将其插入同样经PstⅠ单酶切的表达载体pPTN200，构建RNAi表达载体pPTN-LS。
转化大肠杆菌DH5α，用LF和SR为引物进行PCR检测后再用PstⅠ单酶切鉴定。
2.1 靶序列设计、合成搜索GenBank中PRSV和PLDMV两种病毒的基因组序列，用DNAMAN软件分别进行序列比后选定两种病毒的Nib和Hc-Pro基因多个共同保守区域，具体序列见表2。
然后按PRSVNib1、PRSV-Nib2、PLDMV-Nib1、PLDMVNib2、PRSV-Hc-Pro、PLDMV-Hc-Pro顺序排列，人工合成总长为621 bp的靶序列。
2.2 靶序列克隆以人工合成靶序列为模板，分别以LF、LR 和SF、SR为引物，用高保真Taq酶进行PCR扩增，得到与靶序列L和S预期大小的目的条带，分别为598、530 bp （图2）；靶序列L和S分别与克隆载体pMD19和pMD18连接后，用LF和SR为引物进行菌落PCR检测，均获得预期大小约为500 bp的目的片段（图3），说明靶序列L和S克隆成功。
由于靶序列L的扩增引物中分别含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点，重组质粒pMD19-L进一步用EcoRⅠ/KpnⅠ酶切，切下一条大约600 bp预期大小的目的条带（图4），证明pMD19-L克隆成功，测序后通过DNAMAN比对证明目的片段为合成靶序列的部分序列。
由图4可知，3、4号pMD18-S重组子切下一条大约500 bp预期大小的目的片段，说明靶序列S为反向插入；而5、6号pMD18-S重组子只是线性化，说明靶序列S为正向插入。
取靶序列S为反向插入的pMD18-S重组子进行测序，通过DNAMAN比对证明目的片段为合成靶序列的部分序列，并且插入方向为反向。
2.3 RNAi克隆载体pMD18-LS酶切鉴定由于靶序列L和S是反向连接的，并且引物设计时靶序列L的上游引物已添加EcoRⅠ位点，而在靶序列S上游引物添加NcoⅠ位点，因此，用EcoRⅠ /NcoⅠ酶切pMD18-LS重组子，应切下包含靶序列S和L、大小约1 100 bp的片段。