花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展

花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展果树的基因转化研究早在1988年，首先在核桃上取得突破，McGranahan等获得了转gus基因核桃再生植株。

此后，果树转基因工程研究日益发展，许多果树获得了转基因植株，但是与农作物的转基因工程研究相比，果树转基因工程还是远远处于落后状态。

最难转化的禾谷类，现在也已经有多种作物进入转基因的商业化生产阶段，而果树仅有一例转基因植物进入田间试验（方宏筠等，1999）。

我国在樱桃、草莓、苹果等果树转基因方面做了许多研究工作，并都获得了转化目的基因的转基因植株，特别是樱桃的转抗菌肽基因已由农业部批准进入田间实验，该项研究处于国际领先水平。

1988年第一株转基因核桃(Juglans regia L.)在美国诞生为利用基因工程改变果树特定性状、培育果树新品种奠定了实践基础。

相对于农作物而言，果树转基因技术及研发相对滞后转化体系仍有待进一步完善，但果树基因工程也有其突出的优势。

目前，我国已在荔枝、番木瓜、苹果、柑橘、梨、桃、香蕉、猕猴桃、葡萄、樱桃、草莓的果树上展开了遗传转化技术的研究，转化方法主要包括农杆菌介导法和基因枪轰击的方式，获得了部分转基因植株。

在果树等林木育种中，花粉管通道法的相关研究少有报道，仅见钟启宏等采用花粉管通道导入方法，将欧洲黑杨的一个克隆片段导入泡桐，最终获得了3株可含50μg/mL的Kan培养基上生长的幼苗。

侯立群（2000）等利用花粉管通道发进行核桃转基因研究，只是获得了畸形果植株，但尚未完成分子鉴定等。

山东农业大学张玲（2004）利用花粉管通道法对杏转化抗寒基因相关研究。

由于果树，栽培环境复杂、生产周期长，且主要为风媒传粉植物，与作物相比，在影响树种自身遗传多样性等方面，其潜在的生态风险性可能更大。

随着果树转基因成功事例逐年增加，转基因果树的生态安全性问题也越发受到重视。

由于花粉管通道法进行转化的供体可以是植物总DNA，即利用自然界现有的具目的性状的外源DNA或基因进行遗传转化，其实质相当于远缘杂交。

因此，利用植物总DNA的花粉管通道法进行果树遗传转化，可不必担心由其它转化系统获得的转基因植物的生态风险性等问题。

目前，在转基因中所应用的农杆菌介导、基因枪等方法，主要通过建立组织培养体系实现基因导入，转基因受遗传转化体系限制较大，甚至一个无性系就需要建立一套转化体系，很难实现多基因型受体的遗传转化与筛选。

花粉管通道导入法可以克服其它转化方法对组织培养的依赖，以及因组织培养限制而产生的转化基因型单一等问题，直接形成大量的种子，并且由于导入的是全组DNA，本身带有多种基因，故获得的变异后代群体遗传多样性丰富，选择余地大。

随着有关研究的深入以及技术的日益完善，花粉管通道法也必将在果树育种领域发挥更大的作用。

1.3花粉管通道法转基因技术1.3.1花粉管通道法研究进展早在1974年，我国科学家周光宇（1978）首次提出了植物远缘杂交所产生的染色体水平的杂交现象—DNA片段整合理论。

近年来更多的出现用构建在质粒载体上的目的基因直接转化受体，已经在部分作物上取得成功。

Luo等(1988)首次报道用花粉管通道法将质粒DNA转入水稻，经Southern杂交和酶学测定证明，得到了外源基因整合并表达的转基因水稻植株，使花粉管通道法的转化工作像其他直接转化法一样，完全按转基因技术的操作进行。

谢道昕等(1991)先后将抗虫基因(BT)导入棉花和水稻，用分子生物学和酶学方法鉴定，都得到了转基因植株。

曾君祉等(1993)和Chong等(1995)报道了用花粉管通道法转化小麦，经过筛选、Southern blotting、Northern blotting鉴定以及对表达产物的检测，获得了小麦的转基因植株。

牟红梅等(1999)利用花粉管通道法将抗虫基因、选择标记基因导入小麦中，抗性筛选、PCR和Souther杂交表明外源基因已导入。

侯文胜等(2003)用花粉管通道法将外源基因导入小麦，并用Westhern杂交检测到了目的蛋白的表达。

陈家全等（2004）利用花粉管通道法成功的把棉花腺苷酸核糖基化作用因子1（arf1）转化到棉花中，并通过检测获得阳性后代。

奚亚军等(2004)利用花粉管通道法将叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT导入普通小麦品种西农1376,经PCR、GUS组织化学染色、点杂交和Southern杂交分析,证明带有特异启动子的目的基因已整合到5个植株的基因组中,且在大部分转基因植株中能够稳定遗传。

王才林等（2006）将慈姑蛋白酶抑制剂（API）基因导入到水稻中获得转基因植株。

花粉管通道法已在多种作物中获得成功，并取得了大量的分子证据的支持，确定了其在植物遗传转化中的地位。

1.3.2花粉管通道技术的不同导入方法1.3.2.1柱头滴加导入法该法是使用最多的一种方法，即将供体总DNA片段，在受体自花受粉后适当的时期滴加在柱头上，使能沿着花粉管通道进入胚囊，实际应用时一般先切除柱头。

这样可缩短通道距离，提高转化效率。

黄骏麒等(1986)首次利用此法，成功地将外源海岛棉DNA导入陆地棉，培育出抗枯萎病的栽培品种，随后倪建福等(1994)、王亚馥等(1995)成功的将此法用于小麦的转化，将高粱DNA导入普通小麦，选育出抗条锈病白粒新品系。

1.3.2.2子房注射法在受体植株自花受粉后一段时间内，用毛细针插入子房下部胚囊附近，借助微量注射器注入DNA溶液，一般适合子房较大的农作物如棉花，红麻等。

孔青等(1993)，尹钧等(2004)在小麦上也有应用。

比较子房注射法与柱头滴加法结果显示，子房注射法的结实率低于柱头滴加法，主要是由于注射对子房有损伤造成的；在变异率方面，子房注射法较柱头滴加法有更高的变异率。

1.3.2.3花粉粒携带法Hess等(1980)首先报道了用外源DNA处理矮牵牛花，在后代获得了花色变异。

Ohta(1984)将外源DNA与玉米花粉混合授粉得到供体胚乳基因的表达。

张孔湉(1982-1986)设计的花粉匀浆涂抹法与之类似，都是通过花粉携带外源DNA进入受体生殖细胞，外源DNA浸泡花粉，受体花粉与供体DNA混合授粉等都是根据上述原理设计的，该技术已经在小麦、玉米、高粱、花生和番茄上得到应用。

刘根齐等(1994)用供体DNA（或花粉）均匀处理该受体植物柱头，处理毕，待5min 后授以受体植株正常花粉，以使其供体外源遗传物质随花粉管的生长而导入受精卵的方法选育出在新疆大面积推广的75(918)改良新品系，在保持原有一优良性状的基础上子粒由红粒改良为白粒，提高了小麦的商品性能。

1.3.3 花粉管通道法的影响因素花粉管通道法转基因技术的成株转化率一般为10-1-10-2（王关林、方宏筠，2002）.相对而言,转化率较低,其影响因素为多方面：（1）导入时间选择：从转化的受体为精卵融合期的合子细胞出发,并考虑外源DNA沿花粉管外界面渗入过程也需时间,建议以精卵融合至合子分裂前这个时间段进行外源DNA导入为宜。

（2）环境温度、湿度与花粉的萌发和花粉管的生长度有密切关系：25～30℃是花粉管最适生长温度；环境的湿度也会对花粉的萌发与花粉管的生长有重要影响。

（3）花粉管的路径长,变化复杂：花粉管在组织中的走向往往曲曲折折,增加了花粉管的长度,而在中空的花柱道和子房腔内生长时,又处在粘液的环境中,这不但不利于外源DNA沿花粉管外界面的移动,反而一部分外源DNA被花粉管及其贴附物所吸收。

（4）外源DNA的片段大小、浓度和pH值等：花粉管通道法对导入的DNA片段大小、纯度和浓度要求很高。

周光宇等认为,片段的大小以不小于106～107道尔顿为宜。

供体DNA片段的纯度对导入后代的表型变异也有一定的影响。

（5）不同的导入方法和导入部位也会对转化率产生影响。

上述诸多因素均与转化效率直接或间接相关，因此花粉管通道法转基因技术所表现的转化率较低也就不难理解,如果对上述因素在具体的技术操作时加以重视,进行必要的改进,就可以显著提高遗传转化率。

3 木本植物遗传转化的方法3.1 农杆菌介导的遗传转化的机理和方法现已发现两种与植物基因转化有关的类型：一为根癌农杆菌，它含有Ti质粒，能诱导被侵染的植物细胞形成冠瘿瘤；二为发根农杆菌，它含有Ri质粒，能诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。

根癌农杆菌染色体外的Ti质粒，包括T-DNA区、毒区（Vir区）、接合转移编码区（Con区）、复制起始区（Ori区）等几个区域。

其中，T-DNA用于与外源基因整合，可以被转移到植物的细胞中。

这个过程中T-复合体的染色质定位、包裹蛋白的酶解、染色质的重塑、T-DNA互补链的合成、DNA的修复等都需要宿主因子的参与（邹智，卢长明，2008）。

而Vir区本身不整合进植物的基因组，但它能协助T-DNA的转移，Vir区位于T-DNA区的左侧，包括7或8个操纵子（VirA、VirG、VirC、VirD、VirE、VirB、VirF、VirH）。

当植物受伤后，受伤组织释放的酚类化合物能成为农杆菌的侵染信号，这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜，活化VirA和VirG基因，再诱导Vir区的其它基因。

农杆菌介导法具有技术简单成熟，耗资少，可靠性高，转化率相对较高可以转移大片段外源基因（>30kb），没有明显的基因重排现象，外源基因主要以单拷贝插入植物基因组等优点（Simmondsd H，Donaldson P A，2000）。

目前是进行遗传转化的主要方法。

1985年，Horsch等发明了植物的叶盘转化法，操作方法是用打孔器从消毒叶片上取得叶圆片，亦称之叶盘（Horsch R B，Fry J E，Hoffmannnl，1985）。

2006年，李小平等（2006）转化大豆子叶节将受体蛋白激酶基因（rlpk2）RNAi转入大豆获得转基因植株。

党尉等利用根癌农杆菌对来自大豆成熟种子的体胚进行遗传转化，将双价抗虫基因cryIA（c）和pta整合到大豆的基因组中，获得了7个大豆品系的转基因植株，转化频率为4.29%～18%（党尉，卫志明，2007）。

农杆菌介导法与基因枪法相比，具有很多优点，如外源DNA结构完整、整合位点稳定、拷贝数低、转化片段较大以及整合后外源基因变异较少等，而且操作简单、成本低，易于掌握。

3.2 基因枪法（gene gun-mediated transformation）基因枪法又称微弹轰击法（microprojectile bombardment，particle bombardment，or biolistics）。

这种技术是以高压气体或高压放电为动力，用微粒对植物组织进行轰击，从而将外源基因带入植物细胞内，其优点在于它不受基因型和轰击靶组织的限制。

王萍等用基因枪法将双价抗虫基因Bt和CpTI转入固体培养的大豆胚性细胞团，获得Gus的高效率的表达（王萍，王罡，季静等，2002）。