细菌内毒素检查相关问题
影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法
影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法华W西C药J学'杂P志S2加2,I7(11/:79～}}0n^J,l,l:一影响细菌内毒素检查结果可靠性的因素及克服方法王明清四川省广元市人民医院.四川广元628000摘要:目的探讨影响细菌内毒素检查法的因素及克服方法:方法查阅文献,结合实践和实验进行阐述.结果标准品,灵敏度,器具处理后的放置时间及操作环境,条件等均对内毒素检查结果有影响.结论克服以上因素可使内毒素检查法结果更加准确,可靠.关键词:细菌内毒素;影响因素;克服方法中圈分类号:R927.12文献标识码:B文章编号:1006—0103c2oo21ol一0079—02 细菌内毒素检查法仍被2000年版中国药典继续收载,并比1995年版规定更细,要求更高.我们在实际工作中发现,当具体执行时,仍存在不少值得研究和探讨的问题-,这些问题均可影响细菌内毒素检查法结果的可靠性.1细菌内毒素工作标准品对鲎试剂灵敏度的影响细菌内毒素标准品有两种,一种为细菌内毒素国家标准品,用于标定生产厂家生产的细菌内毒素及仲裁鲎试剂的灵敏度;另一种为厂家生产的细菌内毒素工作标准品,用于标定鲎试剂的灵敏度及试验中的阳性对照.可见内毒素工作标准品的质量,直接影响鲎试剂的灵敏度.1.1实验材料和方法鲎试剂(厦门,灵敏度标示值0.5EU?ml～,每支0.1ml,批号:951220);细菌内毒素工作标准品(每支10EU,批号:950101)及超纯水.鲎试剂(福州,灵敏度标示值0.5EU?rrd～,每支01rrd,批号: 960114);细菌内毒素工作标准品(每支5EL",批号: 950913)及超纯水.其它材料按药典实验要求进行灵敏度复核用各地生产的内毒素工作标准品对其鲎试剂的灵敏度进行复核,均符合标示值.当以厦门产细菌内毒素工作标准品复核福州产鲎试剂灵敏度时,其灵敏度有所提高;当以福州产细菌内毒素复核厦门鲎试剂灵敏度时,则灵敏度有所降低,复核时.仍存在差异.蔡红等报道.也证实这一点.这种现象的发生,是鲎试剂的质量问题,还是内毒素工作标准品的质量问题,因无国家标准品仲裁,故无法定论,但作者简介:王明清.男.副主任药师,从事医院药学工作应引起重视.在实际工作中,则建议使用某厂生产的鲎试剂,就用该厂供给的内毒素工作标准品或国家标准品来标定鲎试剂灵敏度,标示值与实测值符合规定,则可用于细菌内毒素的检测,使结果正确可靠.最好避免此厂产内毒素标准品复核彼厂产鲎试剂的灵敏度或用于样品内毒素的检测1.2鲎试剂灵敏度的选择厦复核正确选择灵敏度是保证鲎法检测内毒素结果可靠性的依据.热原大多数是微生物的内毒素,其检查方法仅为限量检查.而药品因其剂型,用量不同而热原限量亦不同,如果选用的鲎试剂灵敏度低于药品内毒素限量,则出现假阴性,若高于药品内毒素限量的灵敏度,则出现假阳性,均达不到检测热原以保证药品质量的目的.所以必须确定药品的细菌内毒素限值.根据确定的药品细菌内毒素限值而选择鲎试剂的灵敏度.鲎试剂是一种生物制品,使用前必须对购回的鲎试剂按中国药典2000年版规定对其灵敏度进行复核,当复核结果符合规定时方可用于细菌内毒素检查.试验前应按药典规定作"供试品干扰试验",否则其结果可疑.2供试品调pH值在细菌内毒素检查法中,对供试品DH的调试各国药典要求不同,美国药典和英国药典均规定pH6～8,而中国药典对此未作具体规定,高国政等则认为pH的调节很有必要.因大输液所含成分对鲎法无干扰,可以不调DH,同时鲎试剂本身具有一定的缓冲能力.但除大输液以外的品种,应进行多次调与不调pH的平行对比试验及多个试验室的复试方可定论80华西药学杂志第l7卷3器具的处理及放置时间试验所用器具必须无热原化处理,2000年版药典已明确规定.工作中曾出现过同一品种使用,经无热原化处理放置24h后的器具作热原试验,出现阳性结果;复核时,器具除热原后放置12h后用于细菌内毒素检查,结果阴性故器具除热原后放置12h应立即使用,最好不超过24h.4严格控制细菌内毒素检查法的操作环境,条件和时间在中国药典2000年版二部细菌内毒素检查中,未规定在37±1℃保温60±2min前的操作环境,操作时间和室内温度,笔者认为这是药典不够完善的地方.为此,作了如下实验.鲎试剂(福州0.5EU?ml～,每支0.1ml,批号: 960503);细菌内毒素工作标准品(每支10EU,批号: 960326)及细菌内毒素检查用水(批号:960109,每支2m1).实验过程中,室内温度分别为l5℃,23℃,28℃, 30℃,32℃.操作时间分别为10,20,30min.内毒素工作标准的浓度分别为1,0.5,0.25,0.125EU? ml.于37±l℃保温60±2min,观察发现,在室温28℃以上时,随着操作时间的延长,鲎试剂的灵敏度有所提高.工作中曾出现过因放置室温不同,实验时间不同而出现假阳性的结果;复试时,室温降低, 操作时间缩短则结果阴性;临床验证,无热原反应. 因此,整个细菌内毒素检查,从溶解,稀释,混合到放人水浴保温及结果判定的总时间控制在室温28℃及以上时,不超过80rain;室温在28℃及以下时,不超过90n即保温前操作时间为28℃及以上时20min;28℃以下时30min.参考文献I郭录平浅谈影响鲎试验的因素[J:中国药学杂志1996,319 (3):1872蔡红,王豫蓉.粱平鲎试剂灵敏度对细菌内毒素限量硷查的影响初探J]中国医院药学杂志.1998.I8(2】:853高国政,颤锦值影响鲥苗内毒素测定的实验研究[』:中国药学杂志,1998.33(3):162收藕日期:200012(上接第78页)1.2.3碱液中的硫酸沙丁胺醇片的含量测定精密量取"1.2.2"项下的续滤液3ml置250ml量瓶中,加0.01mol?L氢氧化钠液稀释至刻度,摇匀,照分光光度法在244/lilt波长处测定吸光度,以沙丁胺醇的吸收系数为506计算,并将测定的结果乘以1.2049,即得(表1).1.2.4碱液中的加样回收试验取1.2.3"项下已知含量的溶液,精密加人一定量的沙丁胺醇标准溶液,同法测定.平均加样回收率为99.4%,RSD=O.73%(=4).1.2.5HPLC测定硫酸沙丁胺醇片的含量取"1.2.2"项下的续滤液5置25量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,照文献..方法测定,按内标法以峰面积计算,并将测定的结果乘以1.2049,即得(表1.襄l硫酸沙丁胺醇片的含量测定结果{H=32讨论2.1从实验结果及表l可以看出,碱液法与HPLC法结果基本一致,而酸液法结果明显偏高.碱液法所用的浓度最低,酸液法次之,HPLC法所用的浓度最高.显然,改变溶液的酸碱性和检测波长,可提高其检测灵敏度.2.2采用紫外分光光度法测定硫酸沙丁胺醇片的含量,在碱液中较酸液中检测灵敏度提高7倍以上.文献[1]的测定方法改为高效液相色谱法,但操作较繁琐,灵敏度较低,且需使用对照品和内标物质此外,新版药典中硫酸沙丁胺醇注射液及硫酸沙丁胺醇胶囊的含量测定仍为灵敏度较低的吸收系数59的紫外分光光度法,均有待改进2.3试验表明,碱液法中样品宜先加水溶解过滤后再用氢氧化钠液碱化后测定,若直接将样品溶于氢氧化钠溶液中,过滤稀释后再测定,则结果偏高约5%,其原因有待进一步考证参考文献l中华人民共和国国家药典委员会中国药典【s]二部北京:化学工业出版杜,20oo.8712英国药典[s]上册199819213张晓橙喘乐宁气雾剂古量测定方法的改进J]药物分析杂志, 1992.I2(2):80收稿日期:2'001—02。
细菌内毒素检查法应用指导原则
细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则1. 引言在当前社会背景下，食品安全问题备受关注，并且细菌内毒素作为食品中的一种重要污染物质也越来越受到重视。
为了确保食品的安全性，细菌内毒素检查成为一项非常重要的工作。
本文将从深度和广度的角度来评估细菌内毒素检查法的应用指导原则，并根据该主题进行讨论。
2. 细菌内毒素检查法的概述细菌内毒素是由细菌产生的一种有毒物质，它们可以污染食品并对人体健康造成潜在威胁。
细菌内毒素检查法的应用非常重要。
该方法一般包括样品准备、提取和分析等步骤。
通过采用适当的检测技术和方法，可以准确可靠地检测细菌内毒素的存在和含量。
3. 细菌内毒素检查法的准备工作在进行细菌内毒素检查之前，必须进行一些准备工作。
需要确定检测的细菌种类和内毒素类型，以便选择适当的检测方法。
样品的收集和保存也是一项关键工作，应该注意避免污染或降解。
还需要准备相关的实验室设备、试剂和标准品等。
4. 细菌内毒素检查的主要技术方法目前，细菌内毒素检查主要采用生物学方法和化学方法两种主要技术。
生物学方法包括毒素制备、生物学活性试验和鉴定等步骤，通常用于细菌内毒素的初步筛查。
而化学方法则依靠物质的化学性质或光学性质来进行分析和检测，常用的方法包括高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法等。
5. 细菌内毒素检查的应用指导原则为了保证细菌内毒素检查的质量和准确性，应遵循以下应用指导原则：5.1 样品选择：应根据实际情况选择适当的样品进行检测，要注意样品的来源、存储和处理方式。
5.2 样品制备：样品必须按照规定的方法进行提取和制备，确保细菌内毒素的稳定性和提取效率。
5.3 适当的检测方法：应根据细菌种类和内毒素类型选择适当的检测方法，确保检测结果的准确性和可靠性。
5.4 外部质量控制：在进行细菌内毒素检查时，应严格遵循外部质量控制的要求，包括使用标准品进行校准和内毒素的稀释等。
5.5 结果解释和评估：在得到检测结果后，需要对结果进行解释和评估，确保对检测结果的理解和使用是正确的。
凝胶法检查细菌内毒素应注意的问题
凝胶法检查细菌内毒素应注意的问题为了确保凝胶法测定细菌内毒素的准确性，我们通过对凝胶法准确性干扰因素的分析(包括鲎试剂本身、操作条件、原料及其他)，指出了应用凝胶法测定细菌内毒素时应注意的问题。
最后认为只要克服了检查中的干扰因素，凝胶法是最简单、经济、应用最广泛检查细菌内毒素的方法。
此外此种方法对干扰不敏感，为《中国药典》的“仲裁”方法。
标签：凝胶法；热原；注意事项《中国药典》2005年版二部将细菌内毒素检查法分为凝胶法和光度测定法。
因凝胶法具有最简单、经济，应用最广泛，对干扰不敏感的优点，因此为《中国药典》的“仲裁”检查方法，而广泛用于注射剂药品细菌内毒素的检查。
凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。
中国药典1995年版已收载细菌内毒素检查法(简称鲎试验)，但只用于几种输液的检查。
根据现有的实验证明，凡不干扰细菌内毒素检查或虽有干扰，但可以克服的药品注射剂，将能够以凝胶法代替家兔热原检查法。
多年以来的实践证明，进行细菌内毒素检查前必须具备的条件是：①实验所用器具“无细菌内毒素”；②鲎试剂灵敏度的确证；③无干扰因素。
这3条也是检验细菌内毒素试验是否有效的重要标准。
用凝胶法做细菌内毒素的检查时应注意以下问题：1 鲎试剂本身1.1 鲎试剂灵敏度为了保证检查细菌内毒素结果的准确性，用于试验的鲎试剂应首先核对灵敏度。
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验对结果的改变时，需进行灵敏度复核试验。
因为在我们的实际工作中，发现鲎试剂均符合药典规定标准前提下，由于生产厂家不同，批号不同，部分鲎试剂的实测灵敏度与标示值有差异而导致检测同一检品时，用相同标示值的鲎试剂，出现不同结果。
因而先核对灵敏度可避免因鲎试剂本身造成的判断失误。
建议到省、市、县药检所购入鲎试剂。
1.2 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶质中浸提制成供试品溶液。
首先确定供试品的内毒素限值(EU/ml)，公式为L=K/M，L为供试品内毒素限值，然后计算出供试品最大有效稀释倍数（MVD）MVD=cL/λ，其中c为供试品溶液的浓度，λ为在凝胶法中鲎试剂灵敏度(EU/ml)。
细菌内毒素检查法常见问题与探讨
此文章来源：/s/blog_4fcb513e01000bgj.html细菌内毒素检查法常见问题与探讨摘要: 目的总结归纳细菌内毒素检查法中的常见问题，方法收集整理工作中发现的问题，查阅国内外有关文献资料，对照分析应用情况并比较其差异。
结果与结论：从五个方面较为全面的总结了细菌内毒素检查法所涉及到的问题，认为在应用方面还需要进一步完善、规范。
关键词：细菌内毒素检查法；问题Discussion of common issues in the BactarilEndutoxin Test, BETZHOU Su-Wen.（Pharmacology Laboratory, Hubei Institute of Drug Examination,Wuhan 430064）ABSTRACT: OBJECTIVE to summarize and conclude the common problems in the bacterial endotoxins test. METHODS by collecting the practical problems in work and referring to the related articals and information, we compared and analyzed their differences. RESULTSand CONCLUSION the problems concerning the bacterial andotoxins test were comprehensively generalized in the review from five aspects and the conclusion showed that the application of the bacterial endotoxins test need to be further enhanced and standardized.Key word: Bactaril Endutoxin Test；problems细菌内毒素检查法(BactarilEndutoxinTest,BET )是近二十年来发展起来的用于检测药品及其中间品中内毒素污染的一种方法；作为家兔热原检查法的一种替代，已经十分成熟，美国药典迄今已为八百余种药品制定了该项检查法，中国药典自1990年版开始收载以来，每版药典细菌内毒素检查品种也逐步增多，2005年版已增加到204种，并且在增补本中将继续增加收载数量，该方法相对家兔热原检查法而言，有劳动强度低、快捷、经济、灵敏和易于标准化等优点，受到广大药品质检人员高度关注。
细菌内毒素检查常见异常结果分析
BET常见异常结果分析湛江安度斯生物有限公司2016年7月实验助手APP授权发布1BET常见异常结果分析凝胶法灵敏度复核不符合规定阳性对照阴性供试品阳性对照阴性阴性对照阳性供试品一阳一阴21.阴性对照为阳性✓实验环境-有扬尘；✓实验操作不规范-人为污染；✓配套用品（移液管、反应管、吸头污染或没有完全除热原）✓试剂性能-鲎试剂或水出问题✓设备-恒温水浴，水滴进反应混合液中32.阳性对照为阴性✓标准内毒素溶液的制备是否准确；✓试剂性能（内毒素标准品、鲎试剂和检查用水的质量和是否匹配）；✓配套用品（移液管、稀释管、反应管、吸头是否有干扰）；✓操作是否规范；✓设备-恒温孵育的温度和时间是否合适；✓实验环境；43.供试品阳性对照为阴性阳性对照为阴性，供试品阳性对照为阴性—参考实验结果出现异常的分析2） 阳性对照为阳性，供试品阳性对照为阴性✓供试品阳性对照溶液配制是否正确；✓供试品有抑制干扰作用；✓配套用品（稀释管、反应管、移液用具是否有干扰）；✓其他54.阴性对照正常，供试品为阳性供试品内毒素含量不符合规定；污染✓配套用品（稀释管、反应管、刻度吸管、吸头）；✓试验操作、环境、试剂等假阳性-增强干扰作用•凝胶法中，没有对照项可以判断供试品是否存在增强作用。
64.阴性对照正常，供试品为阳性假阳性的判断凝胶法检测配套稀释液抗增液复溶鲎试剂特异性鲎试剂光度法检测分析内毒素含量反应动力学曲线分析75.同一供试品结果有时阳性，有时阴性样品✓供试品内毒素含量在1/2L左右；✓供试品存在干扰试剂-不同试剂，抗干扰能力不同试验条件（环境、人员操作技能、恒温孵育温度和时间）86.灵敏度复核不符合规定参照案例分析（二）鲎试剂灵敏度复核不符合规定原因调查。
9BET常见异常结果分析光度法标准曲线的线性不合格变异系数大内毒素回收率不合格阴性对照不合格不正确的预设Rt或OD值，导致的异常结果101.线性不足标准内毒素•某个标准内毒素浓度制备误差•标准品旋涡混合不充分•标准品储存不当或用具干扰试剂•污染•检测能力不足仪器设置•不正确的预设Rt/OD值不正确的反应时间•终点法112.阴性对照不合格配套用品激活（污染）鲎试剂✓塑料吸头和吸管可激活或污染鲎试剂 反应试管或孔没有完全除内毒素操作污染✓细菌内毒素检查用水✓鲎试剂✓反应试管或孔受污染试剂灵敏度不足或不合适的预设Rt/OD123.变异系数偏大气泡试剂质量加样误差试管/孔受污染移液管/吸头污染样品沉淀或悬浮内毒素添加的量不准确134.回收率问题标准内毒素溶液制备或加入不准确 试剂加入不准确样品✓内毒素浓度太高✓抑制作用✓增强作用✓工艺、原辅料的改变145.不正确的预设Rt或OD值，导致的异常结果预设Rt/OD值指光度变化值，是一个参考值，一般由鲎试剂生产厂家提供。
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响品成份及理化性质的影响 实验员的影响 环境的影响
1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
➢鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性； ➢鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。
3 实验器皿的影响
器皿的计量管理（校正） 器皿的选择标准 器皿的正确处理
1） 器皿的选择标准
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光 滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用 注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或 吸嘴。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内 毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离 子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。
谢 谢!
鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌内毒素国家标准品标定？ 标示值是否准确？
2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差 细菌内毒素标准品操作误差 细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素标准品的错误使用
1） 细菌内毒素标准品种类 ➢细菌内毒素国际标准品 ➢细菌内毒素国家标准品 ➢细菌内毒素工作标准品
应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿 必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有的客 户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿， 结果试验中所有的阳性对
照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较 大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造 成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤 不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂 酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准 确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作 规程，用多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。
2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。
细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因
PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、
标示值是否准确？
2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素标准品操作误差
细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素标准品的错误使用
1） 细菌内毒素标家标准品
细菌内毒素工作标准品
2） 细菌内毒素标准品效价误差
品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
2） 器皿的正确处理 2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页— —细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被 洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水
细菌内毒素检查结果准确性的
影响因素
一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响
实验器皿的的影响
样品成份及理化性质的影响
实验员的影响
环境的影响
1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性；
鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。 鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌内毒素国家标准品标定？
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读
3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。
4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。
5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。
❖ 方法学验证—供试品干扰预试验 目的：
确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
EU/ml EU/ml
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细菌内毒素检查相关问题细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题审评四部王彦厚摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
关键词：细菌内毒素检查、方法、验证细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。
经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。
但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。
在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。
以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。
此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。
可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。
尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。
因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。
研究人员在建立方法的早期，一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值，这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平，把限值订的相对比较严格，但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍，所以严格的限值，可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查，从而造成不必要的浪费；因此参按照法规允许的最高水平，酌情确定样品的限值。
样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关，剂量越大，单位重量或体积的内毒素限值越低。
一般按以下公式计算：内毒素限值L=K/M。
式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示；K为按规定的给药途径，人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/（kg.h），其中放射性药品注射剂K=2.5EU/（kg.h），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kg.h）。
一般我国人群平均体重按60kg计算，人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h；另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算，人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =（193EU/h）/ m2 。
M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量，以ml/（kg.h）、mg/（kg.h）或u/（kg.h）表示。
内毒素限值计算举例（一）：A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g，每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg，内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。
在细菌内毒素检查法中，细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示，所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法，可使实验操作计算更为方便。
假定产品A的浓度为100mg/ml（或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml）, 那么，将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时，内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。
内毒素限值计算举例（二）：B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2，规格为50mg/ml，内毒素限值L=（193 EU/ m2）/（1g/m2）=193 EU/g=0.193 EU/mg，转换为EU/ml 表示时，L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。
大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml，灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。
内毒素限值没有考虑到几个药物联合用药问题，但一般情况下，药品中内毒素的含量远低于限值，并且药品生产厂家的内控标准严于注册标准，所以药典内毒素限值也被称为最大允许内毒素浓度（Maximum allowable endotoxin concentration）。
2、样品最大有效稀释倍数或最小有效浓度的计算最大有效稀释倍数(MVD)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，对产品进行最大倍数的稀释，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许稀释的最大倍数。
MVD 的计算公式为：当被规定的内毒素的限值以体积表示时，MVD=内毒素限值L （EU/ml ）/鲎试剂灵敏度（λ）；当内毒素的限值以重量或药品的生物活性(EU/mg 或EU/u)表示时，MVD=内毒素限值L（EU/mg 或EU/u）×供试品溶液的浓度C/ 鲎试剂灵敏度(λ)。
在凝胶法中，λ=鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），在浊度法或显色法中, λ=所使用标准曲线上最低点的内毒素浓度（EU/ml）。
最小有效浓度（MVC）是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下，将产品稀释到一定浓度，仍能够进行内毒素限值的检测，此时所允许的最小浓度。
计算MVC的一般公式为：MVC=鲎试剂灵敏度（λ）/内毒素限值（L）。
对所选定的鲎试剂灵敏度来讲，MVC是一个绝对值；而MVD对特定的产品浓度是特异的，浓度变化时，MVD也会随之发生变化。
3、方法学验证试验的预试验确定了样品的内毒素限值，考察了样品的溶解性，并且选定了一定灵敏度的鲎试剂，此时便可以考虑进行预试验。
尽管法规中并不要求进行预试验，但在细菌内毒素检查法的建立过程中，一般需要进行预试验。
预试验的主要目的是确定不出现干扰的第一个样品稀释度，也就是不干扰浓度（non-interfering concentration, NIC），为后续的验证试验选择适当的样品稀释度（或浓度）。
不管采用凝胶法还是光度法，预试验都是对一系列样品的稀释液进行试验，在每一个稀释浓度，都有一组添加内毒素的样品和一组不添加内毒素的样品，添加内毒素的浓度保持不变，而样品浓度会逐级稀释，但最终样品的稀释倍数不得超过MVD。
可以采用直接把内毒素添加到样品溶液中，添加内毒素的体积宜小，以免导致样品溶液被稀释，一般添加体积等于或小于样品体积的10%为宜；也可以采用下述方法添加内毒素，就是将两倍于终浓度的内毒素溶液与两倍于终浓度的样品溶液等体积混合，内毒素和样品溶液间相互稀释，得到两者所需终浓度的混合液。
添加内毒素的浓度，凝胶法为2λ；终点显色法为4λ（这里的λ表示标准曲线上的最低点，也就是方法的检测限）。
动态显色法则有3种选择添加内毒素浓度的方法，可以选择标准曲线的中点浓度，也可以与终点比色法一样，选择4λ。
此外，当样品稀释液中，内毒素的限值小于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为0.1-0.5EU/ml之间，当样品稀释液中，内毒素的限值大于或等于1.0EU/ml时，添加内毒素的浓度可定为1.0-5.0EU/ml之间。
对于凝胶法的结果判断，不添加内毒素的样品不应该凝集，如果发生凝集说明含有内毒素或内毒素样物质；添加有内毒素的样品应该出现凝集，若没有发生凝集表明样品凝集反应被抑制。
光度法的结果判断标准为，测得的添加内毒素的量应该在已知添加量的±50%范围内，超出范围（多或少）表明存在增强或抑制作用。
通过预试验结果可以确定验证试验中样品的稀释度或浓度，其选择的基本原则包括：经稀释后的样品含内毒素的量应尽可能少，比其内毒素限值至少少4倍，最好检测不到内毒素。
要求验证试验选择的稀释度至少要比NIC大1-2倍，但不可超过MVD。
若样品需要多支合并进行验证试验，此时试验不可采用原来的MVD，因为假定合并样品中有一瓶存在污染，其它瓶没有污染，污染瓶含有的内毒素就会被其它没有污染瓶样品所稀释，并低于MVD，从而检测不到污染的样品。
因此，采用合并样品进行试验时，MVD应降低，这种情况下的MVD等于原来的MVD除以合并样品的数量。
例如：假定鲎试剂的标示灵敏度λ为0.125EU/ml，样品的MVD为100（倍）。
预试验结果表明样品在1：8倍稀释时，具有抑制作用，不干扰浓度（NIC）为1:16，可选择用于验证试验的稀释度或浓度为最低不小于1:32，可以选择1:64。
4、方法学验证试验（增强/抑制试验）验证试验在细菌内毒素方法学的建立过程中具有十分重要的作用，主要目的是确证检测内毒素的方法是否受样品的干扰。
验证试验的特点是样品浓度保持不变，添加内毒素的浓度逐渐降低。
在建立细菌内毒素检查方法中，验证试验前，要去除样品可能含有的内毒素，以确保建立方法的准确可靠。
凝胶法的验证试验是通过在细菌内毒素检查用水和样品溶液中平行进行鲎试剂标示灵敏度的复核试验完成，试验中要求样品平行4管，设立样品阴性对照管，也同样平行4管。
尽管要求添加内毒素标准平行管数量各国不完全一致，可以2管，也可以4管，但鉴于目前国内的具体情况，在2005年版药典附录的细菌内毒素检查法中规定是平行4管。
细菌内毒素检查用水和样品溶液中的反应终点浓度的对数平均值（内毒素含量）必须在鲎试剂标示灵敏度的2倍范围以内，在样品溶液和细菌内毒素检查用水中的反应终点浓度的对数平均值也应相互在2倍范围之内（2λ~0.5λ）。
光度法的验证试验中，要求阴性对照所含有的内毒素必须明显低于标准内毒素曲线中的最小浓度，阳性对照的内毒素回收率，在扣除样品可能含有的内源性内毒素后，必须在已知添加内毒素量的50%～200%之间，添加和未添加内毒素的样品管数量至少要平行2管。
二、细菌内毒素检查方法建立时注意事项及常见问题1、在方法建立的过程中，对方法的验证非常重要一个全面可靠的细菌内毒素检查法的方法学验证试验一般应注意：首先要了解产品的溶解度，按照适当的临床用量确定合适的内毒素限值，并确证产品对方法是否存在干扰，如果在样品处理过程中运用了激烈的处理条件或溶剂，还应证明所采用方法不会破坏或减少样品中细菌内毒素含量。
其次应考察样品批与批之间的差异是否会引起方法学变异。
此外，还应注意实验中涉及到的试验器材对方法学的影响，如：器皿的控制、鲎试剂标示灵敏度（或光度法检测用鲎试剂的检测限）等。