生物切片

在简述一下石蜡切片机和冰冻切片的原理及其应用

一.石蜡切片技术

石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。

一般的步骤大家都知道，就不多说了，值说几个注意的地方

1.固定组织要在方便的前提下尽可能的小点，固定液根据组织来源不同要选合适的。固定液的用量通常为材料块的20倍左右，固定时间则根据材料块的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以从1小时至数天，通常为数小时至24小时。纯酒精可固定肝糖而能溶解脂肪，甲醛能固定一般组织，但溶解肝糖和色素；单一固定液不能固定细胞中的所有成分；混合固定液可以互补不足，常用的混合固定液有Bouin氏液、Zenker氏液、FAA液、Carnoy氏液、SuSa液（配方见有关技术书籍）。

2.脱水要防止脱水过度引物组织萎缩。如不能及时进行各级脱水，材料可以放在70％酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化，不宜处理过久。

3.透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及属于囊腔抑或实质器官而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织；透明时间过长，则组织硬化变脆，就不易切出完整切片，最长为数小时。

4.切片厚度，切片过薄和过厚均会影响接下来的实验，过薄了贴片与烤片不好做，有可能染色结果也不全；过厚了，可能染色会很难看，或者通透的时候很麻烦。

5.抗原修复，石蜡切片的最大不好的地方就是要进行抗原修复，一个修复不好，最好免疫染色就不漂亮，这个是很多人选择冰冻切片的最大原因，因为有可能你的某个抗原的修复优化会在这里花去你很多的时间。

二. 石蜡切片技术优缺点

石蜡切片（paraffin section）组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。

而在免疫组化这一块上。冰冻切片手续简便，制片过程中抗原活性丢失少，但组织细胞形态较差；石蜡切片步骤繁多，制片中抗原活性有所减低，但组织细胞形态清晰，是免疫组织化学常规制备切片方法之一。一般石蜡包埋的组织切片用于检测胞浆或核内的抗原，不宜做表面抗原染色。

但是，石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析是石蜡包埋组织切片与流式细胞术结合使用来测量DNA含量及倍体分析，这一结合是流式细胞仪在临床应用中，特别是在肿瘤研究方面开拓了新的研究途径。目前已可测量细胞的大小、体积、DNA含量、DNA合成速率、RNA含量、表面抗原、染色体等。由于制备样品技术的原因，过去许多流式分析资料仅限于采用新鲜组织标本，而现在可以分析石蜡包埋组织切片制备分散细胞悬液技术来进行DNA含量的检测，从组织切片中能获得足够数量的单个细胞，且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似。

三.冰冻切片技术

冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片

的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。

一般的步骤大家都知道，也不多说了

1.取材：组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶。而冰晶会对细胞产生无法弥补的破坏，直接影响免疫组化结果。所以，一般采用把组织悬于液氮临界面上10-20秒后将组织投入液氮中骤冷。

2.恒冷箱温度

一般在冷冻后10分钟，到接近冷室温度时再切，一般组织在－15～－20℃切片最易成功。每种组织有其合适的切片温度、刀的温度和冷室温度。

3.切片

由于冰冻切片的组织新鲜及骤冷包埋在OCT中，其实组织本身没有渗透入包埋剂，所以组织本身还是比较软的。这就对切片的技术要求比较高了，要求刀片锋利，刀口角度良好，组织温度与单片温度与箱体温度差合适；要求切片时进刀速度和力度都要把握好才能切出一张令人满意的片子的。而抗卷板的前缘与刀面须有足够的距离，使切片平滑通过。抗卷板略高于刀面的最高点，得可凭经验调整刀对组织的角度。

四.冰冻切片的优缺点

（一）优点：

1．简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。2．快速，用时短。3．组织变化不大。4．能很好保存脂肪，类脂等成分。5．能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。（二）缺点：

1．不容易做连续切片。2．切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。3．不容易制作较薄的切片。4．组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。