免疫组化染色操作顺序
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
免疫组织化学染色实验步骤
免疫组织化学染色实验步骤1. 实验准备确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。
主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。
器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。
设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。
2. 组织样本的准备选择合适的组织样本并进行固定处理。
通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。
固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。
切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。
3. 切片的脱蜡和再水化4. 抗原修复抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。
选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。
之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。
5. 封闭非特异性结合位点用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。
封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。
6. 加入一抗（初级抗体）将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% TritonX100的PBS。
覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。
7. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。
洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。
8. 加入二抗（次级抗体）将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。
孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。
9. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。
洗涤操作与步骤7相同。
10. 显色反应根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。
病理科业务学习免疫组化染色步骤
•切片取出后放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次。
• 取出放入3%过氧化氢水溶液中5-10分钟，以去除内源性 过氧化物酶。
• 取出放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次。
•取出切片，擦干组织周围液体后滴加一抗，注意保持组织湿润状 态但表面不能有液体，要求抗体全部覆盖组织面，不能有气泡，以 使抗体能全部与组织接触。
•取出切片，擦干组织周围体后滴加DAB，显色时间5分钟左右， 如显色时间太短，阳性强度不够，阳性部位不突出，如显色时间过 长，背景着色较深，阳性部位对比差，均不利于诊断。
• 取出洗去DAB，放入苏木素中复染细胞核，一般时间为40 秒左右（依照苏木素新旧不同可适当增减时间）
• 分化、反蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
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免疫组化染色步骤
免疫组化标准操作程序
1、常规石蜡切片厚度3～4微米，放入80℃烤片机烤片15分 钟； 2、切片脱蜡程序： 二甲苯I、II、III脱蜡各10分钟； 无水乙醇I、II各5分钟； 95%乙醇I、II各5分钟。 3、流水冲洗，待组织修复。
•组织修复采用高温高压法：待高压锅内EDTA修复液沸腾后，放入 切片，盖紧高压锅盖，待高压锅阀门喷气开始计时，一般修复时间 为2.5-3分钟。
•滴加一抗后放入专用孵育盒内室温孵育1-2小时或4℃冰箱内过夜。 由于一抗孵育时间较长，因此一抗滴加量不宜过少。
•甩掉一抗，切片放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次，充分洗涤， 防止因洗涤不净引起的非特异性染色。
•滴加辣根酶标记聚合物（基本要求同一抗），室温孵育时间为2025分钟。
•取出切片放入PBS缓冲液中洗涤1分钟x3次，充分洗涤，防止因洗 涤不净引起的非特异性染色。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化染色实验操作流程实验目的：观察标记物在细胞中的表达及分布。
一、病例资料和实验分组标本：经10% 福尔马林液固定，常规石蜡包埋，4µm厚切片编号备用。
二、试剂及免疫组化方法2.1 实验试剂：xx两步法免疫组画试剂盒和DAB显色试剂盒进行组化染色。
抗体1,抗体2。
二甲苯、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甲醇、30% H2O2、羊血清、Triton液、中性树脂等。
2.2 仪器(1)10µl、100µl、200µl、1000µl可调微量加样枪（2）4℃冰箱(3)光学显微镜(4)恒温水浴锅(5)恒温烤箱(6)电热蒸馏水器(7)LEICA显微镜及VISITRON照相系统(8)其他：量筒、电炉、高压锅、染缸、湿盒、脱蜡架、冲洗球、免疫组化笔等。
2.3 主要试剂的配置（1）0.01M PBS(PH7.4)缓冲液NaCl9.0 g磷酸氢二钠 2.901 g磷酸二氢钠0.296 g加入1000ml容量瓶，加ddH2O至1000ml定容。
充分混合（2）0.01mol/L柠檬酸盐溶液（PH 6.0）A液：0.1M柠檬酸溶液(4℃保存)29.01g柠檬酸1000mlddH2OB液：0.1M柠檬酸钠溶液(4℃保存)29.41g柠檬酸钠1000mlddH2O缓冲液现用现配（1000ml 0.01 mol/L）A液（18ml）+B液(82ml)900mldH2O充分混合，调整PH 6.0，充分混合，调整PH 6.0（3）3% H2O230% H2O2：甲醇=1：9(4)0.1%Triton的配制Triton原液0.1 ml0.01PBS液99.9ml4℃保存备用。
（5）5%羊血清的配制（1ml）羊血清50µl0.1%Triton 950µl4℃保存。
2.4 免疫组化方法(1)石蜡切片60℃烤箱烤片30min.(2)石蜡切片常规脱蜡二甲苯Ι15min -- 二甲苯Ⅱ15min -- 无水乙醇Ι15min -- 无水乙醇Ⅱ5min -- 无水乙醇Ⅲ5min -- 95%乙醇5min -- 90%乙醇5min -- 80%乙醇5min -- 70%乙醇5min -- 蒸馏水冲洗3min，浸泡待用（浸泡在什么溶液中？）。
免 疫 组 化 染 色 步 骤
免疫组化染色步骤1.石蜡切片脱蜡和水化。
二甲苯I（10min），二甲苯II（10min），二甲苯&酒精1:1（10min），100%酒精（5min），95%酒精（5min），75%酒精（5min），50%酒精（5min），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2.抗原修复（微波炉P-100 4-5min煮沸，P-40 维持15min，每隔4-5 min加一次柠檬酸缓冲液，不能烧干片）。
静置缓慢冷却至室温，组化笔画圈将组织圈起来（离组织边缘1-2mm），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
3.封闭内源性过氧化物酶。
每张切片加适量的3%H2O2（将组织块儿覆盖即可），室温孵育15min（湿盒内，防干片），阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
4.封闭。
每张切片加适量的5% 血清或者脱脂牛奶（PBS配，组织块儿覆盖即可），孵育15分钟（湿盒内），以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
5.除去封闭液，每张切片加适量一抗，室温下孵育60分钟或4℃过夜。
6.PBS冲洗3x5`。
除去PBS液，每张切片加1滴或50μl放大剂(试剂A)，室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
7.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl多聚酶结合物（试剂B），室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
8.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB 或AEC使用说明书），显微镜下观察5-15分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
9.自来水冲洗，苏木素复染（20-30s），自来水冲洗，PBS返蓝。
10.如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂（详见迈新产品AEC-0038）封片。
可能出现的问题及解决办法:1. 脱蜡不彻底，容易出现非特异性背景染色，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开。
免疫组化染色步骤(精)
免疫组化染色步骤
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3. 如果有必要，每张切片加1滴（试剂A）室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3x3`。
4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃
过夜，建议参见每种抗体的说明书。
5. PBS冲洗3x5`。
除去PBS液，每张切片加1滴或50μl酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵
育40分钟或37度孵育30分钟或4度过夜。
PBS冲洗3x3`。
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB或AEC使用
说明书），显微镜下观察3-5分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1%HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝。
8. 如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果
用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。
封片。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种在组织学上，通过对细胞和组织中一些免疫反应物的特异性染色来研究蛋白质表达和分布的方法。
免疫组化染色操作步骤一般包括以下几个主要步骤：组织固定、切片、抗原修复、抗原阻断、一抗和二抗染色、显色反应和染色质反应控制。
下面将详细介绍每个步骤。
一、组织固定组织固定是将新鲜组织固定在组织学玻片上以保持其形态和结构。
常用的固定剂有甲醛和乙酸（酒精）。
固定剂的选择应根据研究目的和检测的抗原选择合适的固定剂。
甲醛固定对细胞膜蛋白质有较好的保护作用，适用于一些膜蛋白的免疫染色；而乙酸（酒精）固定可以在较短时间内固定组织，适用于快速染色的情况。
二、切片固定好的组织需要进行切片处理，将其切割成5-10微米厚的切片。
常用的器械有冰冻刀、滑刀等。
冰冻刀用于切割冰冻组织，滑刀用于切割固定组织。
切割好的组织切片需要进行干燥处理。
三、抗原修复抗原修复是为了恢复组织中被固定剂破坏的抗原形态。
抗原修复的方法一般有热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复两种。
热诱导抗原修复是将切片浸泡在高温的缓冲液中进行加热处理，常用的缓冲液有PBS、Tris等。
酶诱导抗原修复是通过加入蛋白酶K等酶来修复抗原。
四、抗原阻断抗原阻断是为了阻止非特异性的结合，减少假阳性结果。
一般是通过加入牛血清白蛋白（BSA）或小鼠IgG等蛋白质来阻断非特异性结合位点。
五、一抗和二抗染色一抗是指充分体内或体外免疫后所制备的单克隆或多克隆抗体。
在进行一抗染色前，需要对切片进行预处理，如使用过氧化氢或金胶子等对内源性酶进行体外灭活。
一抗的稀释倍数需要根据标示规定，也可以进行实验室优化。
一般在4℃下孵育过夜。
第二天，用PBS进行洗涤后加入二抗。
二抗是对一抗的特异性抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗兔的抗体。
加入二抗后，需要进行适当时间的孵育，一般是30分钟到1小时，然后用PBS进行洗涤。
六、显色反应显色反应是为了检测所免疫染色的反应物。
免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它可以用于检测细胞和组织中的特定蛋白质或其他分子。
这种技术主要基于抗体与抗原之间的特异性结合，通过标记抗体或抗原来实现染色。
下面是免疫组织学化学染色的步骤：
1. 取样：首先需要从组织或细胞中取得样品。
这可以通过活体组织切片、细胞培养等方法来实现。
2. 固定：将样品进行固定处理，以保持其形态和结构不变。
常用的固定剂包括甲醛、乙醛、乙酸等。
3. 脱水：将样品逐渐浸泡在不同浓度的乙醇中，以去除水分，使其逐渐变得透明。
4. 渗透：将样品逐渐浸泡在不同浓度的蜡中，使其逐渐渗透并浸润其中。
5. 切片：将样品切成非常薄的切片，通常为3-5微米。
6. 抗原修复：对切片进行抗原修复处理，以恢复抗原的免疫原性。
常用的抗原修复方法包括加热、酶解、酸解等。
7. 阻断：将切片浸泡在蛋白质阻断剂中，以防止非特异性结合发生。
8. 一抗：将特异性的一抗加入到切片中，使其与目标抗原结合。
9. 二抗：加入与一抗结合的标记二抗，以形成一抗-二抗复合物。
10. 染色：加入染色剂，使标记二抗发生染色反应，从而可视化目标抗原的分布和定位。
11. 脱色：将多余的染色剂去除，使切片变得清晰可见。
12. 封片：将切片用透明胶封装，以保护其结构和形态。
以上就是免疫组织学化学染色的步骤，这种技术可以用于研究细胞和组织中的蛋白质、细胞因子、核酸等分子，为生物医学领域的研究和诊断提供了重要的工具。
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免疫组织化学染色原理和操作步骤
一、免疫组织化学原理
免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），
染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H
2O
2
和二氨基联苯（DAB）为底
物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特
性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
SP法简化了操
作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免
图2.SP法原理示
疫绥化染色技术。
二、实验准备：
1.标本准备
①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理
②冰冻组织切片：由病理室常规处理
③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2h。
2.试剂准备
①抗体选择
单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。
因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体，抗体说明书上必须有IHC测试结果。
如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。
②二抗试剂盒
目前本实验室所用二抗试剂盒为LifeTechnologiesHistostain-
PlusKit(HRP,BroadSpectrum)，货号85-9043，一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。
③DAB 试剂盒
目前本实验室所用为加强型DAB 显色试剂盒，货号DAB-2032。
④其他试剂
二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES 胶
3. 抗体特异性验证
所有免疫组化抗体均须Westernblot 验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。
4.耗材准备
免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片 5.溶液配制
①磷酸盐缓冲液（PBS ）
10×PBS 母液配制 NaCl
72g
Na 2HPO 4·12H 2O 37.3g KH 2PO 4
4.3g 加蒸馏水至1000ml ，充分混匀贮存。
使用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH 值至7.3—7.4。
②柠檬酸抗原修复液
抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：
称取柠檬酸10.5g ，溶于500ml 蒸馏水；称取Na 2HPO 4·12H 2O57.3g ，溶于800ml 蒸馏水。
分别量取358ml 柠檬酸溶液和642mlNa 2HPO 4溶液，充分混匀后调整pH 值至6.0，即得2×母液，贮存备用。
③1%盐酸酒精
浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合，充分混匀。
三、免疫组化操作步骤
1.组织片脱蜡水化
①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15min。
②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5min。
③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸，每缸5min。
④依次放入90％乙醇、85％乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2min，取出。
⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。
2.抗原修复
将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2min，然后停止加热让切片自然冷却。
注意：抗原修复过度或不足，均会影响最终染色结果。
切片骤冷可致脱片，必须自然冷却！
3.封闭内源性过氧化氢酶
①放入3%H
2O
2
溶液的玻璃缸中，浸泡15min。
②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。
③放入PBS缓冲液的玻璃缸中，浸泡5min。
4.抗体杂交
①甩去PBS余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清1滴20μl（试剂盒中的A液，根据组织大小调整用量），28℃放置20min，甩干。
②加稀释好的一抗1滴（20~50μl，根据组织块大小进行调整），置于湿盒4℃过夜。
③置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作4次，甩干。
④加入生物素偶联的二抗20~50μl（试剂盒中的B液，根据组织块大小进行调整），放置湿盒，37℃放置20min。
⑤置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。
5.显色
①加链亲和素-辣根过氧化物酶20~50μl（试剂盒中的C液，根据组织块大小进行调整），湿盒内28℃放置5~20min，甩干。
②置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。
③滴加新鲜配制的DAB工作液100μl（以覆盖组织为宜），放置观察反应部位呈现黄褐色时（3~5min），置装有自来水玻璃缸中涮洗3次；
6.复染
浸入苏木精溶液中复染，放置5min后，用自来水反复涮洗至水不变色，再用1%盐酸酒精分化1—2s后，自来水冲洗后，反蓝水洗2min。
7.脱水、透明和封片
①依次放入95％、95％乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出；
②依次放入2个无水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出。
③依次放入2个装有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡5min，取出。
④滴加适量中性树胶，封片，晾干。
8.注意事项
①整个染色过程中组织块要保持湿润，不能干片，否则会导致非特异性染色。
②组织切片边缘易干，因此抗体、封闭液、显色液等试剂要充分覆盖组织块，避免干片。
四、结果判定
1.阳性细胞判断
DAB显色呈黄色。
每批染色都要有特异性阳性和阴性对照为基础，才能对染色结果作出判断。
抗原表达必须在特定部位，对于临床诊断来说，不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的着色多系内源干扰或人为因素所致，不能视为阳性。
2.抗原表达评价
免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，我们常用的免疫组化评分方法如下：
细胞染色强度评分：0（无染色），1（弱染色），2（中染色），3（强染色）
肿瘤细胞阳性率评分：0（0~9%），1（10%~25%），2（26%~50%），3（51%~75%），4（76%~100%）
将染色强度评分和阳性细胞率评分的乘积作为该切片评分值。