(完整word版)流式细胞周期结果图解读
如何看流式细胞术结果中的图
如何看流式细胞术结果中的图来源：高洋Gary的日志FCM数据的存贮的方式是FCS2.0（flow cytometry standard），采用列表排队(List Mode)方式。
易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。
Q1：坐标轴的意义？1、单参数直方图每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。
在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。
纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）！2、二维图在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。
双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。
Q2：“Gate”和“Regin”？∙设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。
∙On-line gating(threshold gating)监测/获取数据∙Off-line gating：分析实验数据散射光设门/荧光设门散射光/荧光联合设门多重逻辑门(组合门)多重逻辑门G3=R1 and R2 (G3=R1×R2) 其它：G=R1 or R2 G=R1 not R2Q3:流式图中的颜色与荧光颜色?流式图中的颜色为区分不同细胞群而人为指定, 与荧光颜色无关!!Q4：流式图中的阴/阳（N/P）如何划分?如何做M1阴性界限？实际上，这个M1的划分完全是根据阴性(同型)对照来的！如下图：左图为同型对照，即：您所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。
右图即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。
Q5: 这么巧，阴性正好在101划分？？其实, 我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在101附近）这样后期做sample时好看！当然也可以调到102，103次方。
手把手教你流式细胞周期检测（一）
手把手教你流式细胞周期检测（一）细胞周期（cell cycle)：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。
G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。
S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。
G2期和M期：当DNA复制成为4倍体时，细胞进入G2期。
G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。
从DNA含量我们同样无法区分G2期和M期。
流式细胞仪工作原理：将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。
在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。
通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。
细胞周期检测的原理：PI法是经典的周期检测方法。
PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。
PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。
图片来自网络1材料准备6孔板；15ml离心管；胰酶；RNase-A；PI；无水乙醇（四度冷藏）；PBS2仪器设备流式细胞仪；离心机；水浴；锡箔纸3实验步骤及注意事项：（以细胞加药为例）细胞样品的准备细胞消化和固定后不可过度吹打,防止细胞碎片1. 细胞培养:六孔板种下细胞，每孔1.5*10^6个,细胞处于生长对数期,50-80%贴壁后换含药培养液（三复孔）,处理相应时间后，收细胞检测(单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106)2. 细胞处理：胰酶消化含血清培养基中和，2000 rpm 5 min，用预冷PBS重悬洗涤，小心地吸去上清,残留约50ul,不要倾倒;3. 细胞固定：1ml PBS充分重悬，成单细胞，轻轻边vortex，边缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇，至终浓度75%，4度静置过夜（18-24h），-20度长期保存一个月（预约流式细胞仪）4. 将过夜固定好的细胞用预冷PBS 洗两次，2000rpm 5min去除 PBS 后加入200 ul PBS(约400ul)，为减少细胞损失可用1.5ml离心。
流式细胞仪结果分析PPT课件
reactive antibody, PRA）检测。 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如 大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成
细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
一、工作原理
➢采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； ➢利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； ➢用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
流式分析细胞周期
流式分析细胞周期
最近在做加药物的细胞周期，做了好几次，出现如下图的流式拟合图，师姐们都说你这样的拟合是强行的拟合，s期不明显，需要重新做，可是做了好多次还是这样的结果。
望专家教教我是哪里出错。
做细胞周期的步骤是：
1. 先铺板，2E5/孔。
过夜培养后加药（24h）
2. 再经过24h后可以进行测量。
3. 收集上清，并用PBS洗涤，再用胰酶消化，接着用PBS再洗一遍（在15ml管子中进行）
4. 1500转离心，小心去除上清，加入1ml的预冷PBS（记得要冲洗一下管壁），混匀后吸到1.5ml管中，再次在大厅中的离心机1500转4-5min（经过这样的一遍洗涤即可）
固定
5. 用枪吸走上清，剩余50ul左右，切勿吸走细胞，随后➕300ul 预冷PBS（用左手拿着EP管小拇指抵住涡旋震荡仪，右手拿住吸有700ul的乙醇的枪）缓慢打入其中，（这个过程尽量要慢）
6. 置于-20°冰箱中20min（有的说1h），若是过夜要要置于4°（有的说4h以上）
7. 1500转离心3-5min，小心吸上清
8. 加入1ml预冷PBS，重悬
9. 1500转离心3-5min，吸取上清，轻弹
染色
10. 0.5ml/管的碘化丙锭染色液（PI）缓慢加入，并充分的混匀
11. 37°避光30min
先配好染色的溶液
12. 4°避光存放2h
13. 上流式仪。
带您认识流式细胞术中的各种图
带您认识流式细胞术中的各种图流式图有很多种，最常用的是流式直方图和流式散点图，还有流式等高线图。
流式直方图只能显示一个通道的信息，流式散点图和流式等高线图可以同时显示2个通道的信息。
流式通道流式通道主要可以分为散射光通道和荧光通道：散射光通道有两个，包括FSC通道和SSC通道，一般所有的流式细胞仪均有这2个散射光通道；不同型号的流式细胞仪其荧光通道的多少差异较大，有的甚至没有光通道。
FSC，即前向角散射，它的值代表细胞的大小。
细胞体积越大，其FSC值就越大。
所以可以利用细胞的FSC值初步比较细胞的大小，利用FSC值对细胞进行分群和分类。
SSC，即侧向角散射，它的值代表细胞的颗粒度（granularity）。
细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC 值就越大。
所以可以利用细胞的SSC值初步比较细胞的颗粒度，利用SSC值对细胞进行分群和分类。
一般在硏究细胞样品时，首先关注的就是样品中细胞的FSC-SSC 散点图，x轴代表FSC值，y轴代表SSC值，将细胞都显示于该散点图中，可以初步根据细胞的大小和颗粒度对细胞进行分群和分类。
样品细胞不需要标记任何荧光素偶联抗体，直接上样分析就可以得到样品细胞的FSC值和SSC值，其值代表的是细胞的大小和颗粒度这两个基本的物理特征，所以样品的FSC-SSC散点图又称为样品细胞的“物理图”。
荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其化学特征。
如需要检测样品中是否有细胞表达某一CD分子，则需要标记荧光素偶联的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗的该CD分子的抗体，表达有该CD分子的细胞就会结合荧光素偶联抗体，其中的荧光素被相应的激光激发后产生荧光，该荧光信号通过光路系统被相应的荧光通道接收，就能得到该样品中是否有细胞表达该CD分子，以及有多少比例的细胞表达该CD分子等信息。
荧光通道接收到的信号越强，表示细胞上结合的荧光素越多，那么细胞表面表达的该CD分子就越多，因此可根据荧光信号的强弱判断细胞表达该CD 分子的相对数量。
细胞分裂增殖过程各时期的特点及示意图word资料19页
“登中2009”二轮复习·细胞增殖Ⅰ有丝分裂一、细胞周期及各时期特征细胞周期是指连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止。
一个细胞周期分为细胞分裂间期和细胞分裂期两个时期，分裂期又人为地分为前期、中期、动物细胞的有丝分裂与植物细胞的有丝分裂相比较有相同的地方，也有不同的地方。
相同的地方表现在动植物细胞有丝分裂的实质是一样的，但由于动物细胞与植物细胞在结构上的差异，所以动植物细胞在有丝分裂的形式上有所不同。
具体见表：1、通过细胞分裂能使单细胞生物直接繁殖新个体，使多细胞生物由受精卵发育成新个体，也能使多细胞生物衰老、死亡的细胞及时得到补充。
通过细胞分裂，可以将亲代细胞复制的遗传物质，平均分配到两个子细胞中去。
因此，细胞分裂是生物体生长、发育和繁殖的基础。
2、有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式，多细胞生物体以有丝分裂方式增加体细胞数目。
有丝分裂过程中，在分裂间期，亲代细胞染色体经过复制，经过分裂期一系列变化，精确地平均分配到两个子细胞中去。
由于染色体上有遗传物质（DNA、基因），因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性，对于生物的遗传有重要意义。
3、细胞分裂间期，DNA复制时，由于生物内部因素或外界环境条件的作用，使染色体上的基因的分子结构发生差错，而导致基因突变，从而导致子代（或子代细胞）发生变异。
减数分裂中，同源染色体的交叉和交换、非同源染色体的自由组合、在细胞水平上导致遗传物质的重组，使亲代产生多种类型的配子，从而使后代具有更大的变异性和更强的生活力及适应性。
有丝分裂过程中，正常情况下，复制后的染色体平均分配到子细胞中去，但一些外界条件或因素（如秋水仙素），能抑制纺锤体的形成，使细胞有丝分裂过程受阻，结果细胞核中染色体数目加倍，形成多倍体生物，导致生物变异。
因此，细胞分裂与生物变异密切相关。
4、细胞有丝分裂中期，细胞中染色体的形态固定、数目清晰，是观察和辨认细胞中染色体形态和数目的最佳时期。
流式细胞周期结果图解读.docx
流式检测细胞周期操作步骤1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
4. 流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！流式细胞周期结果图解读1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标DNA Content：即DNA含量；3、G1、G2、S三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
1、细胞周期可分为四个阶段：①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
流式细胞仪结果分析78页PPT
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
流式细胞仪结果分析
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
ห้องสมุดไป่ตู้
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
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流式检测细胞周期操作步骤
1. 细胞培养：
取对数生长期的细胞，按1×106cells/ mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，进行所需的处理（比如加入药物），特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
2. 细胞固定：
800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75%乙醇，于4℃固定4h以上。
3. 细胞染色：
1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL溴化乙锭（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。
4. 流式分析：
以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2~3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。
注：上机前要以50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团！
流式细胞周期结果图解读
1、纵坐标Cell Number：即计数的有效细胞数；
2、横坐标DNA Content：即DNA含量；
3、G1、G2、S三期在图中已经标示；
4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即G1期DNA含量平均值为55.56；
53.84%即G1期细胞数占总数的53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即G2期DNA 含量平均值为107.72，5.64%即G2期细胞数占总数的5.64%；以此类推…
流式细胞周期结果图的意义，主要从细胞周期的角度看各参数的意义：
1、细胞周期指由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，所需的时间叫细胞周期时间。
1、细胞周期可分为四个阶段：
①G1期(gap1)，指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间；
②S期(synthesis phase)，指DNA复制的时期；
③G2期(gap2)，指DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间；
④M期又称D期(mitosis or division)，细胞分裂开始到结束。
2、从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：
①连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。
②休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。
③不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。
细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关，如：小鼠十二指肠上皮细胞的周期为10小时，人类胃上皮细胞24小时，骨髓细胞18小时，培养的人成纤维细胞18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21小时。
不同类型细胞的G1长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。
3、流式细胞结果图各参数的意义：
常用的流式细胞术分析细胞周期的方法是依据细胞DNA含量（横坐标）来分析的：
G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；
S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；
G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；
M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。