铜绿假单胞菌阳性对照试验
水中铜绿假单胞菌盲样考核结果与分析
水中铜绿假单胞菌盲样考核结果与分析唐轶君;张建军;李晶;宁鑫思;蒋丽娜【摘要】为客观反映包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测能力,保证检测结果的准确性,本文依据国家标准GB/T 8538-2008和盲样考核作业指导书,对某包装饮用水样品进行处理和铜绿假单胞菌检验,用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)和API 20NE对检验结果进行鉴定。
结果表明:编号为5664、5663、5676、5679和5671的样品未检出铜绿假单胞菌,编号为5683、5669、5675、5696和5682的样品检出铜绿假单胞菌。
总的来看,10个样品的检测结果均为满意。
【期刊名称】《生物化工》【年(卷),期】2017(000)003【总页数】4页(P46-49)【关键词】包装饮用水;铜绿假单胞菌;盲样考核【作者】唐轶君;张建军;李晶;宁鑫思;蒋丽娜【作者单位】四川省食品药品检验检测院;四川省食品药品检验检测院;四川省食品药品检验检测院;四川省食品药品检验检测院;四川省食品药品检验检测院【正文语种】中文【中图分类】R123铜绿假单胞菌俗称绿脓杆菌，在自然界中分布广泛，为淡水和土壤中最常见的细菌种类之一，空气、动物皮肤、肠道、呼吸道等处均可有该菌的存在。
铜绿假单胞菌可通过水源、土壤、工器具、接触等多种途径传播，并对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境有极强的抵抗力[1]。
研究表明，铜绿假单胞菌可以产生多种外毒素、内毒素等致病因子，是导致人类急性肠道疾病和皮肤炎症的完全致病菌。
老弱病幼孕等抵抗力较差的人群，饮用或使用铜绿假单胞菌污染的包装饮用水存在健康风险[2]。
现阶段，我国国家标准GB 19298-2014《食品安全国家标准包装饮用水》、GB 8537-2008《饮用天然矿泉水》中，均明确规定每250mL水样中铜绿假单胞菌不得检出[3，4]。
为了解和证明四川省食品药品检验检测院实验室对包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测水平和检测能力，为实验室对水中铜绿假单胞菌的检测提供外部质量保证，增强客户及相关委托方对实验室出具可靠数据的信心，四川省食品药品检验检测院参加了由中国食品药品检定研究院组织的包装饮用水中铜绿假单胞菌盲样考核定性检验，并取得了满意的成绩。
矿泉水中铜绿假单胞菌检测技术水平考核
分将格栅面向上贴放在已灭菌的滤芯上，固定好滤杯，倒
1.1.2 仪器设备
入 250 mL 样液，启动真空泵抽滤至净干，待管里无水流动
智能恒温恒湿箱 HWS-150A（杭州大材光电科技有限 时，关闭真空泵，取下滤杯，将过滤后的滤膜贴在已制备好
公司）；多联过滤系统 MFS-6A-250-K（广东环凯微生物 的 CN 琼脂平板上，平铺，格栅面向上，滤膜和 CN 平板之
关键词：铜绿假单胞菌；盲样考核；矿泉水
铜绿假单胞菌原称绿脓杆菌，在自然界分布十分广泛， （1 min 内）加入少量（2 ～ 4 mL）稀释液（0.85% 生理盐水）进
其喜好较湿润的环境，为土壤中存在的最常见的细菌之一。 行再水化，待溶解后，将其置于无菌三角瓶中，反复用余下
水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。 的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液于上述无菌三角瓶
1.2 方法
色菌落的计数和确证性实验的结果，计算每 250 mL 水样中
按照质控样说明书对冻干粉进行水化，然后 10 倍递增 的铜绿假单胞菌数量。结果 8.0×103 CFU/250 mL，Z 值为 0.44，
稀释，依据《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》 （GB 8538—2016）采用滤膜法检验 [1]。
1.1.1 菌株和样品
1.2.3 样品过滤
检 验 及 计 数 过 程 中 以 铜 绿 假 单 胞 菌 标 准 菌 株（ATCC
过滤前，提前启动超净工作台风机，用火焰喷枪对滤芯
27853）作为阳性对照菌株，以荧光假单胞菌标准菌株（ATCC 进行灭菌，待冷却后，先用无菌镊子夹取无菌滤膜边缘部
13525）作为阴性对照菌株。质控样冻干粉安瓿瓶 1 瓶。
1.2.1 样品溶解
铜绿假单胞菌检验原始记录
36±1℃；24h-5d，5d内产生荧光的菌落为阳性
P: 显蓝/绿色的菌落数。
F: 显荧光的菌落数。
R:呈红褐色的菌落数。
nF: 进行产氨测试的显荧光的菌落数。
cF: 产氨阳性的显荧光菌落数。
nR: 进行产氨. 氧化酶. 金氏B培养上显荧光测试的红褐色菌落数。
cR:产氨、氧化酶. 金氏B培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。
绿脓菌素试验
36±1℃；24h±2h；三氯甲烷提取转移并加入1mol/L盐酸1ml，上层呈粉红色到紫红色为阳性，表示有绿脓菌素存在
乙酰胺液体培养基
36±1℃；20h-24h。加入1-2滴纳氏试剂，查看产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性
对照
结果
报告
检验员： 审核员：
釆用滤膜法：将5份250mL水样或稀释液用孔径为0.45um的滤膜过滤。
检验程序
计数与结果
分离培养
将滤膜移至CN琼脂选择性培养基
36±1℃倒置培养24h-48h
计数
确
证
性
试
验
营养琼脂纯化菌落
36±1℃培养20h-24h
氧化酶试验
10S内显深蓝紫色为阳性
菌落计数公式
N=P+F(cF/nF)+R(cR/nR)
铜绿假单胞菌原始记录表
样品名称
样品编号
检验项目
铜绿假单胞菌检验
检验日期
检验地点
BSL-2实验室
温湿度
（℃，RH%）
检验依据
GB 8538-2016
判定依据
检验仪器
生化培养箱不锈钢过滤器菌落计数仪
生物安全柜电子天平三用紫外分析仪
无菌药品包装容器的密封性验证报告
无菌药品包装容器密封性试验报告试验日期：试验人员：审核：批准：报告人：日期：1.概述本验证由生产部及质量部共同完成，并在质量部的全过程监控下按已批准的方案实施。
验证实施日期为年月日至年月日。
2.结果报告：2.1试验样品制备情况：所用样品为无菌灌装模拟试验后合格的样品。
2.1制备微生物菌悬液：从铜绿假单胞菌（ATCC 9027）的新鲜斜面上取培养物，接入含6ml无菌胆盐乳糖培养基的试管中，在30～35℃下培养了约24h，将此培养物分别转入含600ml无菌胆盐乳糖培养基的三角瓶内，于30～35℃下培养了约24h，现将菌落计数如下：结论：可用于试验用菌液。
2.2营养试验：每个试验样品内接种了多少个CFU（约100）铜绿假单胞菌。
在30～35℃下培养了7天，附：培养记录第一次试验试验开始时间：第二次试验试验开始时间：第三次试验试验开始时间：结果：结果所有试样品都呈阳性结果，符合试验预订的目标。
2.3微生物浸入试验：①将2.1的铜绿假单胞菌（ATCC 9027）的菌悬液倒入不锈钢桶内，密闭，从试验中取100只试验样品倒置于菌悬液中，将试验样品在菌悬液中持续浸泡约4h后，取出试验样品，擦干容器外残余的菌悬液，其外表用含0.5%过乙酸的70%异丙醇消毒五分钟（注意不要破坏其密封口），放入塑料袋中，置30～35℃下培养7天。
检查试验样品内微生物生长情况，有生长记作“﹢”，无生长记作“﹣”。
②阳性对照：阳性对照试验样品不经菌悬液浸泡，其外表用含0.5%过乙酸的70%异丙醇消毒五分钟后，接种10～100CFU铜绿假单胞菌，进行阳性对照试验。
现将试验记录如下：第一次试验第二次试验第三次试验结果：3.评价：冻干粉针剂轧盖密封完好性验证合格，表明各项工艺卫生管理规程及轧盖、无菌操作程序、净化空调、灌装机、人员符合GMP及无菌制剂生产要求，可进行产品的正式生产。
附：西林瓶，胶塞及铝盖规格尺寸，来源。
①．当轧盖设备发生变化时应进行再验证。
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。
供试液制备及实验环境要求同《非无菌产品微生物检查：微生物计数法》。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物的无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨肉汤培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖肉汤培养基中，20～25℃培养2～3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时。
铜绿假单胞菌快速检测方法的优化研究
铜绿假单胞菌快速检测方法的优化研究作者：单萌周婀马瑜来源：《食品安全导刊》2021年第11期摘要：為优化铜绿假单胞菌检测方法，本研究对不同选择性培养基的筛选效力及选择性进行了评价，并按照GB 8538—2016对人工污染样品进行了检验;进而，将选择性培养基鉴定结果与VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）结合，对不同检测技术、方法的有效性、适用性及相互之间的融合性进行了比较和分析，以期提升铜绿假单胞菌的检测效率及准确度。
结果表明，乙酰胺琼脂上铜绿假单胞菌的特异性较差，会出现假阳性或假阴性结果;而铜绿假单胞菌显色培养基（RAPID’s P.aeruginosa Agar）则具有典型的菌落特征以及较短的增菌时间，因此，将该培养基与VITEK 2 Compact系统结合使用可有效提高检测的灵敏度、特异性及时效性，适用于对大批量样品进行快速判定。
关键词：铜绿假单胞菌;快速检测方法;优化Comparison and Optimization of the Rapid Detection Method for Pseudomonas AeruginosaSHAN Meng1， ZHOU E1， MA Yu2*（1.MasterKong CO.， Ltd.， Beverage IRD Center，Shanghai 201101，China;2.Shaanxi Institute of Microbiology， Xi'an 710043， China）Abstract： In order to optimize the detection method for Pseudomonas aeruginosa， comparison of the effectiveness and selectivity of different selective media was performed， and the artificially contaminated samples were tested according to the GB 8538—2016. Finally， for the purpose of improving the detection efficiency and accuracy of P.aeruginosa， the results obtained above were combined with the VITEK 2 Compact and MALDI-TOF MS Biotyper System. The effectiveness，applicability and integration of the three detection methods were compared and analyzed. The results showed that the specificity of acetamide agar for Pseudomonas aeruginosa was poor， and accompanied with false positive/negative results occasionally. However，the RAPID’s P.aeruginosa Agar was notable for its typical colony characteristics and short incubation time. Therefore， the combination of RAPID’s P.aeruginosa Agar with the technique of VITEK 2 Compact System was suitable for rapid determination of large quantities of samples with the ， which can improve the sensitivity， specificity and timeliness of the detection remarkably.Keywords： Pseudomonas aeruginosa; rapid detection method; optimization铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），属假单胞菌属，广泛分布于水、土壤、空气、植物、污水、医院、动物及人体内等各类环境中，是一种常见的水源性和食源性条件致病菌[1-3]。
包装饮用水中铜绿假单胞菌检测
227科研与教育2020年第3期包装饮用水中铜绿假单胞菌检测钟 杰（深圳市计量质量检测研究院，广东 深圳 518000）摘 要：随着现代生活水平的提高，饮用水安全问题越来越受到关注。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种极具危害性的致病菌，检测其在饮用水中是否符合规定，对提高包装饮用水品质、普及健康用水理念有很大帮助。
检测方法参考新标准《食品安全国家标准包装饮用水生产卫生规范》（GB 19304—2018）中的铜绿假单胞菌滤膜-过滤法，并将检测出铜绿假单胞菌的水质通过PCR法扩增进行验证实验。
分析实验条件对结果的影响，并将结果与标准规定比对，判断抽取包装饮用水的质量，为消费者生产商提供可靠数据，为相关质量卫生部门加强监督管理提供依据。
关键词：包装饮用水；铜绿假单胞菌；滤膜-过滤法；PCR法中图分类号：R123.1 文献标志码：A 文章编号：2096-3092（2020）03-0227-02随着生活水平的提高，包装饮用水已在人们的日常生活中得到普及。
矿泉水方便易携带且口感好，桶装水便于家庭饮用且健康、安全，这些改变了人们长期以来的饮水习惯。
近年曝光的包装饮用水企业，很多是因为不合乎标准，微生物（铜绿假单胞菌）超标引起水质污染。
造成包装饮用水中铜绿假单胞菌超标的主要原因为水源遭受铜绿假单胞菌污染或生产过程中卫生控制不严格没有及时杀灭病菌，这对抵抗力较弱的人群存在较大健康风险。
因此，及时检测避免其带来经济损失是非常重要的。
为了进一步了解广东省包装饮用水的卫生状况，现随机从市面抽检包装饮用天然矿泉水和饮用纯净水进行检测。
机选取在2017年55批、2018年90批和220批。
1.2 菌株菌体有1～3根鞭毛，运动活泼。
/CN琼脂，乙酰胺肉试剂：萘啶酮酸（CN琼脂配套试剂），甘油，钠氏试剂（乙酰胺肉汤配套试剂），氧化酶试纸。
1.4 评价标准包装饮用矿泉水和饮用纯净水测定方法和标准参考新发行的标准《食品安全国家标准包装饮用水生产卫生规范》（GB 19304—2018）进行。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
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注：将两个标准菌株编号为1，2。
时间
实验操作
具体操作
现象
结论
第一天
确定
从两个标准菌株中各取一接种环，分别划线接种在血平板，和营养琼脂平板上，置37℃培养24h。
1为金黄色葡萄球菌，2为铜绿假单胞菌
修复
从标准菌株中取一接种接种5ml管装肉汤，置37℃培养24h。
肉汤变浑浊
细菌生长
第二天
增菌培养
分别取5mL水样加到45mLSCDLP液体培养基中，置37℃培养24h。
2s水样，SCD培养液表面有一层薄菌膜，培养液浑浊并呈黄绿色。2水样，SCD培养液则……
第三天
分离培养
划线接种在十六万三甲基溴化铵平板和营养琼脂平板上，置37℃培养24h。
2号水样，在平板上无菌落生长；2s水样，在营养琼脂平板，十六烷三甲基溴化铵平板上有典型菌落。
上层盐酸液内出现粉红色
绿脓菌素试验为阳性，表示有绿脓菌素存在
硝酸盐还原产气试验
挑取可疑的菌落，接种在硝酸盐蛋白胨水培养基中，置37℃培养24h
在硝酸盐蛋白胨水培养基内的小导管中有气体
硝酸盐还原产气为阳性。
明胶液化试验
取可疑菌落，穿刺接种在明胶培养基内，置37℃培养24h，取出放冰箱10min～30min，
观察，明胶仍呈溶解状
明胶液化试验阳性
42℃生长试验
取可疑菌落，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在42℃培养箱，培养24h
观察到铜绿假单胞菌能生长
42℃生长试验阳性
第五天
出报告
2号水样中铜绿假单胞菌未检测
第四天
染色镜检
挑取可疑铜绿假单胞菌菌落，涂片，革兰氏染色，镜检
镜检为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，短杆，成短链排列。
革兰氏阴性杆菌
氧化酶实验
用无菌玻璃棒挑取铜绿假单胞菌可疑菌落涂在氧化酶试纸上
试纸变为紫红色
氧化酶试验阳性
绿脓菌素试验
取可疑菌落2个，斜面接种在绿脓菌素测定培养基上，置37℃培养24h，加入氯仿1mL，充分振荡，待氯仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中，并加入1mol/L的盐酸溶液1mL，振荡，静置片刻，