ZN2+和金属硫蛋白在细胞内表达的关系
微量元素锌的吸收、代谢及金属硫蛋白基因表达
Ｔｈ ｌ ｔ ｎ ｈ ｐ Ｂｅ ｗｅ ｎ ｔ ｂ ｏ ｐ ｉ ｎ ａ ｄ Ｍ ｅ ａ ｏ ｉｍ ｆ Ｚｉ ｃ ａ ｄ Ｍ Ｔ ｎ ｐ ｅ ｓｏ ｅ Ｒｅ ａ ｉ ｓ ｉ ｔ ｅ ｈｅ Ａ ｓ ｒ ｔｏ ｎ ｏ ｔｂ ｌ ｓ ｏ ｎ ｎ Ｇｅ ｅ Ｅｘ ｒ ｓ ｉ ｎ
摘 要 ： 文 通 过 分析 锌 吸 收 、 谢 与 金 属 硫 蛋 白 （ ） 关 系， 明 锌 可 以 直接 调 控 空 属 硫 蛋 白基 因表 达 ， 金 属 本 代 ＭＴ 的 表 而
硫蛋 白的生物合成谤导也将调节体 电锌的吸收 、 Ｉ， 代＿ 维持 雄内锌的穗态， ｊ ｝ 为从 分子 水平研究锌的营养挺供参考 。 关键词 ： 锌；奎属琉蛋 白（Ｉ ） ／Ｔ ；基因表达 ＇ ，
传统营养研究中所使用的营养指标几乎都是黑箱指标。如 何打破黑箱 ． 进一步揭示体内的动态变化 ． 明确养分 的吸收、 代 谢 规 律 等 就 迫 切 需 要 利 用 分 子 生 物学 技 术 来 解 决 营 养 学 上 的 相美问题 。微量元素锌 是人和动 物所必需 的一种微量元 素 ， 锌 几乎涉及新陈代谢 的每 一方 面 ， 因此对锌 的吸 收 、 谢机制研 代 究极其重要 有关锌 的研究报道较多 ， 在深人探讨锌 的吸 收、 代
两种基于Mg(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的新型金属配合物的合成、晶体结构及抗肝癌活性研究
两种基于Mg(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)的新型金属配合物的合成、晶体结构及抗肝癌活性研究背景:肝癌是当今世界上死亡率极高的一种癌症,临床上常用的治疗方法包括手术切除、肝移植、化学疗法和放射疗法等。
由于肝脏手术治疗仅仅适用于处于肝细胞肝癌早期的很小一部分患者,因此传统的化疗仍然是肝癌的一个重要治疗策略。
在化学疗法中所使用的药物中,顺铂抗癌活性的发现具有重要意义,并且在临床治疗上取得了较为理想的效果,但是目前顺铂的临床疗效因为其自身的耐药现象和毒副作用受到较大的限制。
为了克服顺铂类药物所存在的这些缺陷,并且获得更加广谱、毒副作用更小的抗癌药物,这极大的推动了新型金属抗肿瘤药物的设计合成及应用。
金属配合物的重要组成部分配体的种类繁多,其中含有氧原子多齿结构的羧酸类配体和含有氮原子多齿结构的含氮杂环类配体因为具有丰富多变的配位模式和较强的配位能力,易于形成结构新颖多样,性能独特的三维拓扑结构,因此是最常用的合成金属有机配合物的配体。
应用这两类配体合成的金属配合物的研究以气体吸附性能、发光性能和磁性等居多,在抗肿瘤活性方面的应用研究还不是很充分,特别是对于碱土金属羧酸配合物以及芳香羧酸类与氮杂环类混合配体合成的过渡金属配合物在抗肿瘤活性方面的研究比较少。
目的:本文首先简要介绍肝癌现状及其治疗方法,金属配合物结构、合成方法、分类、性能,尤其是抗肿瘤活性,并对抗癌金属配合物的分类和抗癌机理进行了介绍,在此基础上介绍了本论文的立题依据和研究内容。
本文使用溶剂热法合成了两种新型金属配合物,第一种金属配合物是以1,3,5联苯三甲酸为配体的三核镁金属配合物,第二种是以1,3,5联苯三甲酸和咪唑为混合配体的三核锌金属配合物。
用元素分析和红外光谱等分析手段对配合物的组成和结构进行了表征,并用X-射线单晶衍射分析法测定了两种配合物的晶体结构。
继而研究了这两种金属配合物的体内体外抗肿瘤活性。
首先在细胞水平上利用MTT法研究这两种金属配合物对肝癌细胞的细胞毒性,用流式细胞术研究了金属配合物对细胞凋亡的影响;然后在小鼠肝癌原位植瘤模型上分析金属配合物的毒性和抗癌活性,并利用蛋白免疫印记技术检测了这些金属配合物对凋亡相关蛋白表达情况的影响。
硫酸锌诱导金属硫蛋白2表达对脓毒症小鼠脏器损伤的保护作用
硫酸锌诱导金属硫蛋白2表达对脓毒症小鼠脏器损伤的保护作用李家丽;杨汀;刘海荣;樊元春;王晓燕;刘月明【期刊名称】《成都医学院学报》【年(卷),期】2017(012)002【摘要】Objective To investigate the inductive effect of zinc sulfate on the metallothionein-2 (MT2) expression and the protective effect of the MT2 expression on the multiple organ damage in mice with sepsis.Methods Thirty-six healthy male C57/6 mice with the age of 6 to 8 weeks were randomly divided into three groups including the sham surgery group, sepsis group and intervention group, and each group consisted of 12 mice.The basic situations of the mice in the three groups were observed after they were given different treatments.ELISA was used to detect the levels of MT2, TNF-α, IL-6, IL-10, MDA, SOD and MDA in serum.Western blotting was employed to observe the levels of MT2 in liver.HE staining was adopted to examine the morphologic changes of multiple organs.The lesions in lung, liver and intestine were detected and their apoptosis indexes were calculated by TUNEL.Results The mortality rate of the mice in the intervention group was lower than that of the sepsis group, while the expression levels of MT2 and SOD in the intervention group were significantly higher than the those in the sepsis and sham operation groups respectively (P<0.05).The levels of inflammatory cytokines andMDA in the sepsis group were significantly higher than those in the other two groups (P<0.05).Meanwhile, The levels of cell degeneration, necrosis and apoptosis in the intervention group were lower than those in the sepsis group in the microscope.Conclusion Zinc ions could induce the expression of MT2, reduce release of the inflammatory factors and the content of MDA in serum, increase the SOD activity, reduce the pathological damage of organs in mice, and increase the survival rate of mice with sepsis.%目的研究硫酸锌对金属硫蛋白2(MT2)表达的诱导效应及其对脓毒症小鼠脏器损伤的保护作用.方法选取健康的6~8周龄雄性C57/6小鼠36只,随机分成假手术组、脓毒症组及硫酸锌干预组,每组12只,观察3组小鼠经不同方法处理后的基本情况.使用ELISA法检测每组小鼠血清中MT2、TNF-α、白介素6(IL-6)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)浓度,肝组织蛋白质印迹法观察MT2表达量,显微镜下观察肺、肝、小肠组织的病变情况,TUNEL法计算各器官细胞凋亡指数.结果硫酸锌干预组小鼠死亡率低于脓毒症组;MT2表达量及SOD浓度明显高于脓毒症组及假手术组,差异有统计学意义(P<0.05);脓毒症组小鼠血清炎症因子及MDA水平明显高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05);显微镜下观察显示:硫酸锌干预组各脏器细胞变性坏死及凋亡程度均轻于脓毒症组.结论锌离子可以诱导C57/6小鼠MT2的表达,降低血清炎症因子的水平,降低血清MDA含量、提高SOD活性,减轻各脏器组织病理性损伤,降低脓毒症小鼠死亡率.【总页数】6页(P133-138)【作者】李家丽;杨汀;刘海荣;樊元春;王晓燕;刘月明【作者单位】成都医学院基础医学院成都 610500;益阳市中心医院益阳 413000;成都医学院第一附属医院成都 610500;成都医学院第一附属医院成都 610500;成都医学院第一附属医院成都 610500;成都医学院基础医学院成都 610500【正文语种】中文【中图分类】R459.7【相关文献】1.右美托咪定可能通过抑制 TLR4通路对 LPS 诱导的脓毒症小鼠急性肺损伤起保护作用 [J], 刘海萍;郭红;王东伟;高骞皓;晋学飞2.N-乙酰半胱氨酸上调细胞FLICE抑制蛋白表达对脓毒症小鼠急性肾损伤的保护作用及其机制研究 [J], 樊恒;乐健伟;孙敏;陈国栋;朱永定;叶继辉;朱建华3.褪黑素对miRNA-223表达的影响及对脓毒症小鼠心肌损伤保护作用的机制 [J], 刘铭传;李林成;曹梦远;张家宁;刘洋;何亭4.褪黑素对miRNA-223表达的影响及对脓毒症小鼠心肌损伤保护作用的机制 [J], 刘铭传; 李林成; 曹梦远; 张家宁; 刘洋; 何亭5.金属硫蛋白对NMDA诱导小鼠大脑皮层神经细胞损伤的保护作用 [J], 于小倩;彭双清;方厚华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞Zn_2_荧光探针研究进展
锌是一种重要的人体必需的微量元素（日需要量是１０～１５ｍｇ），广泛的分布于人体的细胞和体液之中。
Ｚｎ２＋是人体内２００多种酶的组成成份，直接参与体内细胞生长发育，生殖、组织修复等各种生命代谢过程。
Ｚｎ２＋在细胞的生命活动中起着非常重要的作用，在基因转录，金属酶的一些功能中，在神经传递中等等都必须有Ｚｎ２＋的参加［１］。
若缺少了Ｚｎ２＋的参与，就会导致一些疾病的产生如：免疫系统受损，免疫功能缺陷等。
随着人们对锌在生命活动中的作用的认识越来越深，细胞内Ｚｎ２＋的研究已成为化学，生物学和临床医学等学科重要的前沿热点研究课题。
近年来，人们开始研究测定细胞内Ｚｎ２＋的方法和技术，先后建立和发展了多种方法，如锌离子传感器法，Ｚｎ２＋荧光探针法，核磁共振法和微电极法等，其中Ｚｎ２＋荧光探针法是目前最常用的一种方法。
其主要特点是选择性好、灵敏度高、简便快捷。
本文主要就近年来该领域的研究进展作了一个比较系统的回顾。
１Ｚｎ２＋荧光探针１．１喹啉类荧光探针喹啉及其衍生物已经被广泛用来作为一个荧光试剂对锌和其他一些离子进行一些定量的测定。
其中８－氨基喹啉和８－羟基喹啉是最具代表性的种类［２］。
在他们之中，８－氨基喹啉作为基体更为广泛一些．下面我们具体介绍几种以８－氨基喹啉为基体的探针．主要有以下几种，分别是：ＴＳＱ、ＺｉｎｑｕｉｎＡ、ＴＦＬＺｎ、Ｄａｎｑｕｉｎ等。
ＴＳＱ［３］是１９８７年由Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎ等发展起来的。
它首先用于二价锌离子的成像，这个工作被认为在生物锌荧光探针发展上一个里程碑式的工作。
它和Ｚｎ２＋结合后，吸收波长和发射波长分别位于３３４ｎｍ和４９５ｎｍ。
在４９５ｎｍ，它能够发出很强的荧光，量子产率达到了０．１。
作为一个中性ｐＨ值的荧光探针，它已经被证明是一个具有很好的选择性，无毒的荧光探针。
当然它也有很多的局限性，ＴＳＱ虽然可以用于在生理条件下较高浓度的Ｃａ２＋和Ｍｇ２＋存在时Ｚｎ２＋的检测，但是ＴＳＱ－Ｚｎ２＋合物的结构和稳定常数尚不清楚，ＴＳＱ－Ｚｎ２＋可能以１：１或２：１的形式结合，并且荧光强度在不同的介质中变化较大，所以用ＴＳＱ进行定量分析Ｚｎ２＋还有待于进一步研究，另外它的水溶性不好，就使它不适合在活组织中对锌进行测定和成像。
蛋白结合锌-概述说明以及解释
蛋白结合锌-概述说明以及解释1.引言1.1 概述蛋白结合锌是指锌离子与蛋白质分子之间形成稳定的结合。
锌是一种重要的微量元素，它参与了多种生物化学过程并对生物体起着重要作用。
蛋白结合锌广泛存在于生物体的各个组织和器官中，对细胞的正常功能和生理过程至关重要。
蛋白结合锌的特点是其结合方式多样且具有高度的选择性。
锌离子可以通过与蛋白结合形成稳定的配位键，从而调节蛋白的结构和功能。
蛋白质通过特定的结构域或蛋白质序列与锌离子进行相互作用，形成具有特定功能的复合物。
蛋白结合锌在生物体中具有多种功能和作用。
首先，它参与了蛋白质的折叠和稳定化过程，促进蛋白质的正确折叠并保持其功能活性。
其次，蛋白结合锌参与了许多重要的生化反应，如酶的活性调控、DNA的结合和修复、信号转导等。
此外，蛋白结合锌还在基因表达调控、免疫应答和细胞凋亡等生理过程中发挥着重要作用。
蛋白结合锌在生物体中的重要性不可忽视。
它不仅影响了细胞的正常功能和代谢过程，而且对于维持机体的健康和稳定也是必不可少的。
许多疾病和病理状态与蛋白结合锌的异常调节有关，如某些癌症、免疫系统疾病和神经系统疾病等。
因此，对于蛋白结合锌的研究具有重要的理论和实际意义。
总之，蛋白结合锌作为一种重要的生物分子，具有多种功能和作用。
它不仅参与了生物体的正常生理过程，还对于维持机体的健康和稳定也具有重要性。
进一步的研究和深入了解蛋白结合锌的机制，有助于揭示它对生物体的影响，并为未来的治疗和疾病预防提供新的思路和方法。
1.2文章结构文章结构部分的内容可以按照以下方式编写：本文将以蛋白结合锌为主题，介绍蛋白结合锌的定义、特点、功能和作用，以及其在生物体中的重要性。
文章主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分将对蛋白结合锌进行概述，简要介绍蛋白结合锌的背景和研究现状。
同时，介绍本文的结构安排和目的，以引起读者的兴趣和注意。
正文部分将详细探讨蛋白结合锌的定义和特点，包括它是什么以及具有哪些特殊的结构或性质。
蛋白结合锌
蛋白结合锌全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白结合锌是一种常见的生化反应，它在人体内起着重要的作用。
锌是一种必需的微量元素，对于人体的生长和发育、免疫功能、神经系统、生殖系统等方面都有重要的影响。
而蛋白结合锌则是指锌与特定的蛋白质结合形成复合物，这种结合可以调节蛋白质的功能，从而影响细胞内的生物活动。
锌是人体内含量第二多的微量元素，仅次于铁。
它被广泛应用于各种生物学过程中，如酶活性的调节、细胞信号传导、DNA合成等。
而蛋白结合锌的形成则能够增强锌的生物利用率，进一步提高细胞内的功能。
锌结合蛋白质通常会通过特定的结构域与锌离子结合，形成稳定的复合物。
在人体内，蛋白结合锌的例子有很多。
最为典型的就是代表性的锌结合蛋白类一和锌指物类。
锌结合蛋白类一是一类具有结构域的蛋白质，它们能够通过特定的结域与锌结合，形成稳定的复合物。
这些蛋白在人体内起着重要的作用，如调节基因表达、细胞凋亡、DNA修复等。
最为著名的锌结合蛋白类一是锌指蛋白。
它们通过锌结合的方式，可以与DNA结合，调节基因的转录和翻译，从而影响细胞的生物活动。
蛋白结合锌还能够通过调节酶活性来影响细胞的生物过程。
锌结合蛋白类一中的一些蛋白质就是具有酶活性的蛋白，它们在锌的参与下才能够发挥其酶活性。
这种方式能够有效地调节细胞内生化途径的进程，维持细胞内的平衡。
第二篇示例：蛋白结合锌是一种具有重要生物学功能的复合物，它在人体中起着多种重要作用。
锌是人体所需的微量元素之一，它参与了许多生物化学反应，包括蛋白质合成、DNA合成、细胞分裂等。
而蛋白结合锌则是锌在体内的主要形式之一，通过与蛋白质结合形成复合物，实现对锌的存储、传递和调控。
蛋白结合锌的功能主要包括两个方面：一是在细胞信号传导过程中的调控作用，二是在生物分子的合成和代谢过程中的催化作用。
在细胞信号传导中，一些锌结合的受体蛋白可以通过与其他蛋白质相互作用，参与细胞内外信号传导通路的调控，从而调节细胞的生长、增殖和分化。
植物耐受和解除重金属毒性研究进展
1.2细胞壁和根系分泌物
细胞壁像一吸附过滤器可结合一定数量的重金属。Bringezu等报道耐性植物（Silene vulgaris）可在表皮细胞壁中积累一系列重金属，这些重金属或是结合在蛋白质上，或是以硅酸盐的形式存在[18]。在虎杖（Polygonum Cuspidatum）中，约90% Cu, Zn, Cd存在于根细胞壁中[19]；禾秆蹄盖蕨（Athyrium yokoscense）根细胞中，约70%~90%的Cu, Zn, Cd在细胞壁中[20]。在啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞壁中，Hg2+主要通过SH组结合在细胞壁上[21]。Ana等研究表明Zn主要存在于根组织的胞间隙和细胞壁中[9]。
锌对水稻金属硫蛋白基因家族的表达以及重组酵母细胞耐受性的影响.pdf
!第!"卷!第"期!#$$"年"月锌对水稻金属硫蛋白基因家族的表达以及重组酵母细胞耐受性的影响"徐玉凤!周功克!李一勤!刘进元""清华大学生命科学与技术系分子生物学与蛋白质科学实验室!北京&’’’%(!!’’*$&’$!(收稿!!’’*$&!$!#收修改稿!"国家重点基础研究发展计划"批准号#!’’*H 9&’&"’*$和国家自然科学基金"批准号#)’!"’"#)!)’)"’%’($资助项目!""通信作者!+$,-./#/.@1]!,-./4C <.78^@-4?[@457!摘要!!采用>6:C ^?:7杂交和酵母功能互补实验!分析了&’个水稻I 类金属硫蛋白基因%_:8W 1?:&在水稻幼苗和重组酵母细胞中与‘7!U 的应答反应4‘7!U处理后样品的杂交结果显示"在幼苗的地上部分!除了)个(型_:8W 1?基因%_:8W 1?1‘G !_:8W 1?1‘L !_:8W 1?1‘2&的表达不受‘7!U的影响外!其余*个基因的表达都有不同程度的增加#而在根中!‘7!U 明显增加了_:8W 1?1X L 和_:8W 1?1a 2的转录!但_:8W 1?1X G 和_:8W 1?1[G 的转录却受到了抑制4将_:8W 1?:转化‘7!U敏感酵母突变体并获得异源表达后!&’个成员都可以在一定程度上提高酵母细胞的‘7!U耐受力!而且表现出重组酵母体内‘7!U 积累的增加4上述结果表明a <AP $I 家族的成员均能够对外加的‘7!U 产生反应!可能是通过螯合‘7!U 来增加了生物体对‘7!U 耐受性4关键词!!水稻!金属硫蛋白!诱导表达!锌离子!耐受性!!锌是生物体所必需的微量元素!是许多酶的辅因子!也是许多蛋白质活性的构成要素&&’4在缺乏锌的培养基上!当细胞内的‘7!U水平下降到每个细胞约为’4!0,6/时!细胞就会停止生长&!’4但如果细胞内游离的‘7!U 浓度过高!它又会造成对细胞的毒性4一般认为锌的毒性机理可能是由于抑制了关键代谢酶的活性!或干扰了蛋白质的正常折叠&&’4体内过量的游离‘7!U 必须被隔离或者储存起来!直到能被新合成的锌结合蛋白所利用!这样才不会造成对生物体的伤害4因此!生物在进化过程中!已经形成了一整套平衡体系来严格控制体内‘7!U 水平4生物体内普遍存在的金属硫蛋白",?C -//6C ^.6$7?.7!AP $是一类低分子量-富含半胱氨酸-具有金属结合能力的蛋白质4研究表明这类小分子蛋白质在哺乳动物控制‘7!U动态平衡中起重要作用&)’4当细胞内‘7!U 过量时!AP 能与‘7!U 结合从而解除‘7!U 的毒性%而当细胞内‘7!U 缺乏时!AP 又可作为锌的储存库释放出‘7!U或者作为锌的供体!释放给其他锌结合蛋白如锌指蛋白利用&)’4对植物AP 的研究则相对比较落后4第一个植物AP 于&3%"年才从小麦中分离出来!是一种‘7!U结合蛋白"+5$&(’4此后随着分子克隆技术的进步!从许多植物包括单子叶!双子叶植物中都克隆到了AP 基因&#(&%’4并且发现这类AP 基因的表达受到金属离子-氧化胁迫-植物激素等因子以及发育时期的调控!其表达特征随着植物的种类-AP类型的不同而表现出特异性&#(&%’4例如!‘7!U 对香蕉8W [基因表达有明显的诱导作用&%’!菊芋F 518W a 基因表达受到‘7!U 的抑制&&&’!而豌豆AP 的表达则不受‘7!U 的影响&#’4虽然植物AP 的研究大都集中在其表达特征的分析方面!但是也有一些研究发现将植物AP 转化微生物细胞!异源表达的植物AP 具有提高重组细胞对重金属离子如H @或H [的耐受性&&*(&%’4但是在植物‘7!U的动态平衡和耐33%受过程中植物AP所起作用的报道却很少!尤其是还未见有关于同一植物AP家族的各成员在‘7!U的代谢过程中所起作用的报道4在水稻基因组中!我们发现了一个由&&个AP 基因组成的AP基因家族!其中的&’个基因属于I 类AP&&(’4序列比对与表达特征分析结果表明这些基因不仅有不同的氨基酸序列!而且表达的组织特异性也不相同!暗示这些基因可能在不同的组织中行使不同的功能&&(!&#’4由于I I类AP基因"_:8W1 ??1X G$不受金属离子的诱导!在本文中我们重点研究了‘7!U对I类AP基因各成员"_:8W1?:$表达的诱导特征!并且将&’个水稻I类AP基因转化‘7!U敏感的酵母突变体!测定了表达_:8W1?:的重组酵母细胞对过量‘7!U的耐受性及其体内的锌含量4结果表明水稻I类AP基因不但受‘7!U诱导表达!而且能赋予转化酵母细胞一定程度的‘7!U耐受性!其结果将有助于更好地了解水稻AP家族不同成员在锌离子的平衡和耐受过程中的作用4!!材料与方法!"!!植物材料$生长条件和胁迫处理水稻"_"E U G:G54<H T45=4中花&’号$种子经表面消毒后!浸入稀释的A@:-<^.8?和D Y668液体培养基"&.!nA D$中!在光照培养箱中培养&![4水稻幼苗的生长条件为#&(^光照.!#h H!&’^黑暗.!’h H循环4进行‘7!U处理时!将&![的水稻幼苗的根浸泡在不同浓度的‘7H/!水溶液中!(^!然后分别收集根和地上部分!液氮速冻!贮存于G"’h H4!"’!酵母菌株$培养基和转化本研究所用的酵母菌株分别是野生型9d("(& "AF P-F4:[-X A H I a-Q$H5X Z-QI"G[-Q$和‘N H X$缺失的突变体-U"2X"AF P-F4:[-X A H I a-Q$H5X Z-Q I"G[-Qb J.X###G%8Y‘$+培养酵母细胞的培养基为d L M或含有!f葡萄糖或半乳糖的D M"<]7$ C^?C.5[?0.7?[$培养基!并根据需要补充所需营养成分&&3’4一种含有@’-X启动子"受半乳糖诱导$的穿梭载体R d+D!"I7=.C:68?7!D-7M.?86!K D F$用作目标基因在酵母中表达的载体!携有该质粒的酵母细胞可在缺乏尿嘧啶的D M固体培养基"D M$K:-)$上生长4!"(!水稻总B3C的分离与3A D P F N D@杂交使用N>?-<]L/-7C A.7.试剂盒"W.-8?7! J./[?7!V?:,-7]$提取水稻组织的总N>F!具体操作按试剂盒的说明书进行4>6:C^?:7杂交按文献&&(!&#’所述方法进行4!",!酵母功能互补实验&’个水稻I型AP基因&&(’由本室保存4为了将_:8W1?基因插入表达载体!采用外加;G$J I和M2K N I酶切位点"其中对_:8W1?1a G引入的酶切位点为c4%[I I I$的引物对克隆基因进行L H N扩增4扩增产物克隆到R d+D!载体的相应酶切位点!经测序验证后采用常规方法转化酵母细胞4转化后的酵母细胞在含有!f葡萄糖缺乏尿嘧啶的D M固体培养基"D M$K:-)$上进行选择性培养!!()[后挑取克隆!提取质粒进行L H N验证!正确的重组菌株于G"’h H保存备用4为了对重组菌株进行‘7!U耐受性测定!将重组酵母菌株在含!f葡萄糖的D M$K:-)液体培养基中培养至_B*’’S&4’!经梯度稀释后取!4#%T点样于含有不同浓度‘7!U的D M$K:-)"含!f半乳糖$固体培养基上!于)’h H培养)(([!观察菌落生长状况并照相4在用液体培养基进行测定时!将重组酵母细胞在D M"!f半乳糖$液体培养基中培养至_B*’’S’4!#!加入不同浓度‘7!U!并选取不同时段测量培养液的_B*’’值!以观测‘7!U对重组酵母细胞生长的影响4!"5!酵母细胞中R@’S含量的测定重组酵母细胞在!f半乳糖D M$K:-)液体培养基上培养到_B*’’S’4!#!加入‘7H/!到最终浓度",,6/5T G&!!(^后收集细胞!用冰冷的#’",,6/5T G&P:.<$J H/"R J*4#$!&’,,6/5T G& +M P F洗#次菌体细胞!最后用去离子水洗一次!然后用体积比#m!的硝酸#高氯酸!’’%T在%’h H 消化菌体细胞&^4消化后的样品用灭菌的去离子水稀释成&4’,T!使用质子偶联的原子发射光谱仪"I H L$F+D#a R C.,-))’’N T%T F9D!J@[<67! K D F$进行样品中‘7!U含量的测定4取)个独立的酵母样品进行检测并取平均值4’’3!第!"卷!第"期!#$$"年"月’!结果与讨论’"!!R@’S对45(678基因在水稻幼苗中表达的影响为了分析‘7!U对_:8W1?基因家族成员表达的影响!将培养&![的水稻幼苗用不同浓度"’!’4!#!’4#!&4’!!4’,,6/5T G&$‘7!U的水溶液处理!(^!然后分别提取根和地上部分的总N>F进行>6:C^?:7杂交分析4‘7!U的最高浓度的选择是依据植物研究中常用的‘7!U处理浓度&&&!!’’来确定的%而选择_:8W:基因的)e末端的非翻译序列作为基因特异性的探针4>6:C^?:7杂交结果如图&所示4在水稻幼苗的地上部分!除了(型_:8W1?基因的)个基因"_:8W1?1‘G!_:8W1?1‘L!_:8W1?1‘2$的表达不受‘7!U的影响外!_:8W1?基因家族其他*个成员的表达水平都有不同程度的上调!特别是_:8W1?1X L和_:8W1?1a G的表达还呈现出‘7!U浓度依赖的上调模式4_:8W1?1[G是在地上部分中响应‘7!U胁迫应答最强的基因!在!#’%,6/5T G&‘7!U处理!(^后即被强烈诱导4虽然‘7!U对于地上部分(型_:8W1?基因,N>F的水平没有影响!但是在根中(型_:8W1?基因的表达在!#’%,6/5T G&‘7!U处理!(^后也被诱导表达4在根中‘7!U处理还明显增加了_:8W1?1X L和_:8W1?1a2的转录!但却明显抑制了_:8W1?1X G和_:8W1?1[G的转录4而‘7!U对_:8W1?1a G!_:8W1?1a L和_:8W1?1[L 基因在根中的表达要么没有影响要么仅有轻微影响4这些结果一方面揭示了‘7!U对_:8W1?:基因的表达调控是一个复杂的过程!也说明了家族成员之间在水稻不同组织‘7!U的动态平衡和耐受过程中!所起的作用既有差别!又有重叠4在水稻幼苗的地上部分!‘7!U可以增加大部分_:8W1?家族成员的表达!说明它们可能参与水稻‘7!U的耐受!储存和地上部分组织之间的转运过程4而在根中! _:8W1?1X G和_:8W1?1[G在根中的表达受‘7!U的下调!表明它们可能参与‘7!U从土壤中的吸收!而其他的_:8W1?:"除了_:8W1?1[L外$!在根中的表达受‘7!U的正向调控!暗示它们可能参与了根中‘7!U的贮存和耐受过程4图!!R@’S对45(678基因家族成员表达的影响每泳道上样量为!’%8总N>F%所用探针分别为&’个_:8W1?基因的)e末端特异序列4溴化乙锭"+9$染色的凝胶":N>F$作为指示上样量的对照’"’!水稻45(678基因互补酵母R@’S敏感细胞的功能研究基因功能的方法通常是制作基因缺失或过量表达的稳定转基因株系或者植物细胞来进行的!然而单个AP基因缺失的重组植物与野生型植物之&’3 !第!"卷!第"期!#$$"年"月间在表型上并没有差别&"’!给a<AP功能的检测带来了困难4在已经获得了许多金属离子敏感的酵母突变体的基础上!人们常常用酵母作为分析金属离子平衡和耐受相关基因功能的模式系统&!&’4b J.X 编码了一个阳离子转运蛋白!参与酵母细胞‘7!U向图’!重组酵母菌株所含质粒的%7B验证经营养缺陷筛选出的酵母菌株中的重组质粒和空载体R d+D!"依次标记为a<A P$I$&-!&;!!-!!;!!5!)-!);!(-!(;!(5!d+D!$的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图4引物采用材料与方法中所述的各基因的特异引物4A为M T!’’’M>F标准图(!转化45(678基因的重组#9"0:酵母突变体细胞对R@!U耐受性&’个_:8W1?基因分别插入载体R d+D!!并转入-U"2X突变体细胞4野生型"9d("(&$细胞和转化R d+D!空质粒的-U"2X重组细胞作为对照4当细胞生长到_B*’’S&4’时!经系列稀释!分别取!4#%T点到含有!f半乳糖且缺失尿嘧啶的D M平板上!并加入&’,,6/5T G&的‘7H/!!于)’h H培养([后照相4每个重组质粒选取两个独立的转化子重复)次进行锌耐受性实验液泡运输的过程&!!’%而缺失b J.X基因会导致酵母突变体对‘7!U敏感!其原因可能是敲除‘N H&后使细胞内游离的‘7!U增多!从而对酵母突变体细胞产生毒性!使其生长受阻&!&’4在本研究中!我们分别将_:8W1?克隆到受半乳糖诱导表达的酵母R d+D!载体上!经序列分析确定插入序列的正确性4然后将确认插入正确序列的重组载体导入‘7!U敏感的酵母突变株-U"2X中!在添加!f葡萄糖并缺乏尿嘧啶的D M固体培养基上行选择性培养!对长出来的克隆提取质粒并进行L H N鉴定!结果如图!所示!所有扩增片段与目标片段的长度一致4最后将得到确认的重组菌株在添加不同浓度‘7!U的D M$K:-)固体培养基"!f半乳糖$上进行了功能互补实验4结果在添加&’,,6/5T G&‘7!U的培养基上!转化_:8W1?:的突变体细胞比只转化空载体R d+D!突变体细胞生长状况要好"图)$!说明所有a<AP$I<可以在一定程度上提高细胞锌的耐受能力4在‘7!U 浓度超过&#,,6/5T G&的培养基上!野生型酵母能够生长!突变体细胞则不能生长!而转化有_:8W1?的突变体在这种条件下也不能生长!说明a<AP$I<只能在一定程度上提高细胞‘7!U的耐受性"结果未显示$4这一结果与另一种植物AP"P5AP)$也只能部分缓解‘7!U对酵母细胞的毒性&!)’的报道是一致的4为了进一步验证互补实验!我们对重组细胞在添加不同浓度‘7!U的液体培养基中的生长速率和细胞内锌的含量也进行了测定4因为_:8W1?:不同家族成员表达的酵母细胞在固体培养基上的表型相似!所以本实验只选取了_:8W1?1X G和_:8W1?1X L 作为代表进行了分析4在添加有#,,6/5T G&‘7!U 的液体培养基中!-U"2X细胞生长良好!不同重组酵母之间的生长并没有差别4但是当‘7!U浓度提高到",,6/5T G&时!可以明显地观察到含有_:8W1 ?1X G和_:8W1?1X L的-U"2X重组细胞生长明显好于转化空载体的-U"2X对照细胞!这个结果和固体培养基的结果一致"图("-$$4同时对细胞内锌含量的测定结果表明含有_:8W1?1X G或者_:8W1?1X L的重组细胞内的锌浓度!比对照细胞有略微的增加"图(";$$4这些暗示出表达a<AP$I<酵母细胞的‘7!U耐受性的提高可能是由于AP蛋白螯合了细胞内游离‘7!U的结果!或者参与了‘7!U向细胞器比!’3!第!"卷!第"期!#$$"年"月如液泡的区域化隔离过程!而不是促进了‘7!U的外排4另外!有研究报道豌豆中的&型AP"7:8W’$基因和拟南芥的!型AP"8W a$基因在细菌中与@>W基因融合表达时能以不同的亲和力与锌离子结合&!(!!#’%我们对水稻&&个成员的蛋白序列进行了生物信息学分析!并没有找到它们含有定位于亚细胞器的信号肽4这个预测结果和B678等通过实验将a<AP!;"a<AP$I$!;$定位于植物细胞的细胞质的结果一致&!*’4T??等人将拟南芥F C AP)和V X L 融合在保卫细胞中表达!证明F C AP)也定位在细胞质中&&"’4这些都暗示AP有可能在植物的细胞质中与锌离子结合4因此我们相信a<AP$I<与细胞质中‘7!U的结合可能是其参与水稻体内锌的动态平衡和耐受的机制之一4但是_:8W1?:家族成员在水稻‘7!U动态平衡中的确切生理学和生物化学机制还需要做进一步研究4图,!45(678基因对#9"0:酵母突变体细胞中积累R@’S的影响不同转化细胞在添加",,6/5T G&‘7!U"黑柱$和不添加‘7!U"白柱$的D M$K:-)液体培养基"!f葡萄糖$中培养到_B*’’S&4’!随后用D M$K:-)"!f半乳糖$稀释这些细胞以达到起始密度约为_B*’’S’4!#!然后培育!(^后!检测_B*’’"-$和用I H L$F+D测量酵母内‘7!U的含量";$!!近年来!分析基因家族内成员之间的功能差异已成为解析基因功能研究的热点4本文分析了_:1 8W1?基因家族各成员在水稻幼苗应答‘7!U的表达特征!虽然_:8W1?家族成员之间的序列高度相似!但家族各成员的表达不仅具有不同的组织特异性&&(’!而且对‘7!U的应答反应也有所不同"图)$4但有意思的是这些基因在酵母中的异源表达却表现出相似的‘7!U耐受性4这些结果进一步提供了植物AP蛋白在应答‘7!U和提高生物体‘7!U耐受性的证据!也为进一步研究a<AP$I<参与了水稻体内‘7!U的平衡和耐受的过程的分子机理打下了坚实的基础4致谢!作者感谢法国J?7:.L6.75-:?大学的A.5^?/H^-/6C博士为本实验提供酵母菌株%9d("(&野生型!U"2X突变体&!感谢清华大学分子生物学实验室的部分成员所给予的帮助与有意义的讨论4参!考!文!献&!9?:8\A!D^.d4P^?8-/=-7.E-C.6760;.6/68]#F8:6Z.78-R R:?$5.-C.6706:C^?:6/?<60E.754D5.?75?!&33*!!"&#&’%&(&’%#!!L-/,.C?:N M!X.7[/?]D M4H/67.78-7[0@75C.67-/5^-:-5C?:.E-$C.6760-,-,,-/.-7E.75C:-7<R6:C?:C^-C5670?:<:?<.<C-75?C6E.754+A9a\!&33#!&(#*)3(*(3)!H6]/?L!L^./56Q\H!H-:?]T H!?C-/4A?C-//6C^.67?.7#P^?,@/C.R@:R6<?R:6C?.74H?//A6/T.0?D5.!!’’!!#3#*!"(*(" (!T-7?9V!b-1.6Y-N!b?77?[]P M4P^?Z^?-C8?:,+5R:6C?.7 .<-E.75567C-.7.78,?C-//6C^.67?.749.65^?,H?//9.6/!&3%"!*##&’’&(&’’##!X6:[^-,$D Y?/C67F L!T.//?]H!K:Z.7L+!?C-/4V K D?Q R:?<$ <.67.7’"G L4!K C:4:[.:?5C?[;]#e:?8.67<60C^?R?-,?C-//6C^.6$ 7?.7$/.Y?8?7?L<AP F4L/-7CA6/9.6/!&33"!)(#*#3(**%*!N-@<?:B+4D C:@5C@:?-7[0@75C.6760,?C-/5^?/-C6:<R:6[@5?[ ;]R/-7C<#P^?5-<?606:8-7.5-5.[<!-,.76-5.[<!R^]C.7-7[ ,?C-//6C^.67?.7<4H?//9.65^?,9.6R^]<!&333!)&#&%((%"!H6;;?C C H!V6/[<;:6@8^L4L^]C65^?/-C.7<-7[,?C-//6C^.6$ 7?.7<#N6/?<.7^?-=],?C-/[?C6Q.0.5-C.67-7[^6,?6<C-<.<4F7$ 7@N?=L/-7C9.6/!!’’!!#)#(&%!%!T.@L!V6^H\!T6^H D!?C-/4M.00?:?7C.-/?Q R:?<<.67-7[5^-:$)’3 !第!"卷!第"期!#$$"年"月-5C?:.E-C.6760C^:??,?C-//6C^.67?.7$/.Y?8?7?<.75-=?7[.<^;-$ 7-7-"8I:G G2I$4%G5G$4L^]<.6/L/-7C!!’’!!&&(#!(&(!#’3!H^?7J\!J6@B H!d-78H d!?C-/4A6/?5@/-:5/67.7860C Z6 ,?C-//6C^.67?.7$/.Y?R:6C?.78?7?<Z.C^[.00?:?7C.-/?Q R:?<<.67 R-C C?:7<0:6,<Z??C R6C-C6"?C K$K H GL G5G5G:$/?-=?<4\L/-7C L^]<.6/!!’’)!&*’##("(###&’!A-A!T-@L D!\.-d P!?C-/4P^?.<6/-C.67-7[5^-:-5C?:.E-C.67 60C]R?&,?C-//6C^.67?.7"AP$5M>F0:6,-^?-=]$,?C-/$C6/?:$ -7C R/-7C!P H:5I2G"I L"G5=4$H"A4%4L/-7CD5.!!’’)!&*("&$# #&(*’&&!H^-78P!T.@_!_@J!?C-/4F,?C-//6C^.67?.7$/.Y?8?7?^C$A P!<C:678/]?Q R:?<<?[.7.7C?:76[?<-7[76[?<60c H A4G%5F I:5I L H"K:I:-7[?00?5C<60,?C-/.67C:?-C,?7C67.C<?Q R:?<<.674 L/-7C-!!’’(!!&%#((3((##&!!A.:V!M6,?7?5^\!J@8@?CV!?C-/4F R/-7C C]R?!,?C-//6$ C^.67?.7"A P$0:6,56:YC.<<@?:?<R67[<C66Q.[-C.=?<C:?<<4\ +Q R96C!!’’(!###!(%)(!(3)&)!A@:R^]F!‘^6@\!V6/[<;:6@8^L!?C-/4L@:.0.5-C.67-7[.,$ ,@76/68.5-/.[?7C.0.5-C.6760,?C-//6C^.67?.7<&-7[!0:6,’"G1 L4!K C:4:5F G A4G%G4L/-7C 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