黄瓜花叶病毒研究进展
黄瓜花叶病毒研究进展摘要综述了黄瓜花叶病毒（cmv）的生物学特性、基因组、病害防控等方面的研究进展，并对国内外当前研究中存在的问题作了相关探讨。
关键词黄瓜花叶病毒；生物学特性；基因组；病害防控中图分类号 s436.421 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2013）03-0121-03黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，cmv）是雀麦花叶病毒科（bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（cucumovirus）的代表性成员，为单链正义rna（+ssrna）病毒。
cmv能侵染包括单、双子叶植物在内的1 000多种植物，是很多农作物和观赏植物的重要毁灭性病原之一[1]。
cmv在自然界主要通过寄主植物种子或繁殖材料及昆虫传播，是目前所知的寄主最多、分布最广、最具经济危害的植物病毒[2]。
自1916年首次报道cmv是黄瓜花叶病的病原以来，国内外学者相继报道了该病毒在不同寄主上的危害[3-4]。
cmv严重抑制许多作物的正常生长，如引起黄瓜叶片花叶黄化、番茄叶片丝状畸形、香蕉花叶（心腐）、辣椒叶片斑驳畸形及顶死等，这给世界各国的农作物生产造成严重的经济损失。
根据地区分布、寄主范围及症状表现的差异，可以把该病毒划分为不同的株系（strain）。
例如，fny、pf、a9和ls等株系都能够侵染烟草和黄瓜，但它们在侵染茄科作物时，其症状表现存在很大的差异[5]。
近几十年来，国内外学者对该病毒进行过系统研究，特别是对该病毒病害的防控方面提出了相关见解。
本文着重介绍cmv的生物学特性、基因组、病害防控等方面的研究进展，并对当前研究中存在的问题作相关探讨。
1 生物学特性1.1 寄主症状cmv具有很宽的寄主范围，能导致绝大多数寄主发生系统侵染并表现出各种典型症状。
如生长迟缓、节间矮化、叶片斑驳黄化，甚至引起叶片畸形和果实发育不良。
例如，侵染番茄时最典型的症状是引起番茄叶片呈丝线状畸形。
但在一些少数寄主作物（如苜蓿）上却不表现出症状。
cmv侵染症状在不同作物种类、不同株龄和不同生长环境下往往表现出较大的差异。
1.2 病毒特性cmv病毒粒子为正二十面体，直径大小为28～30 nm，分子量约为5.3×106，其中rna和蛋白质含量分别为18%和82%[6]。
病毒致死温度范围为65～70 ℃，稀释终点为10-4，室温下体外存活期为72～96 h[7]。
1.3 株系通常情况下，cmv各株系在同种寄主植物上的症状表现存在差异。
根据血清学和基因组序列差异可将cmv株系划分为2个亚组，即亚组ⅰ和亚组ⅱ。
亚组ⅰ分离物侵染植物症状较重且主要分布于热带和亚热带地区，而亚组ⅱ分离物侵染植物症状较轻且主要在温带地区流行[8]。
基于对豇豆（vigna unguiculata）致病性的差异，亚组ⅰ还可进一步划分为ⅰa和ⅰb 2个株系。
其中ⅰa株系可导致豇豆发生系统花叶症状，而ⅰb株系则引起叶片的局部坏死症状。
此外，还有一些株系为寄主专化株系，只侵染同一科属（如豆科）的特定的寄主植物。
根据血清学研究，cmv与番茄不孕病毒（tomato aspermy virus， tav）和花生矮化病毒（peanut stunt virus， psv）存在一定的血清学关系[9]。
1.4 传播途径和发病条件cmv在自然条件下主要依靠蚜虫以非持久方式传播，也可以通过种子、寄生植物（如菟丝子）以及汁液摩擦传播。
据报道，有70多种蚜虫能传播cmv，有近20种植物可以通过种子传毒，有10多种菟丝子属寄生植物也能传播该病毒[2]。
蚜虫在病株上获取病毒并将病毒传播到健株上，整个过程最快可在1 min之内完成，且所有龄期蚜虫均可传毒。
当然，蚜虫的传毒效率与蚜虫的种类、病毒株系、寄主植物品种以及当地的气候环境条件密切相关。
当春、秋季气候凉爽、潮湿时，蚜虫种群数量锐减，田间病害发生较轻。
相反，当春、秋季温暖少雨，蚜虫种群数量迅速增加，大量聚集在一些多年生cmv宿主植物上，并大量向田间新种农作物迁飞取食，从而导致田间大面积农作物遭受病毒感染。
该病毒寄主范围极广，可在许多多年生寄主植物上越冬，很多作物（如辣椒、番茄）和田边杂草（如鸭跖草、苜蓿等）均可作为侵染源[6]。
一些植物能借助种子传播cmv，这些植物（包括农作物）主要分属于苋科（amaranthaceae）、十字花科（brassic-aceae）、豆科（leguminosae）、石竹科（caryophyllaceae）和唇形科（labiatae）等。
如繁缕（属石竹科）种子的传毒效率高达40%[9]。
cmv的种传特性给植物检疫和种子安全带来不利影响，对于温室作物种植来说也是一种潜在的威胁，客观上增强了病毒在自然界的生存能力。
此外，该病毒很容易通过汁液摩擦接种到健康植株上，这就要求人们在从事农事操作时务必要科学使用农具，必要时要对农具进行适当的消毒处理，减少人为传毒的机会。
2 基因组cmv是典型的三分体单链正义rna病毒，其基因组大小约为8.6 kb，由3个rna组成，分别为rna1、rna2和rna3（图1）。
rna 1含有1个开放阅读框（orf），编码1a蛋白，是病毒基因组复制所必需的蛋白。
1a蛋白有2个功能域：n-端和c-端结构域。
n-端结构域具有转甲基酶活性，可以在病毒的基因组和亚基因组rna的5′端添加一个甲基化帽子结构（m7g5′ppp5′gp）。
而c-端结构域是一个被公认的解旋酶，在病毒复制时起到解开双链rna 的作用。
rna2含有2个orf，5′端的orf编码2a蛋白，3′端的orf编码2b蛋白[10]。
2a蛋白具有rna依赖的rna聚合酶（rdrp）结构基元特征，与病毒基因组复制有关，与1a蛋白共同参与病毒复制酶复合体（rp）的形成，决定侵染寄主植株的症状表现、传播、对温度的敏感性和与卫星rna的相互作用[11]。
有学者认为，2a基因中的243个碱基决定cmv在豆科植物上的过敏反应（hr），并进一步证实该过敏反应是由2a基因上的631位和641位氨基酸共同决定的[12]。
2b蛋白对寄主植物转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，ptgs）具有强烈抑制作用，是cmv抵抗寄主植物天然存在ptgs机制的抑制因子，可减弱寄主植物向离侵染部位较远组织发送基因沉默信号的能力，并且它与1a蛋白对cmv在植物体内的长距离运输中也具有重要作用[13-14]。
另外，2b基因还对水杨酸介导的病毒抗性具有抑制作用[15]。
rna3含有2个orf，5′端的orf编码3a蛋白，3′端的orf则通过其亚基因组rna4编码外壳蛋白（cp）。
3a蛋白也叫运动蛋白（mp），是病毒在寄主细胞间移动所必须的，也与病毒在寄主体内长距离移动有关。
cp是唯一一个与病毒颗粒组装和决定蚜虫传播相关的蛋白，还与病毒血清型和侵染寄主症状表现相关[1，10，16-18]。
cmv各株系基因组rna序列的3′末端含有200 nt高度保守的同源序列，形成类似trna结构，是病毒rdrp的起始结合位点，促进负义rna链的合成[19]。
此外，有些cmv株系含有卫星rna（也称作rna5或satrna），是一类由332～342个核甘酸组成的单链rna 分子，是病毒基因组以外的遗传因子，其复制必须依赖于病毒基因组才能进行。
satrna被包裹在cmv颗粒之中，能够和病毒粒子一起借助蚜虫等媒介在植株间传播。
satrna对其辅助病毒（cmv）不提供任何必要的功能，通常干扰辅助病毒的复制，改变cmv在植株上的致病性和症状。
satrna的存在可能对cmv本身的诱导症状影响不明显，或者会强化由系统侵染导致的变色或坏死症状，或者会减弱症状[20-25]。
cmv不同株系存在寄主选择性差异，而不同的satrna 与辅助病毒的寄主适应性也不完全相同[26]。
可见，satrna对病毒寄主症状的表达的影响与不同的satrna的种类、cmv株系类型、寄主植物种类和品种三者之间的互作密不可分。
3 病害防控目前，对cmv的防控主要包括以下几个方面：一是铲除带毒植物，减少侵染源。
根除杂草通常是项艰苦的工作，因为该病毒具有非常广泛的杂草寄主。
而清除作物附近一些重要的多年生或二年生杂草可以缩小病毒密度，可以减少病毒的传播。
利用一些非宿主作物（如玉米）与主栽作物的间作套种方式，可延迟病毒的初侵染。
二是杀灭农业害虫，减少病害传播媒介。
杀虫剂和矿物油喷雾剂常应用于cmv和其他以非持久性方式传播的病毒防控。
但是矿物油喷雾剂只对高株密度作物（如辣椒、番茄）有效，而对于一些低株密度作物（如哈密瓜、西瓜）来讲效果很低。
杀虫剂的使用对蚜虫的控制非常有效，但不能完全防止蚜虫以非持久方式传播病毒。
在一些易感作物上采用移动膜覆盖隔离，可以有效防止这些作物在整个生长时期的蚜虫危害，大大减少蚜虫带毒侵染的机会。
避开蚜虫高发季节后，可适当打开膜盖，以便蜜蜂等有益昆虫能够顺利为作物授粉。
三是寻找抗病毒植物新种质。
开发抗病毒作物新品种是防控cmv危害的一个既简单又有效的方法。
虽然在黄瓜和菠菜抗病毒育种上已有获得成功的例子，但相对于大多数其他作物而言，这条路还很漫长。
国内外学者试图从其他葫芦科作物品种上寻找抗病基因，但尚未取得成功。
即使找到了一些抗病基因，但同一科属作物品种之间的遗传亲和性将成为抗性基因转移的一个难于逾越的屏障。
在菠菜中存在1个单一显性抗病基因，但是当环境温度处在28 ℃以上时，该基因不起作用[9]。
来自葡萄牙的一个莴苣远亲种pi 26153（lactuca saligna）被证实对cmv特定株系具有抗性，而在现有商业栽培的莴苣品种中尚未发现有此类抗性。
在番茄的非茄科（solanum lycopersicum）近缘资源中已发现有抗、耐cmv的一些种质材料，但抗cmv的番茄品种却尚未见报道[9]。
4 存在的问题与展望黄瓜花叶病毒病害在温带、热带和亚热带地区广泛流行，是世界公认的一种重要植物病害。
该病害每年给全球作物生产造成巨大损失，一般情况下其田间发病率为20%～30%，严重时高达100%。
因此，如何研究该病害的防控技术和方法是当前摆在人们面前的一项重要课题。
近年来，国内外学者在cmv防控研究方面取得了一些进展，但尚未真正建立一套安全、高效、稳定的病毒防控技术。
化学农药可以有效杀灭蚜虫，从而在一定程度上限制或减少cmv在田间的传播。
但这些药剂的经常使用会给生态环境安全带来威胁，在生产应用上受到越来越多的限制。
而采用田间物理诱杀害虫或利用银色地膜覆盖栽培农作物等手段在一定程度上可以减少田间蚜虫数量，理论上可以降低病毒病的发生率。
培育抗病毒植物新品种是抵抗cmv的一个最为有效的手段之一，植物基因工程技术的日益成熟为抗病毒转基因育种提供了强大的技术理论支持。
黄瓜绿斑驳花叶病毒病的防控
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目 录
• 概述 • 病原与传播途径 • 诊断与识别 • 防控策略 • 防控措施 • 预防措施 • 防治建议与展望
CHAPTER 01
概述
定义与症状
定义
黄瓜绿斑驳花叶病毒病（Cucumber Green Mottle Mosaic Virus，CGMMV ）是一种由病毒引起的植物病害。
化学措施
使用化学药剂
在发病初期使用化学药剂进行防治，如使用吡虫啉、啶 虫脒等杀虫剂消灭传毒害虫，减少病毒的传播。
喷施叶面肥
喷施叶面肥可以提高植株的抗病能力，如喷施磷酸二氢 钾、硫酸锌等，有助于减轻病害的发生。
生物措施
使用生物农药
使用生物农药如病毒灵、菌毒清等，可以抑制病毒的 复制，减轻病害的发生。
水肥管理
1 2
控制湿度
合理浇水，保持土壤湿度适中，避免过湿或过干 。
平衡施肥
增施有机肥和磷钾肥，提高植株的抗病能力。
3
避免传播
不要在发病田内进行浇水或施肥操作，以免病毒 传播。
病虫害综合防治
生物防治
利用天敌和生物农药进行防治。例如使用芽 孢杆菌等生物农药进行喷洒，可以有效减少 病毒的数量。
化学防治
影响
受害植物的果实品质下降，造成经济损失；同时，CGMMV的传播也对农业生产 和生态环境构成威胁。
CHAPTER 02
病原与传播途径
病原特点
01
02
03
病毒粒子
黄瓜绿斑驳花叶病毒的粒 子为正二十面体，无包膜 ，直径约为30纳米。
基因组
该病毒的基因组为单链 RNA，长度约为3.3kb。
寄主范围
黄瓜绿斑驳花叶病毒的寄 主范围较广，包括多种葫 芦科植物，如黄瓜、西瓜 、甜瓜等。
黄瓜绿斑驳花叶病毒病防治研究进展
１ ０ ０ １ ９ ３ ；２ ．种苗健康北京市
１ ０ ０ ０ ２ ６ ）
１ ０ ０ １ ９ ３ ；３ ．农 业 部 农 药 检 定 所 ，北京
摘要
黄瓜绿斑驳花叶病毒（ Ｃ ｕ ｃ ｕ ｍｂ ｅ ｒ ｇ ｒ ｅ ｅ ｎ ｍ ｏ ｔ ｔ ｌ ｅ ｍ ｏ ｓ ａ ｉ ｃ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ，Ｃ Ｇ ＭＭＶ） 主要危 害葫芦科 作物 ， 已被世界 上许
艋 绦力
２ ０ １ ６ ， ４ ２ （ ６ ） ： ２ ９ — ３ ７
Ｐ ｌ ａ ｎ ｔ Ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ
黄瓜 绿斑 驳花 叶病 毒病 防治 研 究进展
刘华威 ， 罗来 鑫 ， 朱春 雨。 ， 梁超琼 ， 刘鹏 飞 ， 李健 强
（ １ ． 中国农业大学植物病理学系 ， 种子病 害检验 与防控北京市重点实验室 ，北京
ｃ ａ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｓ ｕ ｂ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ ｉ ａ ｌ ｙ ｉ ｅ ｌ ｄ ｌ ｏ ｓ ｓ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｌ ｏ ｗｅ ｒ ｍａ ｒ ｋ ｅ ｔ ｖ ａ ｌ ｕ ｅ ｏ ｆ ｃ ｕ ｃ ｕ ｒ ｂ ｉ ｔ ｓ ．Ｔｈ ｉ ｓ ｒ ｅ ｖ ｉ ｅ ｗ ｓ ｕ ｍｍａ ｒ ｉ ｚ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｃ ｕ ｒ ｒ ｅ ｎ ｔ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｏ ｆ ＣＧＭ Ｍ Ｖ ａ ｎ ｄ ｔ ｒ ｉ ｅ ｄ ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｎ ｏ ｖ ｅ ｌ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｓ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｇ ｉ ｅ ｓ ，ｉ ｎ ｃ ｌ ｕ ｄ ｉ ｎ ｇ ｎ ｅ ｘ ｔ — ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｉ ｎ ｇ （ ＮＧＳ ）ａ ｎ ｄ ｇ ｅ ｎ ｅ — ｅ ｄ ｉ ｔ ｉ ｎ ｇ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｆ ｏ ｒ ｖ ｉ ｒ ａ ｌ ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ。ａ ｎ ｄ ｍｉ ＲＮＡ ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ — ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｃ ｅ ｔ ｏ
辣椒抗黄瓜花叶病毒(CMV)遗传分析及ISSR分子标记筛选的开题报告
辣椒抗黄瓜花叶病毒（CMV）遗传分析及ISSR分
子标记筛选的开题报告
题目：辣椒抗黄瓜花叶病毒（CMV）遗传分析及ISSR分子标记筛选
一、选题背景和研究意义
辣椒是我国重要的经济作物之一，但由于生长期长，依赖性强，易
感病害等缺点，生产中常面临一系列挑战。
黄瓜花叶病毒（CMV）是危
害辣椒产业的主要病毒之一，该病毒具有高度的传染性，易于引起辣椒
生长发育异常、死亡等问题，严重影响了辣椒的产量和质量。
因此，本研究旨在通过对辣椒抗CMV的遗传分析，筛选出具有抗病性的基因型，并应用ISSR技术进行分子标记筛选，为辣椒的抗病育种提供科学依据，促进辣椒产业可持续发展。
二、研究方法与技术路线
1. 材料准备
本研究将选取CMV感染下的辣椒和无感染的辣椒为材料，分别提取全基因组DNA，用于后续的ISSR分子标记分析和遗传分析。
2. 遗传分析
本研究将利用PCR技术，分析辣椒在CMV感染状态下的遗传变化。
通过对PCR扩增产物的测序分析，确定CMV感染所导致的遗传变异及其对辣椒抗病性的影响。
3. ISSR分子标记筛选
本研究将选用ISSR技术对抗CMV的辣椒基因型进行分子标记分析，筛选出与抗病性相关的DNA序列，进一步验证其对辣椒抗CMV的作用及产量影响。
三、预期结果
本研究将通过遗传分析和ISSR分子标记筛选，确定抗CMV的辣椒基因型，进一步提取相关的DNA序列，为辣椒育种提供新的标记和种质资源，促进辣椒数据化育种的发展，提高辣椒产业的可持续性和经济效益。
黄瓜花叶病毒辣椒分离物侵染性克隆构建
中国农业科学 2008,41(7):1975-1982Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.07.013 黄瓜花叶病毒辣椒分离物侵染性克隆构建廖乾生，杜志游，张华荣，吴 鹏，朱丽萍，陈集双（浙江理工大学生物工程研究所，杭州 310018）摘要：【目的】鉴定引起辣椒产生褪绿黄化症状的病原物，构建侵染性克隆。
【方法】大田辣椒样品通过ELISA 检测，结合病毒外壳蛋白SDS-PAGE及病毒RNA分析，初步确定辣椒中病原物为黄瓜花叶病毒（CMV）Phy株系。
以辣椒病毒粒子RNA为模板，采用含T7启动子的不同正向引物通过RT-PCR扩增CMV-Phy全长基因组RNA1、RNA2和RNA3。
PCR产物经过双酶切后连接到pUC118载体，并分别比较5种（DH5α、HB101、JM109、LE392和NM522）感受态细胞的转化效率。
体外转录CMV-Phy的基因组cDNA克隆（pUC-P1、pUC-P2和pUC-P3）成RNA分子（P1P2P3），分析其转录效率和侵染活性。
P1P2P3与CMV的卫星RNA进行假重组，进一步确定CMV-Phy侵染性克隆的成功构建。
【结果】引起辣椒产生褪绿黄化症状病原物为CMV，携带卫星RNA；心叶烟接种辣椒病毒粒子后同样产生褪绿黄化症状。
HB101感受态细胞最适合CMV-Phy基因组转化。
CMV-Phy基因组及其卫星RNA的大小如下：RNA1为3 356 nt、RNA2为3 048 nt和RNA3为2 220 nt，卫星RNA Pz-satRNA为384 nt（序列登陆号分别为：DQ402477，DQ412731 ，DQ412732 EF363688）。
CMV-Phy的cDNA克隆体外转录在5′端添加G有利于提高转录效率，但影响其侵染活性；P1P2P3在苋色藜和心叶烟产生的症状与其病毒粒子产生的症状相一致。
黄瓜花叶病毒病防治策略研究进展
黄瓜花叶病毒病防治策略研究进展植物病毒病是危害农作物的一类重要病害，因其危害大、防治困难而有植物癌症之称。
近年来，植物病毒病在果树、蔬菜、花卉以及多种经济作物上的危害越来越严重。
大量研究证明，植物病毒病多数是由烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）引起的。
黄瓜花叶病毒能侵染1000多种单、双子叶植物，可经75种蚜虫传播，有些分离物还可通过种子传播，是寄主植物最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。
能引起多种蔬菜产生花叶、坏死、枯萎等，为害面积大。
为了减轻其在生产上的危害，多年来科研工作者尝试了多种不同方法防治CMV，提出了不同的防治策略。
本文拟对相关内容进行探讨，以寻求高效的黄瓜花叶病毒防治策略。
1黄瓜花叶病毒（CMV）概述1.1CMV分类及危害黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）属雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员。
白Doolittle和Jagge分别报道CMV是黄瓜花叶病的病原以来，各国学者相继报道了CMV的危害。
近10多年来，CMV在一些国家和地区的许多作物上造成严重危害，如引起番茄的坏死、香蕉的花叶（心腐）、豆科植物的花叶、瓜类的花叶、西番莲的死顶等。
此外，许多过去被认为是新的病毒，现已被证实为CMV新的株系。
几十年来，各国学者根据他们分离到的CMV的寄主范围及症状表现得到许多株系或分离物，迄今，全世界已报道了100多个CMV株系（如Fny、Y、O、NT9、lx、Q）或分离物。
1.2CMV微观结构及RNA组成黄瓜花叶病毒为直径约29nm的二十面体的小颗粒，颗粒分子量约为5.3×10E6，其中18%是RNA，82%是蛋白质。
CMV是单链RNA病毒，属三分体基因组，包括4个RNA片段，即RNA1～4，其分子量分别为1.01×10E6、0.89×10E6、0.68×10E6、0.33×10E6。
黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b蛋白的结构和功能的开题报告
黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b蛋白的结构和功能的开题报告一、研究背景黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）是广泛分布于全球的植物病毒，会感染多种植物，包括黄瓜、番茄、辣椒等经济作物。
CMV感染的植株表现为叶片变黄、畸形、矮化等症状，导致产量和品质下降，给农业生产带来严重的损失。
因此，研究CMV的致病机理和防治策略具有重要的意义。
黄瓜花叶病毒基因组由正链单股RNA分子组成，含有四个开放阅读框（ORF）。
其中，ORF2编码一个分子量为28 kDa的蛋白，称为黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b（2b）蛋白。
研究表明，2b蛋白能够抑制植物的基因沉默机制，干扰植物的反病毒防御反应，从而增加病毒在植物体内的复制和传播能力。
因此，2b蛋白成为研究CMV感染机制和防治的重要靶点。
二、研究内容本研究旨在揭示黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b蛋白的结构和功能。
具体研究内容如下：1. 通过生物信息学方法对CMV 2b蛋白的结构进行预测，确定其潜在功能区域，并进行跨物种序列比对，进一步确认其保守性和功能域。
2. 利用重组蛋白技术表达纯化CMV 2b蛋白，并进行蛋白质结晶试验，通过X射线晶体学分析获得其高分辨率结构，揭示其分子构象和空间结构。
3. 研究CMV 2b蛋白的功能，包括其对基因沉默机制的抑制作用、与植物宿主因子的相互作用以及其对植物的致病性等方面的研究。
三、研究意义本研究有助于深入了解黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b蛋白的结构和功能，揭示其与CMV感染机制的关系，为制定协同防治策略提供理论依据。
同时，研究结果也将为基因沉默机制的研究提供新的思路和平台。
黄瓜绿斑驳花叶病毒发生概况、检测鉴定及防治
黄瓜绿斑驳花叶病毒发生概况、检测鉴定及防治纽内姆（北京）种子有限公司齐中举（病理助理）1.黄瓜绿斑驳花叶病毒病概况黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)，为烟草花叶病毒属，是西瓜、黄瓜、南瓜等葫芦科作物上的一种毁灭性病害，具有危害严重，致病性强，防止难度大等特点。
1.1危害症状：CGMMV 侵染许多葫芦科作物，引起植物叶片斑驳、系统性花叶及果肉恶化等症状。
在黄瓜上, 最初新叶上出现黄色小斑点, 随后逐渐发展为花叶、斑驳和浓绿泡状突起等症状, 叶脉间褪色呈绿带状。
在西瓜上，初期茎端幼叶呈现淡黄色花叶，随后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化症状减轻；果实表现有浓绿圆斑，中央有坏死点，种子周围的果肉呈赤紫色水渍状，成熟时变为暗褐色且出现空洞。
在甜瓜上，受害的新叶上出现黄斑，随叶片老化症状减轻；成株侧枝的叶片呈现不定形或星状黄化叶，生长后期顶部叶片有时产生大型黄色轮斑；幼果受害后有绿色花纹，后期为绿色斑，或在绿色斑中央出现灰白色斑。
在黄瓜叶片上引起色斑、水泡及变形，使植株矮化、结果延时，果实大部分黄化或变白并产生黑绿色水疱状的坏死斑，产量损失达15%；可延缓黄瓜植株的生长发育，甚至导致不孕。
1.2发生分布：黄瓜绿斑驳花叶病毒病20世纪30年代在欧洲国家发生，60年代因黄、西瓜和瓠瓜而传入印度和日本，80年代传入台湾。
2002年中国从日本引进种苗中截获，2004年厦门从日本进口的南瓜种子上检测到CGMMV，2005年中国辽宁省盖州市感染CGMMV 在我国辽宁盖州地区造成西瓜大面积毁灭,受害面积达333 hm2，约13hm2绝收，CGMMV 现在中国部分地区已造成西瓜毁灭性的损失。
农业部发布的第788 号公告，郑重宣布将CGMMV 确定为全国农业植物检疫性有害生物，属国家三类检疫性病害。
目前，CGMMV 在中国主要分布于辽宁、河北、湖北、广东和山东，发生率达80%，河南、四川、江西、上海、新疆、陕西及宁夏等省份还未发现。
《黄瓜花叶病毒》课件
03
02
01
感染黄瓜花叶病毒的植物，其产量会大幅下降，给农业生产带来巨大的经济损失。
产量下降
感染病毒的植物，其果实品质会受到影响，如口感变差、外观畸形等，影响销售和市场竞争力。
品质下降
为了防治黄瓜花叶病毒，农民需要投入大量的人力、物力和财力，增加了防治成本。
特性
黄瓜花叶病毒具有球形或近似球形的颗粒结构，直径约为28-30纳米。它是一种单链RNA病毒，具有较高的遗传变异性，可以通过蚜虫、机械摩擦和嫁接等方式传播。
黄瓜花叶病毒最早于1934年在日本被发现，后来在世界各地均有报道。
发现
该病毒因其最初在黄瓜上引起的花叶症状而得名，英文简称CMV。
命名
黄瓜花叶病毒在世界各地均有分布，是一种非常普遍的植物病毒。
黄瓜花叶病毒可以通过多种途径传播，如蚜虫、机械摩擦和嫁接等。其中，蚜虫是最主要的传播媒介，可以在寄主植物之间转移并传播病毒。
传播方式
分布
02
CHAPTER
黄瓜花叶病毒的危害
感染黄瓜花叶病毒的植物，其叶片会出现明脉、变色、黄化等症状，严重时叶片畸形、生长受阻。
叶片症状
果实症状
生长受阻
感染病毒的植物，其果实可能会出现畸形、发育不良等症状，影响果实的品质和产量。
《瓜花叶病毒简介黄瓜花叶病毒的危害黄瓜花叶病毒的防治黄瓜花叶病毒的研究进展黄瓜花叶病毒的未来展望
01
CHAPTER
黄瓜花叶病毒简介
定义
黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus，简称CMV）是一种属于植物病毒的成员，能够感染多种植物，引起花叶症状和系统性病毒病害。
黄瓜花叶病毒研究进展
黄瓜花叶病毒研究进展摘要综述了黄瓜花叶病毒（CMV）的生物学特性、基因组、病害防控等方面的研究进展，并对国内外当前研究中存在的问题作了相关探讨。
关键词黄瓜花叶病毒；生物学特性；基因组；病害防控黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的代表性成员，为单链正义RNA（+ssRNA）病毒。
CMV能侵染包括单、双子叶植物在内的1 000多种植物，是很多农作物和观赏植物的重要毁灭性病原之一[1]。
CMV在自然界主要通过寄主植物种子或繁殖材料及昆虫传播，是目前所知的寄主最多、分布最广、最具经济危害的植物病毒[2]。
自1916年首次报道CMV是黄瓜花叶病的病原以来，国内外学者相继报道了该病毒在不同寄主上的危害[3-4]。
CMV严重抑制许多作物的正常生长，如引起黄瓜叶片花叶黄化、番茄叶片丝状畸形、香蕉花叶（心腐）、辣椒叶片斑驳畸形及顶死等，这给世界各国的农作物生产造成严重的经济损失。
根据地区分布、寄主范围及症状表现的差异，可以把该病毒划分为不同的株系（strain）。
例如，Fny、Pf、A9和LS等株系都能够侵染烟草和黄瓜，但它们在侵染茄科作物时，其症状表现存在很大的差异[5]。
近几十年来，国内外学者对该病毒进行过系统研究，特别是对该病毒病害的防控方面提出了相关见解。
本文着重介绍CMV的生物学特性、基因组、病害防控等方面的研究进展，并对当前研究中存在的问题作相关探讨。
1 生物学特性1.1 寄主症状CMV具有很宽的寄主范围，能导致绝大多数寄主发生系统侵染并表现出各种典型症状。
如生长迟缓、节间矮化、叶片斑驳黄化，甚至引起叶片畸形和果实发育不良。
例如，侵染番茄时最典型的症状是引起番茄叶片呈丝线状畸形。
但在一些少数寄主作物（如苜蓿）上却不表现出症状。
CMV侵染症状在不同作物种类、不同株龄和不同生长环境下往往表现出较大的差异。
基于VIGS技术干扰病毒RNA防控烟草黄瓜花叶病毒病
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(６):１３６~１４２ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０６.０１８收稿日期:２０２２－０７－０６基金项目:河南省烟草公司平顶山市公司科技项目(ＰＹＫＪ２０２２０７)作者简介:郭玉鸽(１９９７ )ꎬ女ꎬ河南洛阳人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向:烟草遗传育种与品质改良ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｇｕｏｙｕｇｅ３３＠１６３.ｃｏｍ通信作者:武兆云(１９７９ )ꎬ男ꎬ安徽马鞍山人ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事烟草遗传育种与品质改良研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｗｕｚｈａｏｙｕｎ＠ｈｅｎａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ阎海涛(１９８４ )ꎬ男ꎬ河南荥阳人ꎬ博士ꎬ农艺师ꎬ从事土壤改良及烟草栽培研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｈｔ５６５７＠１６３.ｃｏｍ基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病郭玉鸽１ꎬ张倩１ꎬ杨惠娟１ꎬ李俊营２ꎬ常栋２ꎬ张富生２ꎬ武兆云１ꎬ阎海涛２ꎬ杨铁钊１(１.河南农业大学烟草学院ꎬ河南郑州㊀４５０００２ꎻ２.河南省烟草公司平顶山市公司ꎬ河南平顶山㊀４６７０００)㊀㊀摘要:黄瓜花叶病毒(ＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＣＭＶ)引起的花叶病是烟草上的重要病害ꎮ本试验通过病毒诱导基因沉默技术(ｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＶＩＧＳ)构建靶向沉默ＣＭＶ－１ａ㊁ＣＭＶ－２ａ㊁ＣＭＶ－ＭＰ和ＣＭＶ－ＣＰ的ＶＩＧＳ载体ꎬ测定基因沉默后ＣＭＶ相对表达量㊁ＣＭＶ病毒浓度和ＴＲＶ相对表达量ꎬ并对ＶＩＧＳ载体对ＣＭＶ的防治效果进行评价ꎮ结果表明ꎬ试验建立的ＶＩＧＳ载体能够有效导入烟株ꎻ沉默ＣＭＶ－２ａ的处理ＣＭＶ相对表达量最低ꎬ基因沉默效率最高ꎬ为４６.２５％ꎻ接种病毒３０ｄ后ＣＭＶ－２ａ处理的病毒浓度最低ꎬ仅为对照的７２.８％ꎬＴＲＶ载体的相对表达量显著高于其他处理ꎻ沉默ＣＭＶ－２ａ的处理发病时间推迟ꎬ病情指数最低ꎬ防治效果最好ꎮ本研究建立的ＣＭＶ－２ａＶＩＧＳ体系能够有效沉默外源侵入的ＣＭＶ基因表达ꎬ抑制ＣＭＶ在烟株内的传播ꎬ为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法ꎮ关键词:ＶＩＧＳ技术ꎻ干扰病毒ＲＮＡꎻ烟草ꎻ黄瓜花叶病毒病中图分类号:Ｓ４３５.７２:Ｑ７８９㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０６－０１３６－０７ＣｏｎｔｒｏｌｏｆＴｏｂａｃｃｏＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓＤｉｓｅａｓｅｂｙＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＶｉｒａｌＲＮＡＢａｓｅｄｏｎＶＩＧＳＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＧｕｏＹｕｇｅ１ꎬＺｈａｎｇＱｉａｎ１ꎬＹａｎｇＨｕｉｊｕａｎ１ꎬＬｉＪｕｎｙｉｎｇ２ꎬＣｈａｎｇＤｏｎｇ２ꎬＺｈａｎｇＦｕｓｈｅｎｇ２ꎬＷｕＺｈａｏｙｕｎ１ꎬＹａｎＨａｉｔａｏ２ꎬＹａｎｇＴｉｅｚｈａｏ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｏｂａｃｃｏꎬＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＺｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＰｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎＢｒａｎｃｈｏｆＨｅｎａｎＴｏｂａｃｃｏＣｏｍｐａｎｙꎬＰｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎ４６７０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｍｏｓａｉｃｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂｙｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ(ＣＭＶ)ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｄｉｓｅａｓｅｏｆｔｏｂａｃｃｏ.Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｕｓｅｄｔｈｅｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ(ＶＩＧＳ)ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓｔａｒｇｅｔｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇＣＭＶ￣１ａꎬＣＭＶ￣２ａꎬＣＭＶ￣ＭＰａｎｄＣＭＶ￣ＣＰ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣＭＶꎬｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣＭＶｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＴＲＶａｆｔｅｒｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄꎬａｎｄｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓａｇａｉｎｓｔＣＭＶｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓｅｓ￣ｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｃｏｕｌｄｂｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｓｉｌｅｎｃｉｎｇＣＭＶ￣２ａｈａｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣＭＶａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｓ４６.２５％.Ａｆｔｅｒ３０ｄａｙｓｏｆｖｉｒｕｓｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎬｔｈｅＣＭＶ￣２ａｔｒｅａｔｍｅｎｔｈａｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｖｉｒｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬｏｎｌｙ７２.８％ｏｆｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＴＲＶｖｅｃｔｏｒｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｔｈｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ.ＳｉｌｅｎｃｉｎｇＣＭＶ￣２ａｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｅｌａｙｅｄｔｈｅｏｎｓｅｔｔｉｍｅａｎｄｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｉｎｄｅｘｗａｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔꎬｓｏｉｔｈａｄｔｈｅｂｅｓｔｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔ.ＴｈｅＣＭＶ￣２ａＶＩＧＳｓｙｓｔｅｍｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｓｉ￣ｌｅｎｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓＣＭＶｇｅｎｅｓꎬａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＣＭＶｉｎｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｏｂａｃｃｏｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＶＩＧＳｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎻＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｖｉｒａｌＲＮＡꎻＴｏｂａｃｃｏꎻＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ㊀㊀由黄瓜花叶病毒(ＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＣＭＶ)引起的花叶病是烟草上的重要病害ꎬ严重影响烟叶质量[１ꎬ２]ꎮ黄瓜花叶病毒是雀麦花叶病毒科(Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ)黄瓜花叶病毒属(Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒ￣ｕｓ)的典型成员ꎬ为三分体正义单链ＲＮＡ病毒[３]ꎬ编码５种蛋白[４]ꎮＲＮＡ１编码１ａ复制酶蛋白[５]ꎻＲＮＡ２的５ᶄ端编码２ａ复制酶蛋白ꎬ３ᶄ端编码２ｂ蛋白[６]ꎮ前人研究发现植物受ＣＭＶ侵染后的症状表现是由１ａ和２ａ复制酶蛋白共同决定的ꎬ二者具有协同作用[７]ꎮＲＮＡ３的５ᶄ端编码胞间运动蛋白(ＭＰ)ꎬ３ᶄ端编码外壳蛋白(ＣＰ)ꎬ与病毒扩散㊁长距离运输和包被作用有关[８]ꎮ目前生产上防治烟草黄瓜花叶病毒病通常以化学防治为主ꎬ容易造成药剂残留和环境污染等问题[９ꎬ１０]ꎮ培育抗病品种也是防治烟草黄瓜花叶病的有效方式之一[１１]ꎬ但至今还没有从烟草上克隆出ＣＭＶ抗性基因[１２]ꎬ育种工作进展缓慢ꎬ而生物防治技术已经逐渐成为病害防治的新方法[１３]ꎮ病毒诱导基因沉默(ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉ￣ｌｅｎｃｅꎬＶＩＧＳ)是一种对植物进行反向遗传操作的技术[１４]ꎬ是植物防御机制的表现[１５]ꎮ农杆菌介导的ＶＩＧＳ技术通过农杆菌将携带目的基因片段的病毒载体转移到植物细胞中[１６]ꎬ介导靶向同源基因的ｍＲＮＡ降解ꎬ引起目的基因沉默[１７]ꎮ烟草脆裂病毒(ＴｏｂａｃｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓꎬＴＲＶ)载体是使用最广泛的ＶＩＧＳ载体ꎬ具有沉默效率高㊁持久性长㊁不会对宿主造成明显伤害等优点[１８]ꎮ目前ＶＩＧＳ技术多用于基因功能鉴定和抗病抗虫[１９ꎬ２０]研究上:如龚攀[２１]构建的甜菜ＶＩＧＳ体系验证了抗旱相关基因功能ꎻ刘天波等[２２]沉默马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系外壳蛋白基因有效防治马铃薯Ｙ病毒病ꎮ有研究表明ꎬＣＭＶ在不同作物中起关键作用的基因是不同的[２３]ꎮ因此本研究根据ＣＭＶ基因组及其编码蛋白的组成特征ꎬ构建靶向相关基因片段的ＴＲＶ载体ꎬ比较烟株接种ＶＩＧＳ载体后对ＣＭＶ的抗性ꎬ以期筛选适用于大田防治烟草黄瓜花叶病的最佳ＶＩＧＳ体系ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料试验于２０２２年４ ５月进行ꎮ参试烤烟品种为中烟１００ꎬ由河南农业大学烟草学院育种实验室提供ꎮｐＴＲＶ２载体购自武汉淼灵生物科技有限公司ꎬ根癌农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司ꎮＣＭＶ病毒叶片由河南农业大学烟草学院育种实验室提供ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀引物设计㊀根据已测定的ＣＭＶ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＧＣＡ＿０００８６４７４５.１)序列ꎬ选取适合用来构建ＶＩＧＳ载体的片段ꎬ使用Ｏｌｉｇｏ７软件设计特异性引物ꎬ其序列如表１所示ꎮ㊀㊀表１㊀本研究使用的引物序列引物名称引物序列(５ᶄ－３ᶄ)扩增产物大小(ｂｐ)ＣＭＶ－１ａ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＧＣＴＧＣＧＧＡＴ￣ＴＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡ６８６ＣＭＶ－１ａ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＴＣＣＡＴＣ￣ＣＡＣＧＣＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＣＭＶ－２ａ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＴＡＡＡ￣ＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＡＧＡＧ５５３ＣＭＶ－２ａ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＡＡＴＣＴＣＴ￣ＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＴＣＡＣＭＶ－ＭＰ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＧＧＴＣＧＴＡＴＴ￣ＧＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴ３０３ＣＭＶ－ＭＰ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＡＡＣＴＧＴＴＴＣ￣ＣＡＴＡＧＧＡＣＡＡＴＣＡＴＡＣＧＣＭＶ－ＣＰ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＡＡＧＡＣＧＴ￣ＴＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣ３６４ＣＭＶ－ＣＰ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＧＴＡＣＣＧＧＴ￣ＧＡＧＧＣＴＣＣＧＴＣＣＴＲＶ２－ＦＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＴＴ￣ＧＣＣ７４４ＴＲＶ２－ＲＧＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＴＣＴ￣ＣＡＴＣ㊀㊀注:下划线部分为酶切位点ꎬ所用限制性内切酶为ＥｃｏＲⅠ㊁ＢａｍＨⅠꎬ酶切位点前的小写字母为保护碱基ꎮ１.２.２㊀ＶＩＧＳ载体的构建㊀利用ＴＲＩｚｏｌ法提取感染了ＣＭＶ病毒的烟叶总ＲＮＡꎬ参照北京全式金７３１㊀第６期㊀㊀㊀㊀郭玉鸽ꎬ等:基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病生物技术有限公司ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＯｎｅ－ＳｔｅｐｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒＭｉｘ说明书反转成ｃＤＮＡꎮ以获得的ｃＤＮＡ为模板ꎬ按照表１引物利用诺唯赞生物技术有限公司的Ｐ５０５高保真酶进行ＰＣＲ扩增ꎮ扩增体系:２ˑＰｈａｎｔａＭａｘＢｕｆｆｅｒ２５μＬꎬｄＮＴＰＭｉｘ(１０ｍｍｏｌ/Ｌ)１μＬꎬＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μＬꎬ上下游引物(１０μｍｏｌ/Ｌ)各２μＬꎬｃＤＮＡ(２０μｍｏｌ/Ｌ)模版１μＬꎬｄｄＨ２Ｏ补至５０μＬꎮ反应条件:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９５ħ变性１５ｓꎬ６８ħ退火１５ｓꎬ７２ħ延伸３０ｓꎬ３５个循环ꎻ７２ħ终延伸５ｍｉｎꎬ琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收目的片段ꎮ对ｐＴＲＶ２空载体质粒进行ＥｃｏＲⅠ/ＢａｍＨⅠ双酶切后获得线性化载体ꎮ将扩增产物与线性化载体进行连接ꎬ随后转化至大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎮ将测序正确的单克隆菌株扩繁并提取质粒保存ꎮ１.２.３㊀重组表达载体转化㊀参照上海唯地生物技术有限公司的农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞的使用说明书ꎬ将重组表达载体ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ和ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ转化农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞ꎮ将菌液均匀涂抹在ＬＢ(含有浓度为２５ｍｇ/ｍＬ利福平和５０ｍｇ/ｍＬ卡那霉素)固体培养基上ꎬ２８ħ下倒置培养４８ｈꎻ挑取单菌落经ＰＣＲ扩增后ꎬ使用琼脂糖凝胶电泳检测验证后分别扩繁ꎮ１.２.４㊀农杆菌转化烟草㊀将ｐＴＲＶ１㊁ｐＴＲＶ２㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ和ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ分别接种到ＬＢ液体培养基上ꎬ２８ħ㊁２００ｒ/ｍｉｎ过夜培养后ꎬ调整浓度ＯＤ６００值为０.８~１.０ꎬ用ｐＴＲＶ１分别与ｐＴＲＶ２㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ和ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ等比混合ꎬ离心后弃上清液ꎬ将沉淀重悬于等体积的侵染缓冲液(５０ｍｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ２㊁５０ｍｍｏｌ/ＬＭＥＳ㊁０.１ｍｍｏｌ/Ｌ乙酰丁香酮)中ꎮ选取长势均匀一致的六叶一心烟苗ꎬ用１ｍＬ注射器注射侵染液于烟株嫩叶背面ꎬ每株烟注射２片叶ꎬ每片叶注射１ｍＬꎮ１.３㊀试验设计共设置６个处理ꎬ分别为ＣＫ:不注射烟株ꎻ空载:注射接种含ｐＴＲＶ２的侵染液(空载体对照)ꎻＣ１:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ的侵染液ꎻＣ２:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ的侵染液ꎻＣ３:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ的侵染液ꎻＣ４:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ的侵染液ꎮ每个处理注射接种２０株烟ꎬ每株烟接种２ｍＬꎬ接种载体后１４ｄ各处理均用金刚砂摩擦接种ＣＭＶ病毒ꎮ１.４㊀测定指标１.４.１㊀ＶＩＧＳ载体接种效果及基因沉默效果的测定㊀在接种ＶＩＧＳ载体后１０ｄꎬ各处理随机选择两株烟ꎬ取新长出的叶片ꎬ充分消毒后提取ＲＮＡꎬ按照表１中ＴＲＶ２扩增引物进行ＲＴ－ＰＣＲ检测ꎮ在接种病毒后７㊁１４㊁２１ｄ时ꎬ各处理分别选择３株烟ꎬ取心叶向下第二片叶ꎬ充分消毒后提取ＲＮＡꎬ反转录成ｃＤＮＡꎬ以烟草２６ＳｒＲＮＡ为内参基因ꎬ根据ＧｅｎＢａｎｋ发布的相关基因序列设计扩增引物(表２)ꎮ按照ＱｕａｎｔｑＲＴ－ＰＣＲｋｉｔ(ＳＹＢＲＧｒｅｅｎꎬＴＩＡＮＧＥＮ公司)使用说明在ＳｔｅｐＯｎｅＴＭＲｅ￣ａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ仪(Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司)上进行ｑＲＴ－ＰＣＲ检测ꎮ根据已得到的Ｃｔ值ꎬ采用２－ΔΔＣｔ法分析ＣＭＶ和ＴＲＶ基因的相对表达量ꎮ基因沉默效率(％)计算公式:(对照组ＣＭＶ累积量－处理组ＣＭＶ累积量)/对照组ＣＭＶ累积量ˑ１００ꎮ㊀㊀表２㊀ｑＲＴ－ＰＣＲ所用引物引物名称引物序列(５ᶄ－３ᶄ)ＣＭＶ－ＦＡＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＧＴＡＧＧＣＭＶ－ＲＧＡＡＴＧＣＧＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＲＶ－ＦＴＧＴＴＴＣＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴＴＲＶ－ＲＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡ２６ＳｒＲＮＡ－ＦＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＧＧＧＴＴＣ２６ＳｒＲＮＡ－ＲＴＣＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧ１.４.２㊀病毒浓度的测定㊀在接种病毒后３０ｄꎬ各处理选择发病情况一致的３株烟ꎬ取心叶向下第二片叶ꎬ液氮速冻后保存于冰箱ꎬ使用黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)测定烟株内ＣＭＶ病毒浓度ꎮ１.４.３㊀发病情况的测定㊀在接种病毒后第７天观察发病情况ꎮ根据«烟草病虫害分级及调查方法»(ＧＢ/Ｔ２３２２２ ２００８)以株为单位进行病级鉴定ꎬ根据下列公式计算发病率㊁病情指数和防治效果ꎮ发病率(％)＝发病株数/调查总株数ˑ１００㊀ꎻ８３１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀病情指数＝(Σ各级病株数ˑ病级代表值)/(调查总株数ˑ最高病级代表值)ˑ１００㊀ꎻ防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数ˑ１００㊀ꎮ１.５㊀数据分析采用ＳＰＳＳ１６.０软件对数据进行差异显著性分析(Ｄｕｎｃａｎᶄｓ)ꎬ采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２００７整理分析数据ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＶＩＧＳ载体构建由图１可知ꎬＰＣＲ扩增得到的基因片段大小与表１一致ꎮ分别将这些基因片段同ｐＴＲＶ２的线性化载体相连接ꎬ获得对应的表达载体ꎬ将测序正确的表达载体转化农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞ꎮＡ:ＣＭＶ－１ａ的扩增产物ꎻＢ:ＣＭＶ－２ａ的扩增产物ꎻＣ:ＣＭＶ－ＭＰ的扩增产物ꎻＤ:ＣＭＶ－ＣＰ的扩增产物ꎻＭ:２０００＋ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１~６:ＰＣＲ扩增产物ꎮ图１㊀目的基因的ＰＣＲ扩增２.２㊀ＶＩＧＳ载体接种效果以ＴＲＶ２－Ｆ/ＴＲＶ２－Ｒ为引物ꎬ进行ＲＴ－ＰＣＲ检测(图２)ꎬ产物大小约为７４４ｂｐꎬ说明ＶＩＧＳ载体成功导入烟株ꎮＭ为ＤＬ２０００ＭａｒｋｅｒꎻＣ１:接种ＣＭＶ－１ａ载体ꎻＣ２:接种ＣＭＶ－２ａ载体ꎻＣ３:接种ＣＭＶ－ＭＰ载体ꎻＣ４:接种ＣＭＶ－ＣＰ载体ꎮ图２㊀ＶＩＧＳ载体接种烟株后的ＲＴ－ＰＣＲ检测２.３㊀基因沉默效果分析从图３可以看出ꎬ空载体处理的ＣＭＶ相对表达量在接种病毒后７ｄ和２１ｄ与对照相比有一定程度的降低ꎮ接种病毒７ｄ后ꎬＣ２处理的ＣＭＶ相对表达量最低ꎬ基因沉默效率最高ꎬ为４６.２５％ꎻ接种病毒１４ｄ后ꎬ空载体处理的病毒相对表达量较对照有一定程度的升高ꎬＣ２和Ｃ３处理的病毒相对表达量均显著低于对照ꎬ基因沉默效率分别为３９.３８％和２６.２４％ꎻ接种病毒２１ｄ后ꎬ接种载体的处理ＣＭＶ相对表达量均显著低于对照和空载体处理ꎬＣ２处理基因沉默效率仍最高ꎬ为３６.８％ꎬＣ４处理次之ꎮ柱上不同小写字母表示不同接种天数不同处理间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ图３㊀接种病毒后ＣＭＶ相对表达量从图４可以看出ꎬＴＲＶ相对表达量不同处理间差异显著ꎬＣ２处理的ＴＲＶ表达量显著高于空９３１㊀第６期㊀㊀㊀㊀郭玉鸽ꎬ等:基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病载体处理ꎬＣ４次之ꎬＣ１最少ꎮ２.４㊀基因沉默后病毒浓度接种病毒３０ｄ后ꎬ各处理ＣＭＶ浓度表现出与ＣＭＶ相对表达量相似的变化趋势ꎬＣ２㊁Ｃ３㊁Ｃ４处理的ＣＭＶ浓度均显著低于对照和空载体处理ꎮ其中Ｃ２处理的病毒浓度最低ꎬ仅为对照的７２.８％ꎻＣ４次之ꎬ病毒浓度为对照的８６.５％ꎻＣ３处理为对照的９１.３％(图５)ꎮ柱上不同小写字母表示不同处理间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎬ下同ꎮ图４㊀接种病毒后ＴＲＶ相对表达量图５㊀接种病毒后３０ｄＣＭＶ浓度变化２.５㊀基因沉默后抗病效果分析由表３可知ꎬ发病初期Ｃ２处理的发病率㊁病情指数最低ꎬ防治效果最好ꎻＣ４处理次之ꎻ空载体的发病情况略轻于对照ꎮ发病高峰期ꎬ除Ｃ２处理发病率为９５％外ꎬ其它处理的发病率均为１００％ꎬＣ２的病情指数最低ꎬ防治效果最好ꎮ㊀㊀表３㊀不同处理的发病情况处理发病初期发病率(％)病情指数防治效果(％)发病高峰期发病率(％)病情指数防治效果(％)ＣＫ１００.０６３.３１００.０７２.０空载体８５.７５０.８１００.０６６.０Ｃ１８４.２３８.６３９.１１００.０６２.０１３.９Ｃ２４０.０１６.７７３.７９５.０４１.０４３.１Ｃ３８５.０４５.０２８.９１００.０５６.０２２.２Ｃ４６５.０２８.３５５.３１００.０４８.０３３.３３㊀讨论Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等[２４]将马铃薯Ｙ病毒蛋白酶基因片段转入烟草中ꎬ获得抗马铃薯Ｙ病毒的转基因烟草ꎮ程英豪等[２５]将黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)外壳蛋白转入烟草ꎬ获得的转基因烟草对ＣＭＶ抗性增强ꎮ目前烟草的大多数抗病毒研究都是通过将病毒的外壳蛋白基因导入烟草来提高抗性[２６ꎬ２７]ꎬ该过程会产生病毒蛋白ꎬ因此其安全性存在争议[２８]ꎮ病毒诱导的基因沉默(ＶＩＧＳ)属于转录后水平的基因沉默(ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇꎬＰＴＧＳ)ꎬ利用植物固有的ＲＮＡ干扰和病毒免疫应答机制[２９]ꎬ避免了翻译为蛋白的安全性问题ꎮ目前ＶＩＧＳ技术已成功应用到病虫害防治中ꎬ也被称为寄主诱导的基因沉默(ｈｏｓｔ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＨＩＧＳ)ꎮＮｏｗａｒａ等[３０]首次发现ꎬ将病原体基因导入病毒载体并感染寄主植物后ꎬ寄主植物细胞中会产生ｄｓＲＮＡꎬ并在病原体感染寄主时进入病原体中ꎬ从而引发病原体发生ＰＴＧＳꎮ前人将线虫基因片段导入ＴＲＶ载体后侵染拟南芥ꎬ成功抑制了根部寄生线虫体内目标基因的表达[３１]ꎮ基因沉默的关键是找到起关键作用的靶标基因ꎮＣＭＶ的１ａ和２ａ蛋白共同组成ＲＮＡ聚合酶ꎬ并与寄主因子结合形成复合物ꎬ在病毒的复制中起作用[３２]ꎮ位于胞间连丝的胞间运动蛋白(ＭＰ)参与了ＣＭＶ的胞间运转和系统运转[３３]ꎮ外壳蛋白(ＣＰ)是一个多功能蛋白ꎬ其主要功能是组装病毒ꎬ此外该蛋白还是关键的致病因子ꎬ参与复制㊁翻译㊁运动㊁蚜传等多个过程[３４]ꎮ由于ＣＭＶ在不同作物中起关键作用的基因不同ꎬ因此本研究分别在ＣＭＶ的４个关键蛋白上构建ＶＩＧＳ载体ꎮ本研究建立的ＶＩＧＳ体系中ＣＭＶ－２ａ(Ｃ２)的基因沉默效果最好ꎬ接种病毒后７ｄ基因沉默效率最高ꎬ病毒累积量最低ꎮ这与前人的研究结果相似:将ＣＭＶ的２ａ基因转化入烟草ꎬ获得的烟草植株发病率降低ꎬ发病时间推迟[３５]ꎮ此外ꎬ空载体处理的ＣＭＶ累积量与对照相比也有所下降ꎬ接种病毒后２１ｄ达到显著性差异ꎮ前人研究认为病毒是植物的应激因素ꎬ推测接种空载体后引起０４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀了植物一系列的防御反应[３６]ꎬ抑制了ＣＭＶ病毒在烟株内的传播ꎮ接种病毒３０ｄ后ꎬＣ２处理的ＣＭＶ病毒浓度最低ꎬ即ＣＭＶ－２ａＶＩＧＳ载体对ＣＭＶ的抑制作用最好ꎬ且ＴＲＶ载体的含量在各处理中最高ꎮＣ２处理发病初期的发病率最低ꎬ仅为对照的４０％ꎬ发病时间推迟ꎬ有效抑制了ＣＭＶ在烟株内的传播ꎮ通过ＶＩＧＳ技术沉默ＣＭＶ－２ａ基因可以很好地防治烟草黄瓜花叶病ꎬ下一步将进行大规模田间试验ꎬ为后期大田应用提供理论基础ꎮＶＩＧＳ技术具有成本低㊁方法操作简单等优点[３７]ꎬ并且对植物无伤害ꎬ对环境无污染ꎬ是一种具有较好应用前景的方法ꎮ然而温度是限制ＶＩＧＳ技术应用的主要因素[３８]ꎬ因此开发出耐高温的载体是ＶＩＧＳ技术未来需要努力的重点和方向ꎮ４㊀结论本研究建立的ＣＭＶ－２ａＶＩＧＳ体系能够有效沉默外源侵入的ＣＭＶ基因的表达ꎬ基因沉默效率高达４６.２５％ꎬ有效抑制了ＣＭＶ在烟株内的传播ꎬ发病时间推迟ꎬ防治效果最好ꎬ为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀张俊.我国不同生态区烟草病毒病的分布与检测技术研究[Ｄ].荆州:长江大学ꎬ２０１８.[２]㊀李正风ꎬ刘勇ꎬ夏玉珍.黄瓜花叶病毒及抗病转基因烟草研究进展[Ｊ].生物技术ꎬ２００６(５):８０－８２. 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