蚕豆病的设计性试验
G6PD缺乏症设计性实验
初步判断
1天前食用新鲜蚕豆
据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情 况——遗传性
恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色 苍白脉搏150次/分，血压 80/60mmHg，血压下降，呼吸40次 /分，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍 白，皮肤及巩膜黄染，尿蛋白（++）血的证据
正常参值：红细胞数 4.0～5.5× 10^12 /L ，血 红蛋白 110～160g/L ，而此时红细胞破裂产生全 利用多聚酶链式反应方法(PCR)扩增人葡萄糖6磷酸脱氢 酶突变热点基因片段，采用单链构象多态性(SSCP)技术 身溶血性反应，红细胞大量破裂释放出血红蛋白， 对扩增片段进行分析，用PCR直接测序以确定突变的基 因此患者红细胞 为1.98×1012/L，有明显下降；由 因位点。 于红细胞破裂，血浆游离血红蛋白显著增高，超过 结合珠蛋白的量和肾小管再吸收功能，出现酱油色 的血红蛋白尿，而血红蛋白53g/L，降低 红细胞大量破坏，在单核-吞噬细胞系统产生胆红 素过多，超过了肝细胞摄取、转化和排泄胆红素的 能力，造成血液中未结合胆红素浓度明显增高，发 生溶血性黄疸,皮肤及巩膜黄染 ，尿胆红素(－) 。肝 对胆红素的摄取、转化、排泄增多，过多胆红素进 入胆道系统，肠肝循环增多，使得尿中尿胆原和尿 胆素含量增多，故尿胆素原(+)
正常.红细胞数 4.0～5.5×10^12 /L ，血红蛋 白 120～160g/L 患者.红细胞 1.98×10^12 /L，血红蛋白53g/L 正常. 血清总胆红素1.71~17.7μmol/L 结合胆 红素1.7~6.8μmol/L，未结合胆红素 10.26±6.84μmol/L 患者. 溶血清总胆红素85.5μmol/L 结合胆红 素13.7μmol/L，未结合胆红素71.8μmol/L，皮 肤及巩膜黄染 (溶血性黄疸）
蚕豆病等
蚕豆病在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。
G-6-PD有保护正常红细胞免遭氧化破坏的作用，新鲜蚕豆是很强的氧化剂，当G-6-PD缺乏时则红细胞被破坏而致病。
该病通过性联不全显性遗传，G-6-PD基因在X染色体上，病人大多为男性，男女之比约为7∶1，在生吃蚕豆后数小时至数日（1～3天）内突然发热、头晕、烦躁、恶心，尿呈酱油样或葡萄酒色，一般发作2～6天后能自行恢复，但重者若不及时抢救，会因循环衰竭危及生命。
可通过病史和高铁血红蛋白还原试验（还原率大于75％），特别是荧光点试验诊断。
一旦确诊，应立即停吃生蚕豆，输血，输液，碱化尿液，防止急性肾功能衰竭。
毒理红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）有遗传缺陷者在食用青鲜蚕豆或接触蚕豆花粉后皆会发生急性溶血性贫血症——蚕豆病。
致病机制尚未十分明了，但已知有遗传缺陷的敏感红细胞，遇蚕豆中某种因子，发生急性血管内溶血所致。
临床表现：早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。
与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾大。
严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。
诊断 1. 有进食青蚕豆或吸入蚕豆花粉史。
2. 临床特点①潜伏期数小时至48小时。
②中毒表现：早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。
③实验检查：高铁血红蛋白还原试验（MHb）正常人还原率>75%(比色法)，蚕豆病患者MHb还原率31%～74%（杂合子遗传者），还原率<30%（纯合子型）；血中含变性珠蛋白小体（赫恩兹小体）可高于5%以上（正常为0～0.28%）。
急救处理1. 人工催吐。
蚕豆抗病性鉴定报告单
蚕豆抗病性鉴定报告单
报告人：XXX
鉴定对象：蚕豆样本A
鉴定目的：测试蚕豆抗病性能，评估其抗病能力。
鉴定方法：
1. 采集样本A蚕豆株苗，并观察植株生长情况。
2. 鉴定样本A蚕豆株苗的叶片表面是否存在病斑。
3. 鉴定样本A蚕豆株苗是否存在病斑蔓延现象。
4. 对病斑进行病菌分离鉴定，确定病原菌种类。
鉴定结果：
1. 样本A蚕豆株苗生长状况良好，无明显病状。
2. 样本A蚕豆叶片表面无病斑或其他病征。
3. 样本A蚕豆株苗未出现病斑蔓延现象。
4. 经病原菌分离鉴定，样本A蚕豆未检测到任何病原菌。
结论：
样本A蚕豆具有较高的抗病能力，表现出良好的生长状况和无病斑的叶片，同时未检测到任何病原菌的存在。
鉴定人：XXX
日期：YYYY年MM月DD日。
蚕豆病的基因检测方法
一、检测目的基因G6PD基因定位于X染色体长臂2区8带ⅶ因子及红-绿色盲基因之间（Xq28）,长18Kb，中国人G6PD基因目前依法显得突变种类很多，但能引起题目中所诉临床症状的突变点可能是G1376Ｔ和G1388A点突变（G6PD基因含13个外显子和12个内含子，编码515个氨基酸。
G6PD cDNA1388、cDNA1376同属第12外显子，相距仅12个核苷酸，突变结果使459和463位的精氨酸分别被亮氨酸和组氨酸替代）二、检测方法（一）. ARMS检测法,具体步骤如下：1. 临床实验室检查：（1）确定贫血程度［3］；（2）根据急性溶血的临床体征和既往史进行有关溶血的实验室检查，以排除其他因素所致的溶血。
（3）G6PD活性测定，酶活性单位以每克Hb含多少国际单位来表示（IU/g），正常值为4～7 IU/g。
2.基因检测：DNA制备：按常规法，蛋白酶K消化，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，无水乙醇沉淀DNA，TE溶解。
PCR引物设计：ARMS法试剂盒,引物序列为：上游引物1388L2：5′GACCTGACCTACGGCAACAGATAC3′下游引物1388M2：5′GGTGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT3′1376M：5′TGAAAATACGCCAGGCCTCAA 3′1388L2和1388M2特异性扩增G6PD基因第12外显子cDNA1388（G→A）突变，扩增出361bp片段，而1388L2和1376M扩增cDNA1376（G→T）突变，扩增出345bp片段。
基因扩增：30 μl聚合酶链反应含基因组DNA 1.0 μg，10×反应缓冲液3.0 μl，dNTPs（2 mmol/L）3.0 μl，5′上游引物和3′下游引物各20 ng，内对照引物40 ng。
反应条件为97℃变性7分钟，在85℃下加1.5U GD Taq酶后，进入热循环。
循环条件为：94℃30秒，59℃45秒，72℃50秒，共25个循环，72℃继续保温7分钟。
生化实验期末蚕豆病设计性实验报告
实验流程
G6PD荧光斑点试验
2.将上液置于37℃水浴10min ，再取一小滴滴于滤 纸上（第二斑点）→实验组 ；
3.取试管，加10μl全血+100μl反应液，混匀，取一滴 于滤纸上（第一斑点 ）→作为对照；
实验流程
计算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =△A/min×1000/6.22×1020/20× Hb(gL-1)
△A/min:每min吸光度的平均变化值 1000/6.22:为微摩尔消光系数 1020/20:总容量与溶血液的量之比；
红细胞G6PD活性测定
结果分析
G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以 上即可作出诊断
红细胞G6PD活性测定
G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法 )
试管
对照管
测定管
NADP液（ml）
Tris液（ml）
氯化镁液（ml）
蒸馏水（ml）
G6P液（ml）
37℃预热
溶血液（μl）
20
20
实验流程
立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37℃恒温， 每分钟观察1次，记录吸光度的变化
红细胞G6PD活性测定
实验原理
实验原理：基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是 利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟 在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次）， 求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内 NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。
方法：①WHO推荐的Zinkham;②NBT定量法等
G6PD荧光斑点试验
蚕豆病实验设计PPT课件
未来研究方向
深入研究蚕豆病的分子机制，探索更 多与疾病发病相关的基因和分子。
加强国际合作与交流，共同推进蚕豆 病的研究进展。
开展临床试验，验证实验设计的可行 性和有效性，为临床治疗提供更加可 靠的依据。
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治疗
对于蚕豆病患者，一旦出现症状，应立即停止食用蚕豆或接触氧化性药物，并 给予适当的对症治疗，如输血、使用抗氧化剂等。预防是关键，避免诱发因素 是减少蚕豆病发作的重要措施。
02 实验设计思路
实验目的
探究蚕豆病发病机制
通过实验了解蚕豆病发病过程中的分子机制和细胞反应。
寻找治疗蚕豆病的有效方法
通过实验研究，寻找可能的治疗蚕豆病的有效药物或方案。
实验步骤
01
02
03
04
步骤1
准备实验材料和设备，包括红 细胞样本、不同浓度的氧化剂
等。
步骤2
将红细胞样本分为实验组和对 照组，实验组加入不同浓度的
氧化剂，对照组不加。
步骤3
观察并记录实验组和对照组红 细胞在不同时间点的形态和数
量变化。
步骤4
对实验结果进行分析和总结， 得出结论。
03 实验材料与方法
现出明显的优势。
实验组内部的不同处理效果
02
实验组内不同处理方式之间也存在差异，某些处理方式的效果
优于其他处理方式。
对照组内部的一致性
03
对照组内部的数据较为一致，没有出现明显的波动或差异。
结果分析
实验组优势的原因分析
对实验组表现出色的原因进行分析，可能是由于实验设计的某些 特定因素或实验过程中的细节控制所致。
本研究通过实验设计，探讨了 蚕豆病发病机制及治疗策略， 为临床治疗提供了理论依据。
生化实验期末蚕豆病设计性实验报告课件
氧化应激
在蚕豆病患者体内，由于缺乏G6-PD，红细胞无法有效应对氧化 应激，导致红细胞膜损伤和溶血 。
蚕豆病的病理生理
溶血性贫血
由于红细胞膜损伤和溶血，蚕豆病患 者会出现溶血性贫血的症状，如黄疸 、贫血、肝脾肿大等。
我们采用了生化实验方法，通过测定蚕豆 病患者和健康人群的G6PD酶活性，对比分 析两组数据，得出结论。
实验结果
数据分析
实验结果表明，蚕豆病患者的G6PD酶活性 显著低于健康人群，这与预期结果一致。
我们对实验数据进行了统计分析，得出了 具有统计学意义的结论。
实验中遇到的问题及解决方案
问题1
部分实验数据出现异常值。
验结果的实用性和应用前景。
结论总结
总结实验结果，得出明确的结论， 指出实验的局限性和不足之处，提 出改进和完善的建议。
结果应用展望
探讨实验结果在实践中的应用前景 和价值，为相关领域的研究和实践 提供参考和借鉴。
05
CATALOGUE
实验总结与展望
实验总结
实验目的
实验方法
通过本次实验，我们成功地验证了蚕豆病 与G6PD酶活性之间的关系，并探讨了可能 的致病机制。
生化实验期末蚕豆 病设计性实验报告 课件
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果分析 • 实验总结与展望
01
CATALOGUE
实验目的
掌握蚕豆病的发病机制
01
了解蚕豆病的基因突变机制，掌 握其与氧化应激的关系。
02
理解蚕豆病发病过程中的酶缺陷 及其对代谢的影响。
蚕豆多倍体诱导和鉴定试验设计方案
蚕豆多倍体诱导和鉴定试验设计方案一、研究目的本试验的目的是通过多倍体诱导和鉴定，获得蚕豆的多倍体植株，并分析其对产量和抗逆性能的影响。
二、试验方法1.材料准备选取蚕豆品种，如“春蚕”等，作为试验材料。
选取健康、无病虫害的蚕豆种子作为试验材料。
2.多倍体诱导将种子表面用70%酒精消毒，然后用1%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，最后用无菌水洗净。
将种子置于层析纸上进行萌发，待种子萌发出完整的胚芽后，将其转移到含有2mg/L 2,4-D的MS培养基中进行培养。
培养基的pH值为5.8，培养温度为25±2℃，光照强度为3000lx，光周期为16h 光照/8h黑暗。
3.多倍体鉴定对培养基中生长的组织进行染色体观察，以确定其倍性。
通过标准的细胞学方法，如根尖细胞准备、染色、显微镜观察等进行多倍体鉴定。
4.产量和抗逆性能测试将多倍体和野生型蚕豆植株种植在相同的环境条件下，每个处理设置3个重复。
在不同的生长期，如花期、结荚期和成熟期，对植株进行测量和观察。
测量产量指标，如单株产量、荚果长度、荚果宽度等，同时评估抗逆性能，如抗病性、抗旱性等。
三、数据分析收集产量和抗逆性能的数据，并进行统计分析。
使用SPSS等统计软件进行方差分析，比较多倍体和野生型蚕豆之间的差异。
根据数据分析的结果，评估多倍体对蚕豆产量和抗逆性能的影响。
四、预期结果预期多倍体蚕豆较野生型蚕豆在产量和抗逆性能方面有所提高。
通过多倍体诱导和鉴定试验，可以得到具有更高产量和更强抗逆性的蚕豆品种。
五、试验注意事项1.培养基的配制和无菌操作要严格遵守操作规程，以保证试验的准确性。
2.多倍体鉴定时，要充分观察染色体的形态和结构，进行准确的判定。
3.每个处理的重复应设置合适，以提高结果的可靠性。
4.在进行抗逆性能测试时，要注意环境条件的一致性，以消除环境因素对结果的影响。
六、试验的意义通过多倍体诱导和鉴定试验，可以培育出具有良好产量和抗逆性能的蚕豆品种。
这对于提高农作物产量和抗病虫害能力具有重要意义，也为蚕豆的栽培和利用提供了有效的技术支持。
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红细胞
血红蛋白 血清总胆红素 结合胆红素 未结合胆红素 尿蛋白 潜血 尿胆红素 尿胆素原
患儿 1.98×1012/L
53g/L 85.5μmol/L 13.7μmol/L 71.8μmol/L (++) (+) (－) (+)
正常（儿童） 4.0×1012~ 5.3×10 12/L 120-140g/L 1.71～17.1μmol/L 0～3.42μmol/L 0～13.68μmol/L
从生化代谢解释患儿的临床表现和 实验室检查结果
? 主要临床表现：1. 血尿、排酱油色尿、面
?
色苍白
?
2. 皮肤及巩膜黄染
?
3. 体温升高
?
4. 呼吸急促
1. 血尿、排酱油色尿、面色苍白
G6PD↓ →NADPH+H +↓ →GSH↓ →红细胞的抗氧化能力 ↓ →红细胞 →溶血性贫血 →游离Hb>肾 →血红蛋白尿 / 膜破裂 （面色苍白） 吸收阈值 含铁血黄素尿
? 诱因：一天前食用蚕豆 ? 既往史：姐Leabharlann 也曾出现过此症状蚕豆病发病机制
?
食用蚕豆
?
产生大量过氧化氢，不被清除
?
红细胞膜脂质被氧化破坏
?
急性血管内溶血，产生过多胆红素
? 导致溶血性黄疸，恶心，呕吐，尿液呈酱油样
? 6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏使磷酸戊糖途径受阻。 NADPH+H +缺乏致血还原型谷胱甘肽生成不足。
? 红细胞被破坏，则可被肝等单核吞噬细胞识别并 吞噬，释放血红蛋白，进一步分解为珠蛋白和血 红素，而血红素被吞噬细胞降解为胆红素 。
? 胆红素是人体内原型抗氧化剂，能够清楚超氧化 剂和过氧化物自由基，因患儿体内有大量过氧化 氢，氧化应激可诱导 HO-1的表达，从而 增加胆红 素的量升高来抵御氧化应激状态。
2019年设计性实验
组员：吴怡蓉、付世锦、 杨有稳、梁燕
? 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天 入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶 心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据 家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。
? 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分， 呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促， 神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染， 体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、 脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查 未及异常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆 红素85.5μmol/L，结合胆红素13.7μmol/L， 未结合胆红素71.8μmol/L，尿蛋白（++）， 潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿 液镜下未见红细胞。
亚铁血红蛋白
高铁血红蛋白还原酶
高铁血红蛋白
NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体)
实验反应方向
? 一、实验目的
? 1、检测患者体内6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性 以及发病原因
? 2、掌握高铁血红蛋白还原法测6-磷酸葡萄 糖脱氢酶的实验原理及方法
? 3、了解蚕豆病的发病机制及原因
? 二、实验原理
在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚 铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）, 高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作 用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程 中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝 作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖 途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。 所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下 降（分光光度技术）。
? 蒸馏水
? 四、实验步骤
? 1、取静脉血1. 8mL 于抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg）， 混匀
? 2、离心沉淀 1000 r/ min 15 min
? 3、调整 血细胞∶血浆=1∶1 ，混匀 ， （调整后全血）
? 4、1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠、1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 、0.14 mmol/ L 亚甲基 蓝液，混匀 ，得到混合试剂1ml
? 三、实验器材及试剂
? 器材：离心机、分光光度计、微量移液器
?
水浴箱、1.5mlEP管、抗凝管，试管
? 试剂： ① 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液、 ② 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 、 ③ 0. 28 mol/
L 葡萄糖溶液、混合液 （等量①+②+③）、 生理盐水、抗凝剂、患者静脉血、
↓ 具有载 O2能力的 Hb 含量下降
↓ 机体缺 O2
↓ 呼吸急促
实验设计
高铁血红蛋白还 原法
实验思路
? 患者姐姐出现过此类状况推 测属于家族性遗传，且患者 在食用蚕豆后出现症状，故 即有可能为蚕豆病。 6-磷酸 葡萄糖脱氢酶缺乏影响高铁 血红蛋白的还原，故可以依 据如下反应机制设计实验。
亚硝酸钠
来回摇动15～20 次,置37 ℃水浴箱静置3 h
蒸馏水
10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml
B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管 及“S”管吸光度
? 六、实验结果 ? 实验结果计算：
计算高铁血红蛋白还原率 公式：
MHb % = (1 - A/ S) ×100 %
GSH的主要作用：① 保护红细胞内的含硫氢基 （-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜 蛋白的完整性，免遭氧化 ② 与谷胱甘肽过氧化酶共同使 H2O2还原成H2O
2. 皮肤及巩膜黄染
3. 体温升高
机理： 红细胞破裂 ↓
血红蛋白暴露 ↓
免疫系统攻击 （单核-吞噬细胞系统）
↓ 体温升高
4. 呼吸急促
溶血性贫血
理论依据
? 溶血性黄疸 ：由于红 细胞的大量破坏，使 胆红素产生过多，超 过了肝细胞摄取结合 的能力，使得尿中尿 胆原和尿胆素含量增 多。葡糖-6-磷酸脱氢 酶缺乏 ，输血不当均 会引起病症
? 蚕豆病：葡糖-6-磷酸 脱氢酶缺乏。 患者大 多在食用蚕豆后发生 急性溶血性贫血。典 型病人常出现由于大 量红细胞破坏释放出 胆红素二导致的溶血 性黄疸 ，恶心呕吐， 尿液呈酱油样 等症状
? 5、取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入 试剂
高铁血红蛋白还原试验操作步骤
试剂
A
B
S
混合试剂/ mL 生理盐水/ mL 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠0. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL
0. 01 / /
0. 1
/ 0. 01
/
0. 1
/ / 0. 01
0. 1