实验六 蛋白质家族序列模式及多序列比对
多序列比对和蛋白质结构预测讲解
基于序列信息和基于结构信息的比对都是非常重要的比对 模型，但它们都有不可避免的局限性，因为这两种方法都不 能完全反映蛋白质分子所携带的全部信息。 蛋白质序列是经过DNA序列转录翻译得到的。从信息论 的角度看，它应该与DNA分子所携带的信息更为“接近”。 而蛋白质结构除了序列本身带来的信息外，还包括经过翻译 后加工修饰所增加的结构信息，包括残基的修饰，分子间的 相互作用等，最终形成稳定的天然蛋白质结构。因此，这也 是对完全基于序列数据比对方法批评的主要原因。
一般来说，对于具有较高相似性的一组序列之间的比 对，自动比对方法是很有效的。一旦序列的亲缘关系变 得较远，所得结果就不那么可信。若要得到比较可靠而 又具有明确生物学意义的比对结果，比较有效的方法是 对比对结果进行手工编辑和调整。这对于构建二次数据 库是非常重要的信息。在选择现有的序列模式或序列模 体公开数据库构建自己的数据库系统时，对这些现有数 据库的可靠性必须采取谨慎的态度
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多序列比对
双序列比对是序列分析的基础。然而， 对于构成基因家族的成组的序列来说，我 们要建立多个序列之间的关系，这样才能 揭示整个基因家族的特征。多序列比对在 阐明一组相关序列的重要生物学模式方面 起着相当重要的作用。
多序列比对有时用来区分一组序列之间的差异，但 其主要用于描述一组序列之间的相似性关系，以便对 一个基因家族的特征有一个简明扼要的了解。与双序 列比对一样，多序列比对的方法建立在某个数学或生 物学模型之上。 因此，正如我们不能对双序列比对的结果得出“正 确或错误”的简单结论一样，多序列比对的结果也没 有绝对正确和绝对错误之分，而只能认为所使用的模 型在多大程度上反映了序列之间的相似性关系以及它 们的生物学特征。
可以看看PRINTS数据库关于TRANSFERRIN 的比对信息， PRINTS数据库在自动比对的基础上 进行了手工编辑，查寻PRINTS数据库中关于 TRANSFERRIN这一类的比对信息，结果可以用模 体（motif）形式显示也可以用点击链接调用JAVA APPLET进行图形显示，下图是关于 TRANSFERRIN序列比对的局部图形，可见 PRINTS数据库中TRANSFERRIN一类由更多的序 列比对形成。
蛋白质多序列比对
蛋白质多序列比对蛋白质是生物体内很重要的分子之一，具有生命活动所需的功能性和结构性特征。
多个蛋白质之间存在着相似性和差异性，因此需要对它们进行多序列比对以了解其在进化过程中的变化和功能上的差异性。
下面是关于蛋白质多序列比对的一些知识点和相关工具：1. 多序列比对的意义多序列比对可以帮助我们寻找蛋白质序列中的保守区域和变异区域，揭示它们在进化过程中的演化轨迹，并进一步推断它们在生命活动中的功能和相互关系。
此外，多序列比对还可以为新蛋白质的发现和功能预测提供重要的线索。
2. 多序列比对的挑战由于蛋白质序列的长度和复杂性，进行多序列比对有许多技术上的挑战。
比如，如何解决序列长度不同的问题、如何选取合适的序列比对算法、如何处理多重比对结果等等。
3. 常用的序列比对工具常用的蛋白质序列比对工具包括 ClustalW、MUSCLE、T-Coffee、MAFFT 等。
其中，ClustalW 是最早和最常用的序列比对工具之一，适用于大多数简单的序列比对问题。
而 MUSCLE 和 T-Coffee 则比ClustalW 更适用于复杂的序列比对问题，可以处理包括 RNA、DNA 和蛋白质等在内的多种生物序列。
4. 序列比对结果的解析序列比对结果可以通过一些可视化工具进行解析，如Jalview、BioEdit、GeneDoc 等。
这些工具可以帮助我们更好地理解序列比对结果，发现保守区域和变异区域，了解序列间的相似性和差异性。
总之，蛋白质多序列比对是揭示生命机理和蛋白质结构功能的重要手段之一。
通过适当选择比对工具和解析工具，我们可以更好地理解蛋白质序列的演化和功能，为生命科学和医学领域的研究提供有力支持。
06_蛋白质序列比对与分子进化分析_2014-2
ClustalX构建分子进化树操作实例
① 在“Ouput Format Option” 选项中勾选“Phylip format tree”； ② 点击“Draw Tree”命令并保存建树文件（文件名后 缀为.ph）。
(2)分子进化树的绘制
但ClustalX软件仅生成含有进化距离等数据的文本文 件（提供5种不同的输出格式），而绘制图形化的进化
化树。
6.3.3 进化树分析步骤
序列进化树的分析步骤一般包括： ①对需要建树的多重序列进行相似性比对；
②采用一定的算法计算各组序列间的进化距
离并建树； ③采用Bootstraping法对进化树进行评估。
(1)多重序列比对结果绘制分子进化树
ClustalX程序进行多重序列比对的结果，常用PHYLIP软件 包构建分子进化树，这是一种在Windows环境中运行的 Dos程序，下载地址为：
出格式选项）：
Output Files —— 选择输出文件格式； GDE output case —— GDE输出格式中 序列的大、小写； CLUSTALW sequence numbers —— 序 列数目； Output order —— 设定输出文件中序列的 排列方式，“Aligned”或“Input”； Parameters output —— 参数输出开关。
ClustalX最新Windows版本的下载地址：
ftp:///pub/software/clustalw2/2.1/clustalx-2.1-win.msi
6.2.1 ClustalX软件的使用
(1) ClustalX的安装和运行
① 双击“clustalx-2.1-win.msi”运行安装程序。
e) Use Negative Matrix —— 使用负矩阵；
第6讲 蛋白质序列分析
将protein.txt蛋白质序 列 粘贴在文本框中
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蛋白质序列分析
氨基酸数目 相对分子质量 理论 pI 值
返回结果
氨基酸组成
正/负电荷残基数
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原子组成
分子式 总原子数 消光系数
E(Prot) = Num(Tyr)*Ext(Tyr) + Num(Trp)*Ext(Trp) + Num(Cystine)*Ext(Cystine)
结构域匹配
已知结构的 同源蛋白？ 有
无
二级 结构预测 有
同源 建模
可用的折 叠模型？
串线法
无
三维结构模型
从头 预测
4
蛋白质序列分析
蛋白质结构分析主要内容
蛋白质基本理化性质分析
蛋白质一级结构
蛋白质亲疏水性分析
蛋白质跨膜区结构预测
蛋白质结构分析 蛋白质二级结构 蛋白质超二级结构 蛋白质三级结构
蛋白质二级结构预测 （α螺旋，β折叠等）
蛋白质序列分析
1.专家蛋白质分析系统：ExPaSy， Expert Protein Analysis System http://www.expasy.ch/ 瑞士生物信息学研究所
2. 生物序列分析中心：CBS， Center for Biological Sequence http://www.cbs.dtu.dk/services/ 丹麦技术大学
胞外末端：Asp（天冬氨酸）、Ser（丝氨酸）和Pro（脯 氨酸） 胞外-内分界区：Trp（色氨酸） 跨膜区：Leu（亮氨酸）、Ile（异亮氨酸）、Val（缬氨酸 ）、Met（甲硫氨酸）、Phe（苯丙氨酸）、Trp（色氨 酸）、Cys（半胱氨酸）、Ala（丙氨酸）、Pro（脯氨 酸）和Gly（甘氨酸） 胞内-外分界区：Tyr（络氨酸）、 Trp（色氨酸）和Phe（苯丙氨酸） 胞内末端：Lys（赖氨酸）和Arg（精氨酸）
实验四.多序列比对
实验四.多序列比对一.实验目的：在多序列分析中，多序列比对具有广泛的应用，是许多其他分析的基础和前提，比如进化发生分析、构建位置特异性打分矩阵、找到一致序列等，本实验的目的是熟悉多序列比对相关的操作和编辑方法。
二.实验基本要求：了解和熟悉多序列比对的原理和基本方法。
三．实验内容提要：1.使用CLUSTALW 算法，比对一组蛋白质序列，该序列属于RAD51‐RECA，在DNA 的复制阶段起重要作用，这些序列可以从NCBI genbank、Uniprot 等序列服务器获取，序列的索引号码为：P25454，P25453，P0A7G6，P48295。
将这些序列保存在一个文本文件。
如果查询到的序列不止一个的话，选择第一个。
a.练习使用EBI CLUSTALW（/Tools/msa/clustalw2/）；b. 将序列数据拷贝复制到窗口中；c. 采用默认参数进行比对；回答：clustalw 算法的基本原理？2. 在BAliBASE 网站查找一组蛋白质：1csy。
这些蛋白质的一致性为20‐40%，属于BAliBASE 参考序列1。
正确的比对结果网址如下：http://bips.u‐strasbg.fr/en/Products/Databases/BAliBASE/ref1/test1/1csy_ref1.html这一序列名称分别为p43405, p62994, p23727, p27986.获取这4条序列的fasta 格式，放在一个文本文件中，选择ebi网站上（/Tools/msa/）的至少四个多序列比对工具（如MAFFT、MUSCLE、CLUSTALW、Clustal Omega、T‐Coffee、DbClustal）进行分析。
三．实验结果：1.使用CLUSTALW 算法进行比对2A.获取4条序列信息：B.打开/Tools/msa/建立引导树，在引导树的指导下运用CLUSTALW 算法进行比对：五.回答问题：CLUSTALW 算法基本原理：首先进行所有序列之间的两两比较，计算出他们之间的分化距离矩阵；然后从分化距离矩阵中计算出作为指导多序列比较顺序的树状分枝图；最后根据树状图的分支关系，按照分化顺序逐个地把序列加入多序列比较过程。
多序列比对
实验六：多序列比对- Clustal、MUSCLE西北农林科技大学生物信息学中心实验目的：学会使用Clustal 和MUSCLE 进行多序列比对分析。
实验内容：多序列比对是将多条序列同时比对，使尽可能多的相同（或相似）字符出现在同一列中。
多序列比对的目标是发现多条序列的共性。
如果说序列两两比对主要用于建立两条序列的同源关系，从而推测它们的结构和功能，那么，同时比对多条序列对于研究分子结构、功能及进化关系更为有用。
例如，某些在生物学上有重要意义的相似区域只能通过将多个序列同时比对才能识别。
只有在多序列比对之后，才能发现与结构域或功能相关的保守序列片段，而两两序列比对是无法满足这样的要求的。
多序列比对对于系统发育分析、蛋白质家族成员鉴定、蛋白质结构预测、保守motif 的搜寻等具有非常重要的作用。
我们这节课主要学习两个广泛使用的多序列比对软件-Clustal、MUSCLE。
一、Clustal/Clustal 是一种利用渐近法（progressive alignment）进行多条序列比对的软件。
即先将多个序列两两比较构建距离矩阵，反应序列之间的两两关系；随后根据距离矩阵利用邻接法构建引导树(guide tree)；然后从多条序列中最相似（距离最近）的两条序列开始比对，按照各个序列在引导树上的位置，由近及远的逐步引入其它序列重新构建比对，直到所有序列都被加入形成最终的比对结果为止（Figure 6.1）。
Clustal 软件有多个版本。
其中Clustalw 采用命令行的形式在DOS 下运行；Clustalx 是可视化界面的程序，方便在windows 环境下运行；Clustal omega 是最新的版本，优点是比对速度很快，可以在短短数小时内比对成百上千的序列，同时由于采用了新的HMM 比对引擎，它的比对准确性也有了极大的提高，有DOS 命令行和网页服务器版。
我们今天主要学习clustalx 的使用。
范例1. 采用clustalx 进行多序列比对。
多序列比对和蛋白质结构预测讲解
我们称比对前序列中残基的位置为绝对位 置。如序列Ⅰ的第3位的残基是甘氨酸G，则 绝对位置Ⅰ3就是甘氨酸，而不能变成任何其 它氨基酸。相应地，我们称比对后序列中残基 的位置为相对位置。显然，同一列中所有残基 的相对位置相同，而每个残基的绝对位置不同， 因为它们来自不同的序列。 绝对位置是序列本身固有的属性，或者说 是比对前的位置，而相对位置则是经过比对后 的位置，也就比对过程赋予它的属性。
随着序列数量的增加，算法复杂性也不断增加。 我们用O（m1m2m3…mn）表示对n个序列进行比 对时的算法复杂性，其中mn是最后一条序列的长 度。若序列长度相差不大，则可简化成O（mn）， 其中n表示序列的数目，m表示序列的长度。显然， 随着序列数量的增加，序列比对的算法复杂性按 指数规律增长。
降低算法复杂性，是研究多序列比对的一个重要方面。为 此，产生了不少很有实用意义的多序列比对算法。这些方法 的特点是利用启发式（heuristics）算法降低算法复杂性， 以获得一个较为满意但并不一定是最优的比对结果，用来找 出子序列、构建进化树、查找保守序列或序列模板，以及进 行聚类（clustering）分析等。 有的算法将动态规划和启发性算法结合起来。例如，对所 有的序列进行两两比对，将所有的序列与某个特定的序列进 行比对，根据某种给定的亲源树进行分组比对，等等。必须 指出，上述方法求得的结果通常不是最优解，至少需要经过 n-1次双序列比对，其中n为参与比对的序列个数。
多序列比对
双序列比对是序列分析的基础。然而， 对于构成基因家族的成组的序列来说，我 们要建立多个序列之间的关系，这样才能 揭示整个基因家族的特征。多序列比对在 阐明一组相关序列的重要生物学模式方面 起着相当重要的作用。
多序列比对有时用来区分一组序列之间的差异，但 其主要用于描述一组序列之间的相似性关系，以便对 一个基因家族的特征有一个简明扼要的了解。与双序 列比对一样，多序列比对的方法建立在某个数学或生 物学模型之上。 因此，正如我们不能对双序列比对的结果得出“正 确或错误”的简单结论一样，多序列比对的结果也没 有绝对正确和绝对错误之分，而只能认为所使用的模 型在多大程度上反映了序列之间的相似性关系以及它 们的生物学特征。
多序列比对 简书
多序列比对简书【原创版】目录1.多序列比对的定义和意义2.多序列比对的基本方法和原理3.多序列比对的应用领域4.多序列比对在生物信息学中的重要性5.多序列比对的发展趋势与前景正文一、多序列比对的定义和意义多序列比对是一种生物信息学技术，用于比较两个或多个序列之间的相似性和差异性。
在生物学领域，多序列比对技术在基因组学、蛋白质组学等研究中具有重要的意义。
通过多序列比对，研究人员可以了解基因序列的进化关系、蛋白质序列的功能和结构特征，从而为生物学研究提供有力支持。
二、多序列比对的基本方法和原理多序列比对的基本方法可以分为两类：基于距离的比对方法和基于相似性的比对方法。
1.基于距离的比对方法：通过计算序列之间的距离来衡量它们的相似性。
常见的距离计算方法有欧氏距离、汉明距离等。
2.基于相似性的比对方法：通过比较序列之间的相似性来评估它们的相似性。
常见的相似性计算方法有 Pearson 相关系数、Jaccard 相似系数等。
三、多序列比对的应用领域多序列比对技术在多个领域具有广泛的应用，如基因组学、蛋白质组学、转录组学等。
1.在基因组学领域，多序列比对可用于基因组组装、基因注释、基因预测等任务。
2.在蛋白质组学领域，多序列比对可用于蛋白质序列比对、结构预测、功能注释等任务。
3.在转录组学领域，多序列比对可用于转录本鉴定、表达量分析等任务。
四、多序列比对在生物信息学中的重要性多序列比对在生物信息学领域具有重要意义，它可以帮助研究人员了解生物序列之间的进化关系、结构特征和功能属性。
此外，多序列比对还可以为基因组学、蛋白质组学等领域的研究提供有力支持，推动生物信息学的发展。
五、多序列比对的发展趋势与前景随着生物信息学技术的不断发展，多序列比对技术也在不断完善和优化。
未来的发展趋势包括提高比对速度、提高比对准确性和拓展应用领域等。
此外，随着人工智能技术的发展，深度学习等方法也将应用于多序列比对领域，为生物信息学研究提供更加高效和准确的比对结果。
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实验六、多序列比对及进化树的构建（3学时）
目的：
1、了解蛋白质序列模式二级数据库的结构、内容及基本使用方法。
2、了解多序列比对工具ClustalW/X的使用方法并学习对比对结果进行编辑与分析。
3、学习如何构建系统进化树。
内容：
一、蛋白质功能位点数据库PROSITE、蛋白质序列指纹图谱数据库Prints的内容、结构及
使用。
1、熟悉PROSITE数据库的数据结构。
从生物学院-国家生物学理科基地-课件下载处下载最新的课程相关内容.rar,解包后打开实验数据-实验二中的CBI EMBL format_P02753，找到Database cross-references项中的PROSITE，点击PS00213的链接。
则显示PROSITE数据库中Lipocalin 模式（AC号为PS00213）的记录信息。
利用网上的PROSITE user manual
（/prosite/prosuser.html#convent36）理解每一个字段及内容的含义。
回答问题：
A、L ipocalin pattern的长度是多少？
B、请解释/TAXO-RANGE=??EP?的含义。
C、分别解释NR字段中三行数据的含义。
D、Q28133蛋白（ALL2_BOVIN）是否符合此pattern？
E、Is this a good pattern? Why?
2、PROSITE数据库的检索。
ExPaSy(/prosite/) 及SRS（，）都提供了对PROSITE数据库的检索服务。
可以通过AC、ID、description、author等信息进行数据库检索，你还可以通过各序列数据库中的交叉引用链接（cross-references or xref等）找到相应的PROSITE pattern, profile or rules 信息。
ScanProsite工具（/tools/scanprosite/）则可以分析查询序列中可能包含的序列模式或序列谱，以作为进一步鉴定的基础。
同时，ScanProsite还可以利用特定的序列模式进行对SWISS-PROT、TrEMBL及PDB数据库的搜索以获得相应数据库中所有具有此模式的序列。
利用ScanProsite的help页面了解有关的使用方法。
回答问题：
F、如果查找PLEK_HUMAN序列中所包含的序列模式或序列谱？
G、如何利用ScanProsite在SWISSPROT中查找有多少个人类（homo sapiens）
序列包含有与PLEK_HUMAN相同的序列谱？请写明过程。
此查询执行的过程很慢，预先作过的结果可从实验六-prosite-ScanProsite Results Viewer of PLEK_HUMAN PROFILE.html文件中查看。
3、蛋白质序列指纹图谱数据库Prints的数据内容及查询工具。
利用课程相关内容-实验数据-实验二中的CBI EMBL format_P02753，找到Database cross-references项中的PRINTS，点击PR00179的链接，即显示PRINTS数据库中Lipocalin 蛋白序列指纹信息。
利用PRINTS数据库的用户指南（/dbbrowser/PRINTS/printsman.html）熟悉其中的内容与含义。
利用FingerPrintScan
（/fingerPRINTScan/）进行查询序列中的序列指纹鉴别（以实验五中的蛋白质查询序列为例）：
MSTA VLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEEN DVNLTHIESRPSRLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTV PWFPRTIQELDRFANQILSYGAELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPR VEYMEEEKKTWGTVFKTLKSL YKTHACYEYNHIFPLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQF LQTCTGFRLRPV AGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPEPDICHELLGHVP LFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSSFG ELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPL YYV AESFNDAKEKVRNFAA TIPRPFS VRYDPYTQRIEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQKIK
回答问题：
H、此序列包含了哪种序列指纹？
I、此序列指纹包含了几个motif?
二、利用网上或下载的ClustalX/W进行多序列比对，并对结果进行编辑与分析。
1、多序列比对。
1）利用BLAST进行比对序列的收集。
（当然，你也可以利用SRS系统进行某家族序列的收集，并通过SRS整合的clustalW进行多序列比对。
）在你的多序列比对中，可能希望包含两种类型的序列：已经过鉴定的具有良好注释及实验信息的序列，以及你感兴趣的未鉴定的序列（但必须属于此序列家族）。
将后者加入多序列比对的主要目的是确定序列中不会发生突变的保守位点，同时确定重要性相对小一些的那些区域。
进入ExPASy的BLAST server (/tools/blast/),在检索框内输入P20472（如果在检索框内输入的是蛋白质序列，使用blastp程序，如果输入的是CDS序列，则选择tblastn程序）, 从options选项中的Number of best scoring sequences to sho w以及Number of best alignments to show的下拉菜单中选择1000。
点击RUN BLAST。
2）从结果中选择少于10条序列进行第一次的多序列比对。
注意选择的序列要在具有
良好的E值（10-40）与不太好的E值（10-5）之间平均分配，同时查看具体的alignment 以确定选择的目标序列与查询序列（P20472）之间具有全序列范围内的相似性。
在选择的序列前打勾，如P20472，P80079，P02626，P02619，P43305，P32930，P91482，P02620，P02622。
在Send selected sequences to项目的下拉菜单中选择合适的序列输出选项，如clustalW是将序列发送到EMBnet的ClustalW服务器上，点击提交查询内容，则将所选序列装填入ClustalW服务器的检索框内，利用默认参数，点击RUN ClustalW，则可以得到以不同格式保存的多序列比对结果以及.dnd格式的向导树（guide tree）或称dendogram，它并不是真正的系统进化树。
T-coffee也是一个多序列比对工具，采用的是与ClustalW相类似的渐进式比对算法，它产生的比对结果准确度要比ClustalW高，但运行速度要比ClustalW慢。
利用默认参数，我们可以看到T-coffee产生的结果不仅包含了各种格式的多序列比对情况以及向导树，还有用颜色标记比对质量的html文件及相应的PDF文件。
在这些文件中，红色表示高质量的片段，而兰色则表明比对的区域不可信。
3）将上步所选的序列以FASTA格式进行保存，并将多序列比对结果中的aln格式结果及.dnd文件进行保存。
4）接入EBI的clustalW服务器（/clustalw/index.html），将另一个蛋白质P19132的FASTA格式加入到刚才下载的FASTA格式序列文件中。
如果查看刚才利用P20472序列进行对库搜索的结果中，这个蛋白的E值为4.4！而且其与查询序列的同一性仅为在33个连续残基中的39%，因此进化关系上与P20472很远。
将这些序列进行多序列比对分析，必要时进行相关参数的设置。
在Phylogenetic tree 选项中的tree type选择phylip或dist，使用帮助参见课程相关内容-实验数据-实验六中的EBI Help-clustalW.html，将比对结果进行保存，并与前一步骤得到的结果进。