脂肪酶综述

脂肪酶与生物柴油的催化合成摘要：脂肪酶已成为工业生产所需的一种重要用酶。

已广泛应用于食品、药品、日用化工等领域。

本文综述了脂肪酶的结构、应用、催化机理以及在生物柴油生产中的研究进展。

关键词：脂肪酶，催化机理，生物柴油0 前言脂肪酶，又称甘油酯水解酶，是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯的酯键的酶，它是一类具有多种催化能力的酶，被广泛用于三脂酰甘油及其他一些水不溶性脂类的水解、醇解、酯化、转酯化及脂类逆向转酯反应酯类的逆向合成反应[1]中。

图1、2 脂肪酶催化酯相关的反应脂肪酶的种类众多，包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶等。

广泛存在于含有脂肪的动、植物和微生物（如霉菌、细菌等）组织中。

比如高等动物的胰脏和脂肪组织、油料作物的种子、真菌和酵母等都含有较多的脂肪酶。

脂肪酶的分子量因其来源不同而差异很大，不同来源的脂肪酶，其氨基酸组成数目从200-700不等，其分子量也从29-100kDa不等。

1 脂肪酶的结构功能与应用1.1 脂肪酶的功能脂肪酶作为酯水解酶，自然可以催化酯的相关反应，比如酯的水解、酯的合成、酯交换等反应，脂肪酶对生命体的代谢起到重要的作用：动物体内，各类脂肪酶控制消化，吸收，脂肪重建和蛋白质代谢等过程；当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必须的养料和能量。

脂肪酶的最适温度一般在30-60℃之间，最适pH一般为6-10，不同来源的脂肪酶的最适合的温度和最适合的pH差异比较大。

1.2 脂肪酶的结构及催化机理脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。

它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。

对脂肪酶活性中心的研究发现，八联体β-折叠间隔被两亲的α-螺旋连接起来共同构成了脂肪酶的活性中心，不同的脂肪酶都有一个相似的起催化作用的“Ser-Asp/Glu-His”三联体，三个氨基酸残基分别位于活性中心具有疏水性的β5、β7、β8折叠片的后面[2]。

丝氨酸残基位于β5链C末端高度保守的五肽“GXSXG”中(X代表任意氨基酸残基）。

在脂肪酶催化反应时由丝氨酸残基发动亲核攻击，许多脂肪酶的活性中心丝氨酸残基在正常情况下被双亲性的短α-螺旋“盖子”(1id)盖住，被其保护起来。

当脂肪酶活化时，酶分子构象发生变化，“盖子”打开暴露出活性中心[3]。

活性中心附近有一个Ca2+结合点。

Ca2+分别与脂肪酶主链上的4个羧基氧原子和2个水分子相互作用，形成一个稳定的八面体结构，有助于酶的激活和构象的稳定[4-5]。

脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，因为α-螺旋“盖子”的存在，只有当脂肪酶暴露于油水界面时，盖子被打开，酶的活性才能被激发，这就是所谓的脂肪酶界面活性。

因此脂肪酶只在油水界面上作用，而且只有在当底物以微粒，小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。

脂肪酶按催化特异性可分为三类：第一类脂肪酶对三脂酰甘油上酰基水解的位置没有特异性；第二类脂肪酶有1、3位酰基或2位酰基水解特异性；第三类脂肪酶对脂肪酸的碳链长度和饱和度有特异性[2]。

在脂肪酶催化作用下，三脂酰甘油与甲醇等低碳醇的转酯反应动力学表现为连续反应机理，即三脂酰甘油和部分甘油酯（单脂酰甘油和二脂酰甘油）在脂肪酶作用下首先水解，游离脂肪酸和甲醇酯化反应生成脂肪酸甲酯[6]，这与碱催化不同。

在碱催化反应中，低碳醇首先在OH-的作用下发生离解，生成活性中间体甲氧基，然后改进羧基中的碳原子，从而发生亲核取代反应，利用甲氧基将三脂酰甘油中的甘油基替代下来，从而生成脂肪酸甲酯[7]。

理论上，脂肪酶催化可使所有的游离脂肪酸转化为脂肪酸甲酯，避免碱催化中皂化反应所产生的浪费。

1.3 脂肪酶的应用脂肪酸在许多领域如食品、药品、日用化工等方面都有广泛的应用[8]：1.3.1 在食品加工方面：利用脂肪酶分解油脂释放出的短链脂肪酸增加或改进食品的风味、香味与质构，生产代可可脂，这是脂肪酶最早、最广泛的应用。

1.3.2 在医学方面：脂肪酶是一种重要的药物靶或中间体标记酶。

作为诊断工具，脂肪酶可预测疾病。

测定脂肪酶催化甘油三酸酯产生的甘油可间接获得血清甘油三酸酯的含量，血清中脂肪酶还可用于检测急性胰腺炎图2 马脂肪酶结构八联体β-折叠（绿）间隔被两亲的α-螺旋（红）连接起来，蓝色为三联体和胰腺损伤。

1.3.3 脂肪酶在纺织物中的应用：织物表面脂质影响织物的柔软度、光亮度和着色与手感。

传统脂处理法是用化学品脱除，效果不理想，且污染环境，成本高。

脂肪酶能将织物表面脂质水解成易溶于水的脂肪酸，易于脱除。

1.3.4 脂肪酶可以用于催化合成生物柴油：生物柴油是碳链长度为16-19的脂肪酸和甲醇或乙醇形成的酯类化合物的总称。

近年，用脂肪酶催化合成生物柴油，代替石化能源成为研究热点。

1.3.5脂肪酶也可以在生物传感器起到作用：用脂肪酶的催化特性研制生物传感器逐渐受到关注。

固定在pH或氧化电极的脂肪酶联合葡萄糖氧化酶可作为脂质生物传感器，测定甘油三酯、血胆固醇含量。

2 脂肪酶催化合成生物柴油2.1 生物柴油随着工业化程度的提高，不可再生的化石能源越来越紧缺，对于新能源的研究也越来越迫切。

生物柴油作为可再生能源（biodiesel）的一种，逐渐成为当下研究的一个热点，生物柴油主要指以任何天然的油或脂为原料与甲醇、乙醇等进行醇解化反应得到的脂肪酸甲酯（或脂肪酸乙酯）混合物，不仅可以作为燃料直接燃烧，而且也可作为柴油清洁燃烧的添加剂。

目前工业化生产主要使用化学法合成生物柴油，但存在工艺复杂、能耗较高、产品色泽较深、酯化产物难于回收、成本高等缺点[9]。

2.2 脂肪酶催化合成生物柴油为解决上述问题，人们研究用生物酶法合成生物柴油，即通过脂肪酶催化醇解反应，制备相应的脂肪酸甲酯或乙酯，最常见的是用固定化CALB（Candida Antarctic Lipase B，南极假丝酵母脂肪酶B）即图4 CALB结构Novozyme 435合成生物柴油。

2.2.1 CALB结构CALB是一个球状蛋白，由317个氨基酸组成，主要为T/U折叠。

CALB的大小约为30×40×50Å，分子量33KDa，等电点PI=6.0。

与其它脂肪酶相同的是CALB的催化主要由Ser-Asp-His三联体负责。

而与大部分脂肪酶不同的是：CALB 没有α-螺旋盖子，且在丝氨酸活性位点周围没有常见的氨基酸序列GXSXG，取而代之的是一个苏氨酸，这个苏氨酸与被保留的第一个甘氨酸相连[10]。

2.2.2 CALB催化机理CALB的催化机理可由图解释[11]：整个酶反应是酸碱促进的，起催化作用的酶活性部位主要由一个催化三联体（Ser105，Asp187，His224）构成此类反应有两个底物酶过渡态和一个酰基化酶的中间态。

反应的进行分为两步，第一步，底物1（Substrate 1）作为酰基供体使脂肪酶酰化形成第一个过渡态（TS1），TS1不稳定继而生成酰化酶中间体（Acylenzyme），并且释放出产物1（Product 1）；第二步，底物2（Substrate 2）充当亲核试剂，使得酰化酶中间体脱酰化形成了第二个过渡态（TS2），TS2继而生成产物2（Product 2），脂肪酶亦恢复为自由酶（Free enzyme）。

以反应的第一步为例，Asp187通过一个氢键定位并固定His224，His224作为一个广义碱从Ser105吸取一个质子，促进Ser105亲核攻击羰基碳，从而形成TS1。

脂肪酶在整个过程中经历了自由酶→过渡态1→酰化酶中间体→过渡态2→自由酶的循环。

通过这一原理，CALB通过催化脂肪酸或甘油三酯分别与甲醇等低碳醇通过酯化或转酯化反应，生成长链脂肪酸单酯，即制得生物柴油。

2.3用脂肪酶催化合成生物柴油图5 CALB催化机理的优缺点脂肪酶催化法制备生物柴油不仅可以利用动植物油脂，也可利用餐饮业、工业废油脂等，比碱催化法更具优良的原料适应性。

同时，反应条件温和，产品分离及副产物回收等方面也简单易行，且无污染排放，因而是相对经济和环保的方法。

其有着较好的工业化前景。

但脂肪酶催化合成工艺由于酶制品成本较高、稳定性较差、重复利用率低、甲醇等低碳醇使酶的失活效应等瓶颈问题而暂时还没实现工业化。

2.4 改进方案目前正在研究通过采用固定化酶及全细胞催化剂等方法来降低酶制品的成本并实现酶的重复利用，同时通过甲醇流加方式、酰基受体、耐醇酶的开发等手段改善酶的催化活力和稳定性，从而降低整个生产工艺成本，加快工业化进程。

3. 结语与展望脂肪酶法合成生物柴油是一个十分有潜力的生物催化过程。

而降低酶的发酵生产和固定化成本以及提高酶的使用寿命是实现工业化生产的关键。

随着脂肪酶生产成本的降低和研究的进一步深入，脂肪酶在生物柴油的催化合成上一定会展现巨大的价值。

参考文献[1] K. E. Jaeger, B. W. Dijkatra, M. T. Reetz.Bacterial biocatalysts: Molecular biology, three-dimensional structures, and biotechnological applications of Iipases [J].Annu. Rev. Microbiol, 1999, 53: 315-351. [2] Zhang Hao, Yi Yin. Advances of Mechanismsand Impact Factors on Synthesis of BiodieseI Molecule by Catalyzed Lipase. Guizhou Agricultural Sciences [J]. 2010. 38(4): 181-183. [3] L. Brady, A. M. Brzowski, Z. S. Derewends. Aserine protease triad forms the catalytic centre of a triacylglycerol lipase [J]. Nature, 1990, 343: 767-770.[4] Kim Kyeong Kyu, song Hyun, Shin Dong Hae.The crystal structurt of a triacylglycerol lipase from Pseudomonas cepacia reveals a highly open conformation in the absence of abound inhibitor [J]. Structure, 1997, 5(2): 173-185.[5] D. Lang, B. Hofmann, L. Haalck, et al. Crystalstructurt of a bacterial lipase from Chrombacterium viscosum ATCC 6918 refined at 1.6 A resolution [J]. J Mol Biol, 1996, 259(4): 704-717.[6] J. Shieh, Ch. Ch. Lee, Sh. W. Chang, et al.Study on the optimized synthesis of enzymatic biodiesel catalyzed by Lipozyme IM-77 [J]. Abstracts of Papers American Chemical Society, 2002, 223(1-2): 63-67. [7] H. Fukuda, A. Kondo, H. Noda, Related Article,Biodiesel fuel production by transesterification of oils [J]. J Biosci Bioeng, 2001, 92(5): 405-416.[8] Jing Li, Lin Li, Jin Tong, Yan Wang, Shijie Chen.Research Development on Lipase-catalyzed Biodiesel. [J] Energy Procedia 2012, 16: 1014–1021.[9] Limpon Bora, Dibakar Gohain, Reshmi Das.Recent advances in production and biotechnological applications of thermostable and alkaline bacterial lipases.[J] Chem Technol Biotechnol 2013, 88: 1959-1970.[10] Uppenberg J, Hansen M T, Pa tkar S, et al. [ J]Structure. 1994, 2: 293-308.[11] Jenny Ottosson. Enthalpy and Entropy inEnzyme Catalysis-A Study of LipaseEnatioselectivity [M ], Department ofBiotechnology Royal Institute of Technology.2000, 2-15.。