生物样本分析方法的建立和确证

四川大学华西第二医院国家药品临床试验机构

Ⅰ期临床研究室实验室

四川大学华西药学院临床药学教研室

生物样本分析方法的建立和确证、未知样品测定及其质量控

制技术指导原则

第一版

（仅供内部参考）

制定： 复核： 签发：

二○○五年十二月

目 录

1. 常用分析方法(Common Technique) (3)

2. 方法建立前的准备(Pre-methods Preparation) (3)

2.1. 文献资料的查阅与接收(Literature Preparation) (3)

2.2. 试验用参比纯品的准备(Reference Standard Preparation) (4)

2.3. 仪器、试剂的准备(Apparatus and Regents Preparation) (4)

2.4. 工作量及试验人员的准备(Workload and Personnel Preparation) (4)

2.5. 课题经费预算(Outlay budget) (5)

3. 方法确证的分类(Classification of Validation) (5)

3.1. 完整确证(Full Validation) (5)

3.2. 部分确证(Partial Validation) (5)

3.3. 交叉确证(Cross Validation) (6)

4. 分析方法的建立与确证（Method Development and Validation） (6)

4.1. 特异性(Specificity) (6)

4.2. 准确度、精密度与回收率(Accuracy, Precision and Recovery) (7)

4.3. 标准曲线（Calibration / Standard Curve） (7)

4.3.1. 最低定量限(Lower Limit of Quantification (LLOQ)) (8)

4.3.2. 标准曲线样品浓度与响应值之间的关系(Calibration Curve/Standard

Curve/Concentration-Response) (8)

4.4. 稳定性(Stability) (8)

4.4.1. 冻融稳定性(Freeze and Thaw Stability) (9)

4.4.2. 室温条件下稳定性(Short-Term Temperature Stability) (9)

4.4.3. 长期稳定性(Long-Term Stability) (9)

4.4.4. 储备液稳定性(Stock Solution Stability) (9)

4.4.5. 处理后样品的稳定性(Post-Preparative Stability) (9)

4.5. 相关注意事项(Specific Recommendations) (10)

5. 生物样品分析测定质量控制(Quality Control) (11)

5.1. 分析批(Analytical Batch/Run) (11)

5.2. 随行标准曲线(Calibration Curve/Standard Curve) (11)

5.3. 质控样品(Quality Control Sample) (11)

5.4. 异常值、溢出值的判定与样品重测(Verdiction of Abnormity/Overflow and

Repeat Analysis) (12)

5.5. 相关注意事项(Specific Recommendations) (12)

6. 记录与报告(Documentation) (13)

6.1. 总结报告(Summary Infomation) (13)

6.2. 方法的建立与确证记录(Method Development and Validation) (14)

6.3. 未知样品的分析与质控记录(Application to Routine Drug Analysis) (14)

6.4. 其它内容(Other Infomation) (15)

7. 参考文献(Reference) (15)

生物样品一般来自全血、血清、血浆、尿液或其他组织，具有取样量少、药物浓度低、干扰物质多以及个体的差异大等特点，因此必须根据待测物的结构、生物介质的特点和预期的浓度范围，建立适宜的生物样品定量分析方法，并对方法进行确证，并在测定过程中加强质量管理，方可保证研究工作的质量。

1. 常用分析方法(Common Technique)

目前常用的几种分析方法有：

⑴色谱法：气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱－质谱联用法（LC－MS、LC-MS-MS、GC-MS、GC-MS-MS）等，可用于大多数药物的检测；⑵免疫学方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法等，多用于蛋白质多肽类物质检测；⑶微生物学方法，可用于抗生素类药物的测定。

生物样本分析方法的选择宜尽量选择可行的灵敏度高的方法。

鉴于本课题组实际设备条件限制，本课题组生物样品分析可选用的方法一般为：高效液相色谱法（紫外检测器）；高效液相色谱－质谱联用法（LC-MS-MS）；气相色谱－质谱联用法（GC-MS）。

2. 方法建立前的准备(Pre-methods Preparation)

为保证生物样品测定过程的规范化与结果的可靠性，在方法建立之前对该项目的技术要求、难度、工作量、试验成本及试验时间应该有充分的估计与把握。因此，在建立方法之前应当进行充分的软件与硬件条件的准备工作，制定相应的工作计划与方案。方法的准备工作可与分析方法的建立工作同时进行。

2.1. 文献资料的查阅与接收(Literature Preparation)

课题组生物样品分析相关课题一般分为三种：

临床试验相关课题

临床前研究（动物体内生物利用度、药动学与代谢研究）相关课题（横向课题）

国家自然科学基金课题或自拟课题（纵向课题）。

前两种课题均为与厂家合作进行研究，因此涉及相关资料交接事宜，如临床试验相关课题的“研究者手册”的交接，均按照国家“药品注册管理办法”及相关技术指导原则的规定项目进行。若厂家提供的资料不能满足实际准备工作的要求，则需进行详尽的资料查阅工作。

资料查阅工作一般要求对国内外该药物或该类药物的生物样品的分析相关文献进行详细的查阅与整理归类。一般首先查阅国内相关资料，再查阅国外相关资料，对文献报道的归类整理过程中注意文献报道真实性与合理性的评价。

原则上国内文献选用核心期刊收载文献，国外文献选择MEDLINE或SCI收载期刊文献。尽量使用国外文献报道作为进行该课题生物样品分析方法建立的参考。

对于纵向课题和自拟课题而言，一般不存在相关单位提供现成的参考资料。所有的文献资料准备工作均需自己进行。具体方法与步骤参照上文。

2.2. 试验用参比纯品的准备(Reference Standard Preparation)

生物样品分析方法的建立与确证需使用药物或其代谢物的参比纯品，进行标准曲线的建立与质控样品的制备。试验用参比纯品的纯度直接影响分析结果的准确性，其质量控制是分析方法确证的源头。因此，方法使用的参比纯品事先需进行完备的鉴别与含量测定，无论购置的还是厂家提供的标准品/对照品/原料药均应向购买方或厂家索取质检报告。应当尽量使用与待测物结构一致的参比纯品，如条件不允许，可选择使用相关结构与含量确定的化学实体（如酸、碱、盐或酯）。试验用参比纯品一般有四种来源：⑴国家药品生物制品检定所提供的标准品/对照品；⑵由知名厂商（如SIGMA）提供的市售标准品/对照品；

⑶其它厂商提供的具有完备质检证书的原料药；⑷其它分析实验室/化学实验室或非商业机构提供的具有质检证明文件的自合成参比纯品。购买或获得这些参比纯品时需记录该品的来源、批号、有效期与质检证明，无以上来源信息或质检证明的参比纯品原则上不得用于定量分析的标准曲线建立与质控，但可用作内标。

2.3. 仪器、试剂的准备(Apparatus and Regents Preparation)

资料准备工作结束后进入课题的实质准备工作阶段。首先根据文献资料报道较多的方法进行仪器与试剂的准备工作。

首先根据选定的方法选择需使用的仪器设备，联系仪器设备的负责人协调仪器的使用时间等相关事宜。若需使用本实验室尚没有的仪器设备，咨询其它课题组或实验室是否有该仪器设备及该设备的具体使用情况。自己联系或通过课题组负责人联系借用或租用该仪器设备。如需使用本实验室尚没有的且属本课题组日常工作常用的仪器设备，如条件许可则向课题负责人或实验室负责人申请购买该仪器设备。购买程序按实验室仪器购置相关管理规定进行。

按照预定的分析方法流程制订课题进行中需使用的试剂清单，查阅实验室相关试剂登记本或咨询实验室试剂管理人员，列出实验室缺少的试剂清单。制订计划向课题负责人或实验室负责人申请购买，购买程序按实验室试剂购置相关管理规定进行。

2.4. 工作量及试验人员的准备(Workload and Personnel Preparation)

根据预定试验计划预计课题的工作量，依据规定课题完成时间及试验操作

难度等因素预计需参加本课题的试验人数及试验人员。根据试验人员试验技能的熟悉程度初步制定试验工作量及工作内容的分配方案。制订完成后报告课题负责人或实验室负责人。获得批准后通知相关研究人员熟悉试验的相关内容。

2.5. 课题经费预算(Outlay budget)

根据预先拟定的需使用的试剂清单，试验中的必要的耗材的损耗（比如：塑料离心管、移液尖、滤膜、预柱芯、氘灯的损耗、氮气的消耗），仪器的维修费（修理离心机、更换超纯水机的滤芯等）以及试验人员的补贴等，提出试验课题经费预算。

3. 方法确证的分类(Classification of Validation)

文献报道的方法一般需进行适当的调整以适应本实验室的实际情况与要求，调整后的方法需进行完整的方法验证。当对已经验证的方法进行了某些程度的调整之后，应重新考虑需增加哪些新的方法验证内容。在项目进行的过程中，某一确定的生物样品分析方法往往需要进行不断的调整与验证以适应项目研究的特定要求与目的，保证方法的有效性。按验证的类型与程度，方法验证一般分为以下三种：

3.1. 完整确证(Full Validation)

·当第一次建立某种生物样品分析方法时，需进行完整的方法确证工作。

·对于某种新的化学实体的研究需要进行方法的完整确证。

·当已经建立的分析方法中增加了代谢物的分析内容，需调整后的方法进行完整的确证。

3.2. 部分确证(Partial Validation)

部分确证为对已经进行完整确证的生物样品分析方法作出调整后进行的确证工作。部分确证的内容根据方法调整的程度不同而不同，最少可由重新考察准确度与精密度，最多需对调整后的方法进行重新确证。通常需进行方法部分确证的情况如下（但不限于如下范围）：

·分析方法在实验室或分析人员之间的交接；

·分析方法的某些改变（如改变检测器）；

·生物样品采集时改变抗凝剂；

·生物样品的改变（如由人血浆改变为人尿液）；

·生物样品处理方法的改变；

·生物样品来源种属的改变（如由大鼠血浆改为小鼠血浆）；

·分析方法定量范围改变；

·分析方法采用仪器或仪器工作软件改变；

·样品处理时生物样品容量的改变（如由1 ml改为 2 ml）；

·使用某些稀有的生物样品；

·伴随药物治疗时对某些药物的选择性定量分析；

·分析方法中增加对特定代谢产物的分析内容。

3.3. 交叉确证(Cross Validation)

交叉确证是指对同一项目中出现的多种分析方法或汇总不同项目中不同分析方法研究数据时，对不同的分析方法的确证参数的比较性验证。比如，以早期已经确证的分析方法为对照方法，后期调整后的分析方法作为参比方法，对两种方法进行完整的对比性确证。

当某一项目的样品分析同时在不同的地点或不同的实验室进行时，需统一配制标准生物样品对每个分析地点或分析实验室进行方法的交叉确证，以保证不同实验室分析结果的可靠性。在不同的项目中使用不同的分析技术建立的分析方法（如LC-MS-MS与ELISA）也需要进行方法的交叉确证。

4. 分析方法的建立与确证（Method Development and Validation）

建立可靠的和可重现的选择性定量分析方法是进行生物等效性研究的关键之一。为了保证分析方法可靠，必须进行充分的方法确证，生物样品分析方法一般需进行确证的基本项目包括，准确度、精密度、选择性（特异性）、灵敏度、重现性与稳定性。生物样品中的每种待测物的分析方法均需进行确证。此外，配制的标准生物样品中待测物的稳定性需进行完整的考察。生物样品分析方法的建立一般的考察顺序为：⑴选择性，⑵准确度、精密度、回收率，⑶标准曲线，⑷待测物在血浆中的稳定性。

4.1. 特异性(Specificity)

特异性是指样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。必须提供证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干扰对样品的测定。应确定保证分析方法特异性的最佳检测条件。对于色谱法至少要考察6 个来自不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图反映分析方法的特异性。每个空白生物样品均应考察杂质的干扰情况，方法的选择性应能保证方法的定量下限。生物样品中干扰的来源一般包括，内源性物质、代谢产物、降解产物与生物体同时接触的其它药物或外源性化学成分。若分析方法同时测定不止一个待测物，每个待测物分析的特异性均应详细考察。

对于以软电离质谱为基础的检测法（LC－MS、LC-MS-MS）应注意考察分

析过程中的介质效应，如离子抑制等。

4.2. 准确度、精密度与回收率(Accuracy, Precision and Recovery)

准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度(即质控样品的实测浓度与真实浓度的偏差)，重复测定已知浓度分析物样品可获得准确度。准确度以实测浓度与真实浓度的偏差表示。准确度的测定要求至少对3个平均分布在标准曲线范围的浓度（一般要求4个浓度，最低浓度即LLOQ，最高浓度为定量范围上限）进行考察，每个浓度最少测定5个样品（一般要求6个）。一般应85％～115％范围内，在LLOQ 附近应在80％～120％范围内。

精密度是指在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间RSD 来考察方法的精确度。在测定批内精密度时，要求至少对3个平均分布在标准曲线范围的浓度（一般要求4个浓度，最低浓度即LLOQ，最高浓度为定量范围上限）进行考察，每一浓度至少制备并测定5个样品（一般要求6个）。为获得批间精密度应至少在不同天连续制备并测定3个合格的分析批(Analytical run/Analytical batch)，至少72个样品。一般RSD 应小于15％，在LLOQ 附近RSD 应小于20％。批内精密度用于考察单一分析周期样品分析的精密度，批间精密度用于考察不同分析周期之间样品分析的精密度，以保证在不同测定时间、仪器、试剂以及测定实验室变化时均能获得一致的结果。

回收率是指待测物在样品处理中经过液－液萃取或固相萃取后待测物的萃取的有效性与重复性，以待测物经过样品处理后分析检测器的响应值与同浓度纯待测物的分析检测器响应值的比值表示。对于分析方法的回收率的高低一般不作限定，但见于回收率越高，分析方法的检测限越低，因此回收率至少达到50％以上为佳。待测物的回收率与内标的回收率应当保持一致，一般要求其比例基本不变，比值的RSD在15％以内。所有待测物与内标的回收率应当保证精密，并可重现。一般要求至少对3个平均分布在标准曲线范围的浓度（一般要求4个浓度，最低浓度即LLOQ，最高浓度为定量范围上限）进行考察，通过比较准确度测定样品的检测器响应值与未萃取（回收率100％）的同浓度参比纯品的检测器响应值考察分析方法的回收率。

4.3. 标准曲线（Calibration / Standard Curve）

标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系，一般用回归分析方法（如用加权最小二乘法）所得的回归方程来评价。应提供标准曲线的线性方程和相关系数，说明其线性相关程度，并提供进行标准曲线回归分析的软件及其版本。标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果

应达到试验要求的精密度和准确度。分析方法中每个待测物都应当建立其对应的标准曲线。

配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，不同生物样品应制备各自的标准曲线，用于建立标准曲线的标准浓度个数取决于分析物可能的浓度范围和分析物/响应值关系的性质。必须至少用6 个浓度建立标准曲线，对于非线性相关可能需要更多浓度点。定量范围要能覆盖全部待测的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品（不加内标）与零浓度样品（空白生物样品加内标），但计算时不包括该点，仅用于评价干扰。标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差在可接受的范围之内时，可判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能对临床待测样品进行定量计算。当线性范围较宽的时候，推荐采用加权的方法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。

4.3.1. 最低定量限(Lower Limit of Quantification (LLOQ))

一般以标准曲线的最低浓度作为方法的最低定量限，对最低定量限有以下几个要求：

· LLOQ的检测器响应值应当至少达到空白样品的检测器相应值的5倍；

· LLOQ的色谱峰应当可以确认，保证一定的峰形并可重现。此浓度精密度保证在20％以内，准确度保证在80－120％以内；

4.3.2. 标准曲线样品浓度与响应值之间的关系(Calibration Curve/Standard Curve/Concentration-Response)

一般要求用最简单的模型充分描述样品浓度与响应值之间的关系，即最小二乘法。对于浓度范围跨度较大的标准曲线可选择加权的方法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。使用某些复杂的回归方法需充分说明使用的必要性与有效性。建立的标准曲线一般需满足以下要求：

· LLOQ的准确度在80－120％以内；

·除LLOQ的其它浓度准确度在85－115％以内；

应当至少有2/3的非零值标准曲线样品满足以上要求，包括LLOQ与标准曲线上限的样品。不合格样品的剔除应当不对标准曲线的回归模型产生影响。

4.4. 稳定性(Stability)

根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻或冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应注意考察储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证检测结果的准确性和重现性。稳定性试验的考察项目应当反映样品于实际处理过程及分析过程

中可能遇到的各种储存条件下的稳定性。

4.4.1. 冻融稳定性(Freeze and Thaw Stability)

应当至少考察高浓度与低浓度两个浓度的生物样品经过三次冻融后的稳定性。每个浓度各3份样品于拟定储存环境下放置24小时后于室温自然融化，完全融化后样品重新于相同条件下冰冻12－24小时。经过至少三次冰冻－融化循环后，考察样品浓度的变化。通常选择－40～－20℃为生物样品的储存条件，若考察结果表明样品于该温度条件下储存不稳定，则应当重新于－70℃考察样品的冻融稳定性。

4.4.2. 室温条件下稳定性(Short-Term Temperature Stability)

应当至少考察高浓度与低浓度两个浓度的生物样品在室温条件下的稳定性。每个浓度各3份样品于室温下自然融化，并于室温条件下保存4－24小时（根据样品测定时预计可能于室温下的放置时间而定），考察室温条件下放置后样品的稳定性。

4.4.3. 长期稳定性(Long-Term Stability)

长期稳定性考察的周期应当囊括从生物样品采集到最后一个生物样品分析完成的整个时间。应当至少考察高浓度与低浓度两个浓度的生物样品在的长期稳定性。每个浓度各3份样品于拟定的储存温度下（一般为－20～－40℃）保存，每份样品的量应当能保证至少进行3次分析。通过比较分析得到的样品浓度的均值与长期稳定性开始第一天样品测定的平均值判断样品的长期稳定性。通常选择－40～－20℃为生物样品的储存条件，若考察结果表明样品于该温度条件下储存不稳定，则应当重新于－70℃考察样品的长期稳定性。

4.4.4. 储备液稳定性(Stock Solution Stability)

待测物与内标的储备液应当至少考察于室温条件下放置6个小时的稳定性。若储备液于冰箱或冰柜中储存一定的时间，也应当考察其在储存时间内的稳定性。当储存时间到期后，通过考察其响应值与新配制溶液响应值的差异考察其稳定性。

4.4.

5. 处理后样品的稳定性(Post-Preparative Stability)

经过生物样品预处理后的待测溶液，可能于室温下或于各种不同的自动进样器上放置一定的时间才能进样分析，因此需考察处理后样品中待测物与内标的稳定性。考察的周期一般为预定的样品分析时一个分析批的整个分析时间。应当至少考察高浓度与低浓度两个浓度的生物样品在的经处理后代测溶液于拟定放置环境下稳定性。每个浓度各3份样品于拟定的储存条件下保存，通过比较分析得到的样品浓度的均值与该稳定性考察开始第一次测定的平均值判断处理后样品的稳定性。

4.5. 相关注意事项(Specific Recommendations)

·方法验证的基本项目为：⑴选择性，⑵准确度、精密度、回收率，⑶标准曲线，⑷待测物在血浆中的稳定性。

·对于该生物样品测定中的仪器、试剂、方法与流程均应详细描述与记录。即建立该生物样品分析方法的SOP。

·该生物样品分析方法中从生物样品采集到未知生物样品的分析的整个过程中的每一个操作步骤均应详细研究，以考察环境、生物基质、试剂材料或操作流程的变动对测定结果的影响。

·应当重视生物基质生理生化性质的改变对分析方法的影响。对于LC-MS-MS或LC-MS方法，有必要采用适当的方法考察基质效应对分析方法实施全过程的影响，特别是方法确证中基质性质改变对分析方法的影响。

·一种生物样品分析方法应当就其预计用途作详细的方法验证。方法验证中所有的试验结果与结论均应呈现在方法验证的报告中(Method Validation Report)。

·在条件许可的情况下，应尽量使用与代测生物样品生物基质相同的生物基质作方法验证。若使用某些难以获得的生物基质（如骨髓），也可使用某些生理相容的基质替代其作方法验证。

·推荐在未知生物样品测定之前完成待测物（药物/代谢产物，也包括内标）在生物基质中的系统稳定性研究。

·对于某些可能在生物基质中发生代谢降解产生代谢产物的药物，应当增加待测物在实际待测生物样品中的稳定性的考察项目。

·对于分析内源性物质、代谢物或已知代谢降解产物分析方法，应当考察其于代测生物基质中的准确度、精密度、重现性、响应方程与方法的专属性。如方法的专属性考察，应当提供分析物质即待测物质的证据。

·在大多数情况下标准曲线的浓度点达到6－8个（除空白样品与零值样品外）即可保证标准曲线能够充分描述该浓度范围内响应值与浓度线性关系的连续性。若使用非线性方法获得标准曲线，则应当在以上线性的基础上再增加标准曲线的浓度点。

·高于定量范围高限的样品应当经过相同的生物基质稀释后测定，方法验证时应当考察稀释方法的准确度与精密度。

·在高通量分析方法中，如多路技术(multiplexing)、多层柱技术(multicolumn)与平行分析系统，更应当重视方法的质量控制。质控样品的数量应当能保证控制分析方法的各个环节，质控样品的分布应当合理保证控制整个分析批的分析质量。

5. 生物样品分析测定质量控制(Quality Control)

只有在生物样本分析方法确证完成之后才能开始测定未知样品。在测定生物样品中的药物浓度时应进行质量控制，以保证所建立的方法在实际应用中的可靠性。本实验室采用盲法对生物样品测定全程进行质量控制，由项目负责人或项目负责人委托不参加样品分析的有经验人员按照质控样品配制标准操作规程配制质控样品，样品测定组成员未知配制质控样品浓度，进行分析测定。

每个未知样品一般测定一次，必要时可进行复测。对于某些精密度与准确度难以达到很高的方法，则需采用每个未知样品测定两次或三次的方法提高分析方法的准确度。

5.1. 分析批(Analytical Batch/Run)

分析批是指未知样品测定的一个独立的分析周期，每个分析批要求包括一定数量的质量控制样品（要求数量大于未知样品的5％）、一条合格的标准曲线与一定数量的未知样品。一个分析批可包括所有的未知待测样品，也可仅包括一个或几个自愿受试者的未知待测生物样品，一个分析批的分析周期不能超过三天。一个分析批中未知样品的数量一般由样品处理与进样分析的效率决定，样品处理及进样分析的自动化程度越高，周期越短，分析批中的未知样品数量就可越多。本实验室进行生物利用度/生物等效性或药代动力学研究时未知样品的测定，要求每个分析批包含的未知样品数量为80－120个，每个分析批中质控样品的数量为未知样品数量的10％，即8－12个/分析批。

5.2. 随行标准曲线(Calibration Curve/Standard Curve)

来自同一个体的生物样品要求在同一分析批中测定。每个分析批生物样品测定时对每个待测物应建立新的标准曲线，制备的标准曲线样品可同时包括一个或几个待测物，但要求待测物的信号响应之间互不干扰。不得使用外推法计算标准曲线以外的未知样品浓度（包括在LLOQ以下的浓度与最高定量浓度以上的浓度）。在进行数据分析时，在达到Cmax以前取样的样品应以零值计算，在达到Cmax 以后取样的样品应以无法定量（Not detectable, ND）计算，以减小零值对AUC 计算的影响。若出现超出标准曲线定量范围最大浓度的未知样品，推荐重新制备标准曲线并进行调整后方法的部分确证，也可将超出定量范围最大浓度的未知样品稀释后重新测定。

5.3. 质控样品(Quality Control Sample)

对质控样品的要求如下：随行测定至少3个平均分布在标准曲线范围的浓度（低浓度在LLOQ的3倍以内，中浓度为标准曲线中间浓度，高浓度接近标准曲线定量范围最高浓度）的质控样品。质控样品平均分布于分析批之内。质

控样品测定结果的偏差一般应小于15%，低浓度点偏差一般应小于20%，最多允许1/3 的质控样品结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度质控样品中。如质控样品测定结果不符合上述要求，则该分析批样品测试结果作废。

5.4. 异常值、溢出值的判定与样品重测(Verdiction of Abnormity/Overflow and Repeat Analysis)

对于生物利用度/生物等效性与药代动力学研究，每个分析周期完成后应当对于未知生物样品的测定结果进行评价，首先根据质控标准判断该分析批分析样品是否合格。然后标记出现异常情况的数据，筛选出溢出值计划进行重新测定。在判定之前首先需对原始生物样品进行检查，观察储存管是否破损或污染。除此之外，对于某些全部或大部分样品点均出现异常的自愿受试者个体，应当联系Ⅰ期临床病房负责人，调查该受试者是否按照该项目临床试验方案执行临床试验（特别是服药环节）。明确以上因素后再进行溢出值的筛选与测定。

溢出值是指在规则的药时曲线中突然出现的明显偏离预计值的数据点，溢出值的判定一般原则如下：如该未知样品的时间点处于达峰时间之前，其测定浓度高于其后时间点的样品或低于其前时间点的样品，则判定其为溢出值；若该未知样品的时间点处于达峰时间之后，其测定浓度低于其后时间点的样品或高于其前时间点的样品，则判定其为溢出值。若溢出值重测后结果无显著变化，则保留第一次测定结果或以几次测定的平均值作为该样品的测定结果。

除对异常值/溢出值需要进行重测以外，还需要对存在以下情况的样品进行重新测定：该生物样品分析SOP规定需进行二次或三次测定的生物样品，数次测定前后结果不一致的样品，超出标准曲线定量范围的样品，预处理过程中出现差错的样品，分析过程中仪器损坏或出错的样品，分析色谱柱柱效降低时分析的样品等等。如待测生物样品量允许，重测一般至少进行2－3次，样品重测的原因及测定过程均应详细记录。

5.5. 相关注意事项(Specific Recommendations)

·建立一条基于待测生物样品的生物基质的标准曲线。不包括空白与零值样品，标准曲线应至少有6个浓度点，囊括未知待测样品的整个浓度范围。

·浓度－响应方程：一般而言，在进行未知样品测定时制备的标准曲线方程应该与前期方法建立与确证时制备的标准曲线方程具有一致的拟和度、拟和优度与权重。标准曲线计算时采用的统计学软件也应当保持前后一致，统计学软件的选择由标准曲线的浓度点与浓度范围决定。前期方法确证时与后期未知样品测定时标准曲线斜率、截距与相关系数的任何显著变化均表明该方法或该方法中的某些操作过程具有某些潜在的缺陷。因此，在方法确证的时期就应当详细考察该方法标准曲线的重现性。

·质量控制样品同样由基于待测生物样品的生物基质加入待测物参比纯品的方法制备。通过质控样品测定的结果反映该分析批未知样品测定的准确性（合格或重测）。

·若生物样品中待测物的稳定性与方法的准确度已经得到确证，分析批中的标准曲线与质控样品可由同一储备液配制。若该分析方法的特异性与选择性已经得到确证，分析批中的标准曲线与质控样品也可由同一生物基质配制。

·系统适应性：基于不同的待测物与分析技术，建立关于该生物样品分析方法的规范的、详尽的、适宜的与可操作的SOP，以保证分析结果的准确性。

·当需要对高浓度未知代测生物样品进行稀释时，应当使用同待测生物样品的生物基质相同的空白生物基质进行稀释。

·应当建立判断溢出值的标准相关的指导原则，并建立样品重新测定相关的SOP。

·未知样品测定结果的再汇总分析：当出现需要进行样品重测的情况，在样品重测结束后应当建立未知样品测定结果汇总的SOP或指导原则。该SOP 或指导原则应当解释进行结果再汇总分析的原因，并记录操作规程。再汇总分析前的未知样品测定结果汇总分析结果也应当记录在案。

6. 记录与报告(Documentation)

生物样品建立完成后应当对生物样品分析方法的建立、确证全过程中涉及的仪器、参比纯品、试剂、试液、操作流程及结果分析处理方法与软件等均应详细记录，并制定该生物样品分析的SOP。未知样品的测定及质控完成后同样应当详细记录以上内容，以便进行数据的审查与复核。向项目负责人或实验室负责人提供的记录应当包括：⑴总结报告，⑵方法的建立与确证记录，⑶未知样品的分析与质控记录，⑷其它涉及方法建立与确证或未知样品分析的内容。

6.1. 总结报告(Summary Infomation)

当项目实行中涉及多个生物样品的分析方法与分析方法的SOP时，对每种方法与方法的SOP均应进行编码。总结报告应当包括以下内容：·该项目涉及的分析方法确证报告的总结性表格，包括各种分析方法的确证、分析方法调整后的部分确证以及交叉确证报告。报告项目的内容以时间顺序排列，每个项目的内容应当包括分析方法的识别编码、分析方法的类别、分析方法的应用范围、目的、分析方法的主要参数（如LLOQ、线性范围）与调整或增加方法验证内容的原因（如降低分析方法的LLOQ）。

·该项目中涉及各种分析方法的SOP的总结性表格。包括SOP的编号、

名称、分析方法的类别、分析方法的识别编码与生物样品分析报告的编码。

·进行交叉确证时，应提供各种分析方法的识别编码，特别注意各实验室为同一分析方法分配的编码不同的情况。

6.2. 方法的建立与确证记录(Method Development and Validation)

方法的建立与确证记录应当包括以下内容：

·方法中涉及的参比纯品、仪器、试剂、试药以及各种数据处理软件的详细描述。

·该分析方法的详尽的可操作性描述（该方法的SOP），应当保证任何有经验的分析人员能按照此SOP进行该分析方法的建立与确证，及其未知样品的分析与质量控制。

·待测物参比纯品、代谢物参比纯品及内标的鉴别与纯度数据（质检报告）。

·待测物与内标在各种条件下的稳定性研究数据。

·该方法标准曲线建立的结果及相关数据（标准曲线方程、相关系数、回归方法、软件版本、权重等等）。特别注意应当至少提供3条标准曲线的斜率、截距与相关系数的平均值与标准差。

·提供该方法的准确度、精密度、回收率、特异性、LLOQ以及其它相关数据。

·精密度数据应当包括日内精密度与日间精密度。

·某些相关的交叉方法确证数据。

·方法建立与确证过程中产生的所有色谱图与质谱图。

·方法中背离SOP、指导原则或GLPs的相关内容及合理性解释。

6.3. 未知样品的分析与质控记录(Application to Routine Drug Analysis)

未知样品的分析与质控记录应当包括以下内容：

·若未知样品测定时使用的参比纯品与方法建立与确证时使用的参比纯品不同，则应提供相关的参比纯品（待测物或内标）的鉴别与纯度数据（质检报告）。

·生物样品采集与储存的详细记录，其内容应当包括生物样品的名称、采集方法、转移之前的储存条件、转移的批量与程序（相关SOP）与转移后分析前的储存条件。应记录相关操作的日期、时间、生物样品状态以及任何与SOP 或指导原则不符的操作。

·待测生物样品每个分析批的分析结果与详细报告。包括分析批中未知样品的数量、编号、质控样品的数量、编号及于分析批中的分布，分析批开始与结束的时间、分析方法、操作人员、分析过程中仪器与试剂/试药的更换，以及任何背离已经建立确证方法的情况。

·每个分析批的标准曲线建立的结果及相关数据（标准曲线方程、相关系数、回归方法、软件版本、权重等等）。提供所有分析批标准曲线斜率、截距与相关系数的平均值与标准差。

·所有分析批中质控样品分析的原始数据、结果及总结报告。应提供批内与批间质控样品的准确度与精密度。推荐提供质量控制的示意图、倾向分析与总体统计分析结果。

·提供所有分析批中未知样品、标准曲线与质控样品的分析色谱图。

·样品缺失的原因。

·重测样品的详细记录。应当包括进行重测的原因，最初测定的结果与重测后的结果及比较分析，最终进入数据分析的结果；同样应当包括重测样品分析批中的所有相关质控内容。样品的重测应按照预定的SOP进行。

·数据重新汇总分析的记录。应当包括最初汇总分析的结果与重新汇总分析之后的结果，重新汇总分析的方法、原因及要求进行重新汇总的人的签名。重新汇总分析也应当在预定的SOP下操作。

6.4. 其它内容(Other Infomation)

与生物样品分析方法建立与确证及未知样品的分析及质量控制相关的其它记录如下：

·记录中相关缩写的列表。

·参考文献列表，如可能附上主要参考文献的全文。

·方法建立的相关指导原则与相关SOP列表。

·标准曲线是否合格的判定标准。

·分析批是否合格的判定标准（质控样品分析结果是否合格的判定标准）。

·报道数据的判定标准。

·项目中所有未知样品于分析批中的分布。

·项目中所有未知样品的编号原则及标准曲线与质控样品的编号原则。

7. 参考文献(Reference)

1. FDA.Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, May 2001

2. SFDA.化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则, 2005.3

3. 中国药典2000 版二部.药物人体生物利用度和生物等效性试验指导原则，附录193-197

4. 中国药典 2005 版二部. 药物人体生物利用度和生物等效性试验指导原则，附录173-176