影响ELISA检测HBsAg结果的常见因素
对ELISA方法检测HBSAg结果的分析
对ELISA方法检测HBSAg结果的分析当前国内临床检测乙型肝炎表面抗原(HBSAg)多采用ELISA双抗体夹心法，其基本原理是:1.将抗体包被在载体后作为固相，加入待测标本，使其中的相应抗原通过免疫学反应结合到固相抗体上，洗涤除去未结合的抗原。
2.加入酶结合物与已结合在固相抗体上的抗原反应，并洗涤除去未结合的游离未结合物。
3.加入酶（常用辣根过氧化物酶）的相应底物，固相化的酶催化底物反应生成有色产物。
在一定温度下一定时间后终止反应，显色物的量与在固相上的抗原有关。
该方法检测HBSAg时，影响的因素很多，有内源性物质和外源性物质两大类。
血清是最常见的ELISA标本，大约有40%的人血清标本中含有类风湿因子，补体，嗜异性抗体，嗜靶抗原自身抗体等非特异性物质，对ELISA测定有干扰作用易造成假阳性或假阴性结果，这不是人为因素造成的。
在临床检验工作中，常因标本量多，紧急要求出检验报告，较难逐个分析其内源性的物质，而忽略它的存在。
而工作中，因血样的采集，储存及操作程序等不当所致的外源性物质的干扰，最易影响ELISA的测定结果。
本文对检验工作中经常出现的如标本溶血，标本被细菌污染，标本储存过久，标本凝固不全等因素进行分析。
1.标本溶血由于各种人为因素引起标本溶血，使红细胞溶解细胞内的过氧化物酶进入血浆，并大量吸附于细胞碎片及纤维蛋白原上,从而造成以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，非特异性显色，出现假阳性。
有试验证明溶血标本HBSAg假阳性率达91.7%[1]。
要认真做好标本的保存和处理工作，防止溶血。
2.标本受到污染标本受细菌污染，因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶同样易产生非特异性显色，出现假阳性。
3.标本放置时间在冰箱中保存过久的标本，血清中IGg可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在ELISA测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。
采血后若不在当天检测，应置于2-8℃冰箱中，若要储存，则置于-20℃低温冰箱内保存。
ELISA法检测HBsAg影响结果因素的分析
乙型肝 炎是我 国发病 率较高的传染病之一 ，常通过消化道 和血液传播 ，当人 感染 乙型 肝炎病毒 （Ｂ ） Ｈ Ｖ 后在身体 内很难清
大学 学报 ，２ ０ ，２ ４ ：２ ６ ２ ０ ０ ６ ４（） ５ — ６ ．
பைடு நூலகம்
具塞磨 口锥形瓶 中，加入 Ｎ ０ ａ Ｈ溶液 ，在室温下浸泡 ，超 声提
取 后 ，用 １％ 酸 调 节 Ｐ ０盐 Ｈ至 有 大 量 土 黄 色 沉 淀 生 成 ，调 节 Ｐ Ｈ
值为 ３ 左右 。离心 ，倾去上清液 ，沉淀用 甲醇溶解 １ ｉ ，抽 ５ ｎ ｍ 滤，滤液转入 １０ Ｌ的容量瓶 中定容至刻度 ，经 ０ ４ ０ｍ ． ５ａ ｌｍ微孔 滤膜过 滤即得供试 品溶液 。 ２ ３３ 正交 实验 结果与分析 ．． 采用 Ｈ Ｌ 法测定蛇床子 素的含 ＰＣ 量 ，其结果见表 ３ 。由表 ３直观分析 Ｒ值可知 ，影 响提 取的因 素顺序 为 Ｃ ＞Ａ ，超声时间是提取的关键因素， ＞Ｂ ＞Ｄ 浸泡 时间
重庆维普
度 （） Ｄ 四个因素 。采用 正交表进行正交试验设计 （ 见表 ２ ，优 ）
选蛇 床 子 素 提 取 工 艺 。
表 ２ 因素 水平表
和 碱 用 量 次 之 ， 浓 度 影 响 最 小 。所 以最 佳 提 取 工 艺 是 碱 ＡＢＣＤ ３ ２ １２即加 ３ ０倍 量 ２％ ａ Ｈ溶液，浸泡时间 １ ５ｈ Ｎ０ ． ，超声
表 ３ Ｌ （４ 正 交 实验方 案与 结果 （＝ ） ９ ３） ｎ３
３ 讨论
本实验 比较 了水煎煮提取 、乙醇超 声提 取、碱浸渍法 、碱
溶酸沉超声提取不 同的提取方法 ，结果表明碱溶 酸沉超声提取
法提取率最高，无需加热 ，不 使用有机溶剂 ，成本低 ，安全性
ELISA法检测HBsAg影响结果的重要因素的分析
生国塞堕堡堑堂！塑堡！旦筮！！鲞复２翅文章编号：１００７—４２８７（２００７）０２—０２１３—０３—２１３一ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢｓＡｇ影响结果的重要因素的分析岳希全，石宏，李迎（北华大学附属医院感染科，吉林吉林市１３２０１１）摘要：目的确定温育温度、时间和条件对定性酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）涣｛定结果的影响，为临床检验提供最佳方案。
方法温育温度分别设为３７℃组和室温组。
”℃组温育时间分别为４５分钟、６０分钟、７５分钟、９０分钟和１２０分钟。
其中室温组温育中又分别采用振荡和静置两种条件，温育时间分别为４５分钟、１小时、２小时和４小时。
检测阴性血清和Ｏ．２、０．５、１、２，５ｎｇ／ｍｌｎＳｓＡｇ系列定值血清，观察这些条件下标本测定Ｓ／ＣＯ比值的差异。
结果在同一温育温度下，所有被检血清的Ｓ／ＣＯ比值均随着测定温育时间的延长而增大，浓度越低表现越为明显，以０．２ｎｇ／ｎ１１的样本，温育２小时的Ｓ／ＣＯ比值与温育１小时相比，均有明显的增加，０．２ｎｇ／ｍｌ的样本由按ＣＵＴ－ＯＦＦ值判断为阴性而转为阳性。
对照组阴性血清的Ｓ／ＣＯ比值在温育各时间则变化不大。
室温组在振动状态下反应较之静止状态下的反应，Ｓ／ＣＯ比值均有明显增加。
结论温育条件对ＥＬＩＳＡ测定结果有很大影响，尤其是弱阳性标本，由于温育条件不当会造成假阴性，增加传染机率。
关键词：酶联免疫吸附试验；温育；乙型肝炎表面抗原；定性测定中图分类号：Ｒ５１２．６＋２文献标识码：ＡＥｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅＥＬＩＳＡＹＡＯＸｉ－ｑｕａｎ，ＳＨＩＨｏｎｇ，Ｉ＿１Ｙｉｎｇ．（Ｔｈｅ够ｆｉ做矗ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＢｅｉｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，朋讥Ｃ／ｔｙ１３２０１１，Ｃｈ／ｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｉｍｅａｎｄｍｏｄｅｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｌＢｓＡｇｂｙｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅＥＬＩＳＡ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｎｅｇａｔｉｖｅｓｅｒｌｌ／ｎｓａｍｐｌｅａｎｄａｓｅｒｉｅｓｏｆｓｅｒａｓａｍｐｌｅｓ柄ｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔＨＢｓＡｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｏ．２，０．５，１．０，２．０，５．０ｎｇ／ｍ１）ｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｃｏｍｍｅｒｃｉａｌＨＢｓＡｇＥＬＩＳＡｋｉｔｓｕｎｄｅｒｃｏｎｄｉｔｉｏｍｓｅｔ８８ｆｏｌｌｏｗｓ：ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｉｍｅｗａｓｓｅｔｆｏｒ４５，６０，７５，９０ａｎｄ１２０ｍｉｎｕｔｅｓｗｈｅｎｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｗｅｌｔ＇ｌ！ａｔ３７。
ELISA法检测HBsAg影响因素的分析
!讨论"#$%&’()*%试剂盒中+包被抗体的浓度,纯度,效价,亚型的选择等对试剂的灵敏度,特异性及稳定性有很大的影响-随着单克隆抗体和基因工程抗体的应用+包被自动化程度的提高+包被抗体的浓度,纯度,效价的差异和包被抗体的加样差异造成的影响得到了一定程度的消除+而’()*%微孔板各板孔间的差异仍然难以解决-’()*%微孔板是用苯乙烯聚合物聚苯乙烯塑料制成+苯乙烯对蛋白质有吸附作用+在苯乙烯聚合成聚苯乙烯后+由于微孔板各微孔的间隙和密度不同+因此对蛋白质的吸附能力也不同-不同吸附能力的微孔在包被浓度和量相同的抗体时+会使板孔间吸附的抗体浓度不同+导致检测结果出现偏差-目前国产板条的制造工艺与进口板条有一定的距离+使得国产’()*%试剂与进口试剂质量上有较大的差别+有报道国产试剂的./值接近012345-进口试剂板条各微孔的间隙和密度均一性较好+./值可达到62-表4和表7./值都很大+说明同一块板孔间差异很大-表4%0孔和表7#8孔9:值和*;.9值超过<=>!*:+推测可能这两个孔吸附能力较强+吸附了非特异性蛋白所致-如这两孔加入质控品则会失控+加入阴性样本会出现假阳性结果-表!%4,%0,%!,%7,%6,%?,%@,%41,#0,#6孔结果虽然在A B C4*:范围内+没有失控+但*;.9D4E1+结果判断为阴性F推测可能上述孔对蛋白质的吸附能力较弱所致-如在上述孔加入临界质控品或临界待测样本会出现假阴性结果-表!%厂所有的临界值结果*;.9G4E1+为阳性结果+说明%厂的这块微孔板灵敏度比#厂高-表4%厂./值为!1E!2+表0#厂为40E42F表!%厂./值为40E?2+表7#厂为!!E!2+说明厂间,板间的差异都较大-表6%厂./值为6E82+表?#厂./值为7E!2+表明"#$%&含量达41111H&;I J时+两厂试剂都没有出现后带现象-由上述各表结果可知+’()*%微孔板孔间+板间及厂间均存在较大的差异+这些差异是导致质控失控+结果偏差的最难避免的因素+无法用室内质控来控制-因此+我们在日常工作中遇到不常见模式或与临床不符的结果时+应考虑板条的影响+用原血清重新检测-尽管每一新批号的国产试剂在投入市场前必须经过批批检+但由于批检是随机抽检+抽检量相对整批试剂量非常少+并不能保证所有试剂全部合格F上述试验仅是我们的抽检结果+也不能说明该批号所有试剂都如此+但这种情况确实存在-我们在每一新批号试剂进入我们的试验室时+应做灵敏度,特异性,符合率及均一性试验+了解该批试剂的质量+遇到与临床不符的结果可帮助我们分析检测结果偏差的原因+并及时解决-同时厂家应加大力度提高微孔板质量305+缩小国产板条与进口板条质量上的差距-参考文献4郑怀竞+王露楠+王文丽+等E全国临床免疫室"#$%&检验室内质量控制的评价3K5E中华肝脏病杂志+4@@?+7L!M N4?@ 0施根林+何海明+林国英+等E"#$%&’()*%定性检测影响因素观察3K5E现代医药卫生+0114+4O L0M N46!P467’()*%法检测"#$%&影响因素的分析江苏省姜堰市梁徐卫生院L00660?M柳林风"#$%&是实验室常见的检测项目+是诊断乙型肝炎的重要指标之一+’()*%法检测"#$%&具有灵敏度高,特异性强等优点而被广泛应用-但在具体实践工作中+有时会遇到"#$%&检测结果前后不一致或与其他单位的检测结果不一致的情况+除了使用不同的试剂盒以外+其原因是多方面的-本文就我们实际操作中的影响因素加以分析-4器材的影响一次性塑料试管以其价格便宜,不易破损,免洗,无交叉污染等优点被大部分实验室接受+但塑料试管长时间存放标本会对最后的检测结果产生影响+可能由于一次性塑料试管由聚乙烯制造+易吸附抗原物质+导致结果负向偏移+尤其对抗原滴度较低的样品长时间存放可能出现假阴性结果+建议使用玻璃试管-0标本来源方面通常我们采用静脉血分离血清后检测+对难以采血的婴儿及大批量的健康检查时+微量末梢血检测"#$%&不失为一种良好便捷的方法-但末梢血中易混有组织液+稀释了血清+增加了粘度+吸附力较强+洗板不彻底会出现假阴性结果+故需注意末梢采血时进针宜深+便于血液流出+避免用力挤压+使大量组织液混入标本内+建议尽量采用静脉血-!内源性物质的干扰方面!E4标本溶血时红细胞内"Q物质游离入血清+"Q具有类过氧化物酶活性+其作用效应与辣根过氧化物酶类似+8O6R S T U V W V X YV Z[\]^_^S\+‘_T E a b b c+d V W E a e+fV E g如果反应孔因非特异性吸附!"而残留#则会催化底物显色造成假阳性$若反应板包被质量好#操作规范#洗板充分#则可大大减少或排除非特异性吸附力的干扰$%&’脂浊血清对检验结果的干扰可能主要是乳糜粒增多引起$脂浊造成血清黏度大#但分子运动速度减慢#减少了抗原抗体的结合机率#并且乳糜微粒对抗原抗体有屏蔽效应#对测定结果产生了负干扰$%&%()*+,)补体自身抗体阳性的样品#由于这些物质能够与固相抗体#酶标抗体的)-段结合#所以易产生假阳性结果$.结果的观察肉眼观察阳性结果呈蓝色#但弱阳性结果不易判断$如果只好采用肉眼判断#检验员差异或检验员在不同条件下观察实验结果都可以出现偏差$所以应使用多功能酶标仪检测#以保证结果判断的准确性$综上所述#影响!/0(1的因素很多#这就要求我们要增强责任感#对实验条件+操作规程+试剂与仪器+实验人员的操作水平等进行严格的质量控制#充分认识和避免以上因素的影响#很好地保证检验报告的准确性$参考文献2曹文飞&酶联免疫测定的干扰因素与对策345&中国实验临床免疫学杂志#2667#289%:;<8’尤风光&=>?@(一步法检测!/0(1假阳性若干问题探讨345&中国卫生检验杂志#’882#229<:;A %2BA %’我院临床标本送检及药敏结果分析广西罗城仫佬族自治县人民医院9C .<.88:饶秋凤蒋春清为了解我院标本送检+病原菌分布及抗菌药物的耐药性#我们对近三年来临床标本培养及药敏结果进行回顾性调查分析#现报告如下$2资料与方法所有资料来自检验科#对’882年2月至’88%年C 月临床科室A ’.份送检标本及药敏结果资料进行分类调查$’结果’&2概况此期住院总人数72.’人#标本送检总数A ’.份#送检率7&76DE 检出菌.’%株#阳性率C 7&.%D#不同科室标本送检情况见表2$’&’病原菌的构成’882年+’88’年+’88%年革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌分别为’6&%7D+’A &2’D+%<&C .D 和<%&.2D+<.&.8D+C 2&6%DE 革兰阳性球菌以金黄色葡萄球菌为主#革兰阴性杆菌以大肠埃希菌为主#具体分布见表’$表2不同科室标本送检情况科室病人数送检例数送检率9D:儿科2’<’A A<&28内一C <%A 72%&7C 内二’88C %.82<&6<内三%<C A 226&.C 外一2%<A 6%<&78外二2C 8C .7%&26妇产28A C2A2&C 7表’三年病原菌分布情况炳原菌’882年’88’年’88%年合计株数D 株数D 株数D 株数D金黄色葡萄球菌%22C &67’72C &7’2’’%&8A A 22<&A 7其它葡萄球菌2%<&A 82.A &62C 6&<’%’A &C A 链球菌6.&<.<%&%6’%&7C 2A .&8’肠球菌.’&8<F F F F .8&6C 肺炎克雷伯菌22C &<A 28&C <’%&7C 2.%&%2大肠埃希菌%22C &67’’2’&.%A 2%&.<<82.#27铜绿假单胞菌2%<&A 8C ’&7’’%&7C ’8.&A %其它假单胞菌2.A &’’2728&2A F F %’A &C A 福氏志贺菌C ’&C 7%’27&87.A &<6.26&<6不动杆菌A %&<22’<&A 7%C &A A ’’C &’8变形杆菌6.&<.C ’&7’22&6’2C %&C C 其它G H杆菌%%2A &822628&A .72C &%6<82.&27G H杆菌28&C ’.’&’<22&6’<2&.’G H球菌A %&<86C &8622&6’2A .&8’真菌<%&86’2&2%.A &<62’’&7%合计26.2882A A 288C ’288.’%2886A C 医学文选’88.年28月第’%卷第C 期。
血清标本质量对ELISA法检测HBsAg结果的影响
血清标本质量对ELISA法检测HBsAg结果的影响【摘要】目的血液标本的采集是分析前质量控制的重要环节，静脉采血如果穿刺不顺利容易造成标本的溶血.脂血影响检验结果。
方法：ELISA法是目前常见的监测HBsAg方法之一。
用ELISA法对41份弱阳性标本进行检测。
结果：溶血标本；脂血标本及标本量不足勉强操作的标本对监测结果影响较大，特别是对弱阳性结果影响更为明显。
结论：血清标本的质量对ELISA法检测HBsAg结果的有影响【关键词】酶联免疫吸附试验；乙型肝炎表面抗原；血清标本检验标本采集的是否规范直接关系到检验标本数据的准确性，对于疾病的诊断和治疗有着重要的意义。
不合格的标本是导致检验结果失真的主要原因之一，严重干扰临床医生对疾病的诊断和治疗，甚至可造成错诊和误诊，不但增加患者的痛苦，同时又浪费了卫生资源。
ELISA法是目前常见的监测HBsAg方法之一。
我们平时对一些弱阳性标本进行筛查，发现溶血标本，脂血标本及标本量不足勉强操作的标本对监测结果影响较大，特别是对弱阳性结果影响更为明显。
本文通过对弱阳性结果标本的重新测试，探讨标本质量对ELISA结果的影响。
1 材料和方法1.1实验试剂和仪器英科新创（厦门）科技有限公司生产的HBsAg试剂盒；德国Multiskan MK3酶标仪。
1.2 标本来源本院大批体检经HBsAg初筛，A值在0.1-0.125之间的弱阳性标本41份。
其中溶血标本12份（轻度溶血7份，重度溶血5份），非溶血标本29份。
1.3 方法对有重度溶血与轻度溶血的12份标本实行重新采样，采用速凝管采血，以3600r/min离心15min，吸取血清。
以上每份标本实行HBsAg双孔复试。
2 结果2.1 原溶血标本重复检测结果原溶血的12份标本，经重新采样，重新测试有4份阴性，其余8份仍为弱阳性。
4份阴性标本中，有3份为原来重度溶血，1份为轻度溶血。
2.2 非溶血标本复试结果非溶血的29份标本，经重新处理重新测试后，有3份为阴性，其余26份仍为弱阳性。
ELISA检测HBsAg影响因素探析
中图分类号
EL ISA 方法具有简便 、 灵 敏度高、 特异 性强 等特点 而被 广 泛应用 , 成 为 目前 检测 H BsA g 的常 用方 法。但 EL ISA 进 行 HBsAg 检测时易受试剂、 标本、 操作等 诸多因 素影响 出现假 阳 性或假阴性结果 , 因此 应从 以下 几方面 加强 监测 , 减少 错误 结 果的产生。 1 仪器设备 目前 ELI SA 法检测 HBsAg 以半自动 检测为主 , 通常会 用 到酶标仪、 洗板机、 水浴箱、 冰箱、 移液器等 仪器设备 , 在日常 工 作中应保证各种仪器正常运行 , 定期检修。 2 试剂因素 选择正规厂家生产的具有批批检合格 报告的试剂 , 且在 试 剂有效期内使用。试剂盒在使用前应从 4 ! 环境取出 , 在室 温 条件下平衡 30 min, 恢复 至室温 方可拆 封进 行检测 , 避 免温 度 过低在微孔板底形成冷凝水影响检验结 果。研究表明 , 平衡 时 间在 30 min 时间以内 , 灰 区及 阳性 标本 的吸 光度 会随 着平 衡 时间的延长而增高 [ 1] 。剩 余的 微孔板 条及 时放 入带干 燥剂 的 密封袋内 , 冷藏于冰箱内备用。 3 标本因素 HBsAg 检测最常用的标本为 血清 , 也可用 血浆检 测 ; 血 清 标本应在 37 ! 水浴 30 min 充分凝 集 , 离 心时使红细 胞和纤 维 蛋白充分沉淀以分离彻底。吸样时避免吸 到纤维蛋白 , 以防 洗 板时堵塞洗板机吸头 导致洗 涤不 充分。标 本分 离时应 避免 溶 血 , 因为血红蛋白具有 类似 于过 氧化物 酶活 性 , 导致非 特异 性 显色而出现假阳性结果 , 某些细菌污染也 会出现类似 结果 [ 2, 3] 。 对于当天不能检测的样本应放置在冰箱冷 藏 , 与 试剂盒一样 恢 复至室温再行检测。 4 4. 1 操作因素 加样
ELISA检测HBsAg假阳性和假阴性的原因分析
ELISA检测HBsAg假阳性和假阴性的原因分析ELISA法假阴性原因1、标本用肝素或EDTA等抗凝处理易造成HBsAg检测结果假阴性，肝素抗凝血浆会增加OD值,可能与高浓度肝素具有强大的负电荷,能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中的辣根过氧化物酶活性，造成假阴性。
2、标本保存不当,在冰箱内保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体。
标本放置时间延长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，便出现假阴性。
因此若采血后不能及时检测，5天内检测标本分离血清置于4℃冰箱内；超过5天不能检测的，应放在-20℃低温冰箱中。
3、低浓度HBsAg标本（弱阳性HBsAg）易受加样时间（特别是大批量标本）、试剂平衡时间、溶血程度的影响，出现假阴性。
如加样时间在30分钟内的差异是最大的。
4、高浓度HBsAg在ELISA一步法检测中易出现假阴性，即HBsAg的钩状效应。
从原理来讲，一步法中HBsAg与包被板上的HBsAb及酶结合的HBsAb结合是双向的，当HBsAg浓度过高时，HBsAg与包被板上的抗体及酶结合物中的抗体均是单向结合，不能形成抗体－抗原－抗体酶复合物，使酶标记抗体在随后的洗板中洗掉，从而显出阴性结果。
但是在ELISA两步法中，高浓度的HBsAg只能与包被的HBsAb“饱和”地结合，多余部分被洗掉，随后加入的酶结合的HBsAb正好通过HBsAg的“桥梁”作用而结合在酶标板上，显示阳性结果。
因此当HBsAg强浓度时用ELISA一步法检测存在假阴性现象。
解决此问题的最好办法有：对标本进行稀释；不单检测HBsAg；采用ELISA两步法检测可消除漏检现象。
5、由于慢性病毒携带者(低水平HBsAg携带者)或HBV感染的潜伏期,HBsAg浓度低于检测水平的下限，由此造成假阴性。
6、S基因突变导致HBsAg的氨基酸结构改变，由于多数商用试剂盒检测系统采用的为多克隆抗体检测HBsAg的a决定簇，这一区域的点突变即可导致临界观测值或阴性结果，造成假阴性。
ELISA法检测HBsAg影响因素分析
边缘效应
１
【中图分类号ｌ
Ｒ４４ ６．６
ｌ文献标识码ｌ
【文章编号Ｊ
６７４－－０７４２（２００９）０９（ｂ）－－０１
７２－－０２
ＨＢｓＡｇ是实验室常见检测项目，是诊断乙型肝炎的重要指标 之一。ＥＬＩＳＡ发检．坝Ｉ］ＨＢｓＡｇ具有高灵敏度，特异性强而被广泛应 用，现就此方法在实际操作中的影响因素进行分析。
Ｍｅｄｉａｔ，２００７，８３（３）：１８８—１９７．
【４】Ｓａｐｅｙ Ｅ，Ｂａｙｌｅｙ Ｄ，Ａｂｒｏａｄ Ａ，Ｎｅｗｂｏｌｄ Ｐ’ｅｔ ａ１．Ｉｎｔｅｒ～ｒｅｌａｔｉｏｎ—
ｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ＣＯＰＤ ｗｉｔｈ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ：ｉｎｔｒａ～ｐａｔｉｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ～ｐａｔｉｅｎｔ
１ ７２
中外医疗ＣＨＩＮＡ ＦＯＲＥＩＧＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ
万方数据
综述
３８孑Ｌ）和中央孔Ａ值作成组配对ｔ检验，结果见表２。 ３讨论 内源性物质干扰因素，从表１中可以看出溶血和非溶血，乳糜
血与非乳糜血两组样本测定吸光度Ａ值无统计学意义，即两者对 明显。
ＣＨＮＡ
２ＱＱ２ 型鱼：２§ ＦＯＲＥＩＧＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ
ＣＨＩＮＡ ＦＯＲＥＩＧＮ ＭＥＤＩＣＡＬ
ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ中外医疗
１ ７３
万方数据
检验提供最佳参考方案。结果实验表明溶▲，脂血的标本用ＥＬＩＳＡ检测ＨＢｓＡｇ吸光度值无统计学意叉，对检测结果无影响。而边缘效应
的中央孔和周围孔在３种不同时间，不同的温孵方式中，吸光度值王著差异，水溶相对较小，孵育较大，室温ｉ为明里，而且同一温育温度
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影响ELISA检测HBsAg结果的常见因素【摘要】目的:探讨血清标本因素对酶联免疫吸附法(elisa)检测乙型肝炎表面抗原(hbsag)结果的影响。
方法:用同一批号试剂对不同状态的血清标本进行同步检测，并对结果进行综合比较分析。
结果:引起结果错误的主要原因是有溶血或浑浊的血清。
结论应针对血清标本的具体情况进行不同的处理。
【关键词】酶联免疫吸附试验；乙型肝炎表面抗原；抗凝剂
【中图分类号】r524【文献标识码】b【文章编号】
1005-0515(2011)04-0180-02
酶联免疫吸附法(elisa)检测hbsag因具有灵敏度高、特异性强等优点而被广泛应用，但在日常工作中检测hbsag常遇到假阳性率高、重复性不好的现象。
hbsag假阳性结果易给广大体检人员造成大的精神压力，易引起体检人员对检测人员的投诉，同时对检验机构易造成不良的声誉[1]。
针对这一现象，为了使检验结果更加准确、假阳性率更低，笔者采用同一种试剂对不同的血清标本进行重复测定分析，现报告如下。
1 资料与方法
1．1 血清标本采静脉血做乙肝两对半的血清标本均来自来我院进行单位职工年度体格检查。
1．2 试剂和仪器上海科华生物工程有限公司生产的乙肝hbsag 酶联免疫试剂盒，深圳雷杜酶标仪和洗板机。
1．3 分组和检测方法严格按照说明书进行操作，在操作过程中，小心吸取血清，避免人为造成影响[2]。
分3类情况进行观察。
a组：不抗凝血液标本：取96份不抗凝血液标本，每份分为三管，分别静置0．5、1、2 h后用3 000r／min离心l5 min，取出血清分别检测hbsag。
b组：加抗凝剂标本：采集50份静脉血标本，每份标本分别用不抗凝管、肝素钠抗凝管、edta一2ka管、枸橼酸钠管这4种管各装l管，其中不抗凝标本静置2 h后3 000 r／min离心15 min，另3管静置2 h析出血浆。
c组：含血细胞标本：从体检人员中抽出45例健康人血液标本(hbsag阴性者)。
取45份血清和血细胞每份血清1．2 ml，血细胞0．2ml。
把0．2 ml的血细胞加生理盐水，校正红细胞计数为1．0×1012l-1
然后按表1进行稀释制成含有不同血细胞的血清标本，然后对含有
不同浓度血细胞的标本进行hbsag的检测。
2 结果
2．1a组不抗凝标本hbsa9检测结果标本自凝0．5、1、2 h的hbsag阳性率分别为l0．42％(10／96)、3．12％(3／96)和0。
2．2b组加不同抗凝剂标本hbsa9检测结果依照不同血液处理方式，不抗凝血、edta一2k抗凝血、肝素钠抗凝血、枸橼酸钠抗凝血的hbsa9阳性率分别为0、0、8．0％(4／50)和0。
2．3c组合有不同浓度血细胞标本hbsag检测结果随着标本中含血细胞浓度的增高(0．0625×1012l～-10.125×
1012l～-10．250×1012l～-1)，检测hbsag阳性率也随之升高，依次为6．7％(3／45)、77．8％(35／45)和100％(45／45)。
3 讨论
血液中心和血站对供血者健康检查标准中hbv的筛查要求也是hbsag阴性[1]。
因此，hbsag检测的结果是否准确具有非常重要的意义。
血清是最常用的elisa标本，血浆中除含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成分等同于血清，除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本[3]。
用elisa一步法检测乙肝两对半，简化了操作步骤，缩短了检验时间；同时，应用高亲和力的单克隆抗体或，高纯度抗原，检测的敏感性和特异性都有显著提高。
但实验原理、实验步骤及工作人员等因素也会影响elisa的检测结果[3]。
3．1 不抗凝血液标本本研究结果显示，在血液自凝时间为0．5 h和1 h时就强行分离血清检测hbsag的假阳性率分别为l0．42％和3．12％。
而在体检人员健康检查工作中，有时为了争取时问快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行分离血清进行检测，易造成假阳性结果。
这就可以解释，若在次日复查同一标本时，因血液已经完全凝固，血清中没有纤维蛋白原的存在，故复查结果可以变为阴性。
血清分离不彻底的原因主要有以下几个：①血清中残留部分纤维蛋白原，易黏附于反应孔壁，或在孔中发生凝集，这两种情况都可以将酶结合物吸附于孔中，而使洗涤无法洗干净，从而造成
假阳性结果。
②纤维蛋白原的物理阻隔和反应微环境的改变，使检验灵敏度降低，易造成假阴性的结果[3]。
3．2 加抗凝剂标本本研究结果显示，肝素钠抗凝的标本出现假阳性，阳性率为8．0％，其余均为阴性。
原因可能是抗凝剂在抗凝的同时合成结合物，抑制或促进elisa系统中辣根过氧化物酶异常显色，导致结果不一。
3．3 含血细胞标本elisa方法测hbsa9的检验过程中，很多情况下的血清为带血细胞标本，红细胞的亚铁血红素具有过氧化物酶的活性，如果反应孔因非特异性吸附红细胞，加入底物后产生显色反应，就会造成假阳性结果[4]。
本研究结果显示，随着血细胞浓度的提高,假阳性的比例也呈上升趋势，当血细胞的浓度达到时0．25×1012l～-1。
时，hbsag假阳性率达到l00％。
3．4 解决方法临床上个别标本由于上述因素而影响结果，造成假阳性的产生。
本文对常见的影响因素做了以上的实验探讨，另外也查阅文献资料，对提高elisa检hbsag的准确性做出以下几条建议：①当天气寒冷时，采集的血液标本应置于孵箱孵育足够的时间；临时采集的标本不应进行强制分离。
建议工作人员采集的血液标本应置于37％孵箱孵育1．5～2 h。
②要避免标本出现严重溶血，血红蛋白中含有血红素，有类似于过氧化物酶活性[5]，因此在以hrp 为酶标记的elisa测定中，如血清中的血红蛋白浓度过高则很容易在温育过程中，吸附于elisa包被板，从而与后面加入的hrp底物
反应显色，因此要克服上述干扰，采集血标本时应尽量避免溶血。
③血清不能用肝素纳抗凝，因为肝素纳在elisa测定过程中抑制酶活性，属于酶抑制剂。
参考文献
[1]zaaijer h l，vrielink i-1，koot m．eady detection of hepatitis b surface antigen and detection of hbsag mutants：
a company son of five assays[j]．vox san9，2006，81(4)：219-221
[2] 高菊华，高海英．不同温育时间的酶联免疫法对hbsa9结果的影响[j]．中国卫生检验杂志，2008，10(5)：606
[3] 许斌，朱虎定．elisa检测hbsa9影响因素的探讨[j]．i
临床检验杂志，2006，18(4)：232
[4] 龙宪和，童华诚．溶血对乙型肝炎五项血清标志物检测结果的影响[j]．中华医学检验杂志，2007，19(1)：47-48
[5] 靳敏．溶血对临床生化检验影响的探讨[j]．广西医学，2007，24(9)：1363-1364
[6] 郑怀充，韩松．临床检验．elisa指南[m]．北京：北京医科大学、北京协和医科大学联合出版社，2005：40
作者单位：517100 连平县人民医院
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以pdf格式阅读原文。