浅析影响ELISA实验结果因素
影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法
第10页/共18页
问题4：质控品灵敏度偏高 。
处理意见：卫生部临检中心的质控品存在 批间批内差异。 实验室相关条件改变导致质控变化，
看阳性对照品是否有明显变化。
第11页/共18页
问题5：多次实验灵敏度一直偏低。 处理意见：A保存环境不规范。
B孵箱温度不足。 C温育时间不足。
(3)孵育过程中出现的问题
1.温箱孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释 液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底； 2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合，难 以清洗彻底。 3.孵育时温度不符合说明书的规定范围。
第2页/共18页
(4)洗板过程中易出现的几点情况
1.采用手工洗板,孔与孔之间液体容易交叉，切 不可随意洗板。
第14页/共18页
处理意见：D假阳性标本表现在临界值附近较 多，通常与当时实验的水平有关， 注意检查实验条件的波动 。 E避免加样时间过长 。 F由于试剂盒灵敏度过高而造成
临 床假阳性偏高的结果。
第15页/共18页
问题8：多次实验重复性差。 处理意见：A加样后充分混均。
B尽可能使用同一加样器，装紧 枪头。
第17页/共18页
感谢您的观看！
第18页/共18页
第12页/共18页
问题6：单次实验中出现假阳性 处理意见：注意实验过程中的影响因素，特
别是实验中的洗板应设置浸泡 30---60秒时间。
第13页/共18页
问题7：临床实验中出现假阳性偏高。
处理意见：A注意检查洗涤液中结晶部份是否 完全溶解。
B注意检查实验中所使用的仪器设 备是否定期校准 。
C注意检查实验中所用的板、酶标 试剂的批号是否相同，不同批号 试剂不得混用。
浅析ELISA测定错误结果的影响因素
浅析ELISA测定错误结果的影响因素ELISA即酶联吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。
Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为"enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)"。
ELISA的基本原理是：①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。
引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。
本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。
血清是最常用的ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种。
1、内源性物质有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。
常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig ( s )抗体、交叉反应物质和其它物质等。
（1）类风湿因子人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕捉抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。
影响ELISA实验因素阐述
影响ELISA试验因素叙述酶联免疫吸附试验（Enzyme—Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到快速的发展和广泛应用。
尽管早期的ELISA由于特异性不足高而阻碍了其在实际中应用的步调，但随着方法的不绝改进、料子的不绝更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便应用和标准化，从而使其成为广泛应用的检测方法之一、基本原理：ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会转变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。
此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。
滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，显现颜色反应。
因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。
此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
一、试剂的影响因素：应选用有国家批准文号，质量靠得住的产品，不能图便宜，忽视质量保证。
试剂应妥当保管于4℃冰箱内，在使用时先平衡至室温，不同批号的试剂组分不宜交叉使用。
试剂开启后要在一周内用完，剩余的试剂下次用时应先检查是否变质，显色剂如被污染变色将造成全部显色，导致错误结果。
过期的试剂不宜再用，若别无选择，应做好双份质控品的监测，确保结果的可靠性。
二、影响因素：酶联免疫（ELISA）是目前检验科常用的免疫学检测方法之一，其操作简单，无须特殊设备，使其在各级医院都有应用。
但是，假如忽视了影响其结果的因素，难免会造成假阴性或假阳性，因此，了解影响试验的因素，减少过错事故的发生是极其必需的。
ELISA检测的影响因素的分析
ELISA检测的影响因素的分析【关键词】 ELISA检测；影响因素；分析ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。
Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为“enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)”。
由于ELISA方法灵敏，特异性强不需要特殊设备，所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定［1］。
如乙肝、丙肝抗体等等。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。
本文就ELISA检测的影响因素做如下讨论。
1 标本的影响1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性［2］。
所以严重溶血标本禁用。
1.2 标本受细菌污染因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
1.3 标本保存不当在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。
1.4 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性最好使用真空采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。
1.5 标本凝固不全在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。
Elisa影响因素及措施整理
一、①一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30~60 min，各试剂在使用前充分混匀。
②酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。
二、操作不当导致1、加样多、操作持续时间长，尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异；2、除包被外，都宜采取45°加样，且要避免加到侧壁上；3、加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会对结果造成较大影响。
4、孵育时间过长，会导致非特异性反应增强；5、显色和终止加液时应避免气泡产生，以免影响检测读数；6、酶标板不宜叠放以减少受热不均，可采取水浴；7、贴密封膜，防止污物浸入和液体蒸发。
8、Elisa实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸馏水都可导致空白值或背景值升高。
三、检测样品处理不当引起溶血或污染1、血清或血浆标本分离不好或发生溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；2、待检标本污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；3、在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；4、标本凝固不完全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，18～24h完全凝固。
如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。
为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。
5、标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。
此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可，产生泡沫或样品的过度混合将引起血清蛋白的变性。
浅谈ELISA的影响因素
浅谈ELISA的影响因素ELISA即酶联免疫吸附试验,ELISA是一种敏感性高、重复性好的固相酶联免疫测定广泛用于各种抗原抗体的检测,但影响因素较多,有时易出现假阳性或假阴性,本文重点针对内源性、外源性因素对ELISA测定结果的影响进行探讨。
标签：酶联免疫吸附试验(ELISA);测定结果;影响因素如今病毒性疾病的诊断主要依赖对其抗原、抗体的检测。
而检测方法大多采用酶联免疫吸附试验(ELISA),如何保证实验结果的准确性,现结合自己的实际工作经验,总结了下列影响因素,希望对检验工作者有所帮助。
1内源性干扰因素1.1类风湿因子(RF)在类风湿患者、其他自身免疫性疾病及正常人的血清中,常含有较高或不同浓度的RF,RF一般为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。
用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可以充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。
1.2补体补体易激活C1q起到铰链作用,结果易出现假阳性。
1.3嗜异性抗体人类血清中含有天然的嗜异性抗体,将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,造成假阳性。
1.4自身抗体由于B细胞的超反应性,患者血清中常出现一些自身抗体,能与靶抗原结合形成复合物。
1.5溶菌酶可致假阳性。
2外源性干扰因素2.1标本溶血,分离不完全、加有血球。
2.2标本被细菌污染。
2.3标本储存时间过长。
2.4标本凝固不全。
2.5冰冻保存标本反复冻融。
2.6试剂在室温下平衡<30分钟,配洗液的水不符合要求。
2.7加样速度过快,加样时加在孔壁上或产生气泡。
2.8温育时关键因素之一,尽量选择温度低的,温育时间长的试剂盒。
2.9洗涤要彻底。
2.10双波长比色可减少容器上的划痕和指印等造成的光干扰。
2.11试剂质量的影响。
选用高质量的试剂是保证结果准确的关键因素之一。
3高值鉤状效应(HOOK效应)在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时出现钩状效应。
过量抗原分别和固相抗体和酶标抗体结合,而不再形成“夹心复合物”类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常规法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应,因为标准曲线到达高峰后钩状弯落。
影响ELISA试验结果操作的因素总结
影响ELISA试验结果操作的因素总结操作的影响因素酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一种特别的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上进展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果推断较为客观，是目前试验室检测抗原抗体*经济、*普遍的试验诊断方法。
影响ELISA试验结果操作的因素总结如下：1 、试剂的预备试剂的质量如抗原抗体的纯度及亲和力、标记物的比活性、滴度及特异性等直接影响检测结果，为保证检测质量，全部试剂必需经国家食品药品监督管理总局注册批准、批检测合格，临床评估特异性、敏感性、稳定性较高且在有效期内才有使用价值。
不同厂家试剂敏感性、特异性不尽相同，有报道不同厂家酶标板孔间 A 值差大小可达 15%，标记酶的活性及显色液的稳定性也相差较大，所以合理有效的试剂选择尤为重要，对 ELISA 试剂盒应正确选择，定期评价并建立科学的接收标准，结合常规血液筛查状况，对实际的均一性、适用性、稳定性，选出灵敏度、特异度及精密性合适的试剂保证检测结果的精确。
有报道不同厂家-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶结合物溶液对检测结果有区分，配制抗 HCV-cAg 酶结合物溶液前应检测小鼠-IgG 与产品的适配性。
其次试剂盒的储存方式、运输条件及有效期均为影响检测结果的重要因素，试剂盒一般2~8℃冰箱保存，留意不要紧贴冰箱储存室后壁以防止试剂冻结失效，可避开使用时试剂受温差影响导致酶标板上凝集小水珠及反应消失温差而影响抗原抗体的反应。
使用前需将试剂盒放置37℃恒温箱温育30min，且不同厂家、不同批号的试剂不能混合使用。
剩余试剂应准时放入干燥剂密封保存在2~8℃冰箱，试剂打开后一周内有效，同时留意做好室内质检，确保试验结果的牢靠性。
不同方法学的检验试剂会使乙肝两对半结果消失不同，如临床操作中电化学检测 HBsAg 呈阳性，而采纳 ELISA 检测则呈阴性，此外，使用单抗或多抗试剂对检测结果同样造成肯定的影响。
酶联免疫吸附试验的影响因素
酶联免疫吸附试验的影响因素酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
它的原理是通过特异性抗体与抗原结合，再利用酶标记的二抗介导的颜色反应，来定量分析和检测目标物质。
在进行ELISA实验时，有多个因素会对实验结果产生影响，下面将详细介绍其中的几个主要影响因素。
1.试剂的质量ELISA实验的试剂质量对实验结果至关重要。
这包括酶标记抗体和底物酶的纯度、活性，抗原或抗体的纯度和浓度，以及稀释缓冲液的组成和pH值等。
选择高质量的试剂可以提高实验结果的准确性和重复性。
2.样本处理和储存条件样本的处理和储存条件也会对ELISA结果产生影响。
样本的收集、保存和处理方法需要标准化，以确保稳定性和一致性。
如血液或组织样本的离心速度、温度和时间等要控制一致。
另外，样本的冻结和解冻过程也需要避免反复，以防止损坏细胞结构和影响实验结果。
3.特异性抗体的选择ELISA实验需要选择特异性抗体与目标抗原结合。
抗体的选择要考虑其亲和力、特异性和纯度等特性。
如果抗体不够特异性，可能会导致非特异性结合和假阳性结果。
因此，在实验中选择合适的抗体对实验结果至关重要。
4.孵育条件和时间孵育条件和时间对ELISA实验结果也起着重要影响。
这包括孵育温度、时间和摇床的震荡速度等。
不同的试剂和实验需要不同的孵育条件。
孵育温度过高或过低，孵育时间太长或太短，都可能导致结果的偏差。
5.光度计的精度和校准ELISA测量实验结果时需要使用光度计，光度计的精度和校准对结果的准确性和可重复性至关重要。
定期检查和校准光度计以确保其准确性，并遵循使用指南来保持恒定的测量条件。
6.数据分析和计算ELISA实验得到的数据需要进行合理的分析和计算。
如对标准曲线进行拟合和计算待测样品的浓度等。
合理的统计分析和数据处理能够提高实验结果的可靠性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
保 证 反应 温 度
５ 试 剂
Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ是实 验 室检 测 抗 体最 常 用
的检测方 法 ，具有 灵敏性 高 、特 异性 强 等特点 ，不 需要 特殊仪 器设 备就 可
Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 成 品 试 剂 盒 为 检 测 工 作 提
供 了方便 ，按 照说 明书进行 操作 就 可 以完 成实验 ，但 人为操 作 时候很 多 细 节也会导致实 验误差 。
３ ． １ 包被
冬 季由于室外温度较低 ．冻土层较厚 ，采 用焚烧法对动
物尸体进行无害化处理 。每次处理要进行严格 消毒 。
可 以是 血清 、全血 、唾 液 、尿 液 等 ， 但 大部 分还 是 以血清为 样 品。作 为血
检 测 的 品很多 ，根据 检测 项 目不 同
人 工洗 板 时 ，弃 去洗 涤 液时 方法
一 辽宁省 葫芦岛 市动 物疫病 预防控 制中 心
清 样 品 ，应 避 免 溶 血 ，溶 血 可 能 会 增
春 、夏 、秋 季采 用深埋 法 。根据 Ｇ Ｂ １ ６ ５ ４ ８ — ２ ０ ０ ６《 病 害
动物和病害动物产 品生物 安全处理规程》要求 ，深埋法无 害
化动物尸体应满 足以下条 件 ：远离学校 、公共 场所 、居 民住
点 ，按照每 次处理动物尸体 的多少确 定掩埋坑的大小 ，并严 格按照要求进行规范操作 ，确保处理效果达到疫病防控要求 。
头等。
４ 设 备
应 中最重要 的条件 。温度控 制 主要 在 试 剂盒 使用 前一 定要提 前半 小 时左 右
取 出 ，恢 复 至 工 作 温 度 ．恒 温 箱 要 提
仪器设备是 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ实 验 的 基 础 ， 常用 的相关 仪器设 备包 括移 液器 、酶 标仪 、洗板 机和 恒温箱 等 。所有 设 备 都 需要 进行 检验校 准 ，保证 准确 性 和
存 。样 品如 被细 菌污染 腐败 ．可能会
导 致 假 阳性 。
２ 温 度和 时 间
改变 ，影 响酶标仪 测量 结果 ；加 样 时
未注 意移液 器吸头 堵塞 或漏 气导 致加
抗原 和抗体 反 应需 要适 宜 的温度
和 反 应 时 间 ．温 度 和 时 间是 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 反
液量不 准确 ：加不 同试 剂时 未更 换 吸
剂 盒 ，看 似简 单 的操 作 。其 中存在 着
复 杂 的 反 应 ，很 多 因 素 都 会 影 响
Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 的 实 验 结 果 。 下 面 就 对 影 响
些 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ反 应 板 需 要 自行 进 行
包被处 理 ，没有 进行包 被 ，或包 被液
使用与检测项 目不同都会使实 验失败 。
前打 开 ，设 定 到反应 温度 ，以保 证 反 应速 度 。在 温度 保证 的前 提下 ，时 问
的控制 至关 重要 ，尤其 是底 物 显色 的
时 间控制 ，显 色时 间不 足或 过 长会 导 致实 验不成 立 ．无法对 检测 结果 进 行 判断
３ 人 员操 作
精确度 。移 液器 的使用 要尽 可 能选择
加非 特异性显色 ，导 致结果 出现误 差 。
０ ０ ０ 一
不 当 ，易使各 孔液 体相互 流 人 ，导致 假 阳性 ；洗涤 液使 用量 和洗 涤次数 过
少 导 致 洗 涤 不 彻 底 ．洗 板 后 未 拍 板 或
血 清样 品 的反复 冻融会 使血 清 中的抗 体 效价 下降 ，所 以需要 多次 检测 的血
５ ． ２ 焚烧 法
宅 区 、村庄 、动 物饲 养和屠宰场所 、饮用 水源地 、河流 等地 区；掩埋前应对需掩埋 的病害动物尸体和病 害动物产 品实施
焚烧处理 ；掩埋坑底铺 ２ ｃ ｍ厚生石灰 ；掩埋后需将掩埋土夯 实 ，病害动物尸 体和病害动物产 品上 层应距地表 １ ． ５ ｍ以上 ：
１ 样 品
液全部覆盖会导致检测结 果偏差 。
３ ． ２ 反 应 液 稀 释
样 品是 检测 的前 提 ，样 品质 量会 直 接影 响实 验结果 。可 以用 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ来
稀 释 液使用 错误 或稀 释 比例 不正 确会导致实验失败或结果不准确。
３ ． ３ 洗 板
浅析影响 ｍ Ｌ Ｉ ： ５ ； 实验结果因素
一
以完成检 测工 作 。 目前 大部分 实验 室
检 测都使 用厂 家生 产的成 品 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ试
试 剂 盒要 根据要 求进 行 保存 ，并
保证 在有效 期 内使 用 ，使用 前应 平衡 到室温 。新购 人的试 剂盒要进行 校验 ，
检 查 实 验 是 否 成 立 ，不 同 的 试 剂 盒 或 不 同批 号 的试 剂 不 可 混 用
包被 时 ，未 进行 震荡 ，孔底 未被 包被
Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ实验结果的因素进行 总结 。
５ 无 害 化处 理
５ ． １ 深 埋 法
焚烧后 的病 害动物尸体和病 害动物产品表 面以及掩 埋后 的地
表环境应使用有效消毒药 喷 、洒消毒 。按 照上 述要求 ，实施 深 埋法 进行 无害化 处理 的养 殖 场先后 确定 无 害化 处理 掩埋
清样 品 ．如 在 ５ ｄ内检 测完 ，可 ４ 保 存 ，如需长 时 间检测 ，可进 行分 装冻 朱 晓 明
拍不ｆ净都会影响实验结果。
３ ． ４ 其 他
封 板 膜封 闭不严 或开 启 时孔 内液 体 蒸 发 、震 出可 导致 各 孔相 互 污 染 ；
操作 时接触 到 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ板底 导致透 光度