产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离
枯草芽孢杆菌的发现和应用研究进展
枯草芽孢杆菌的发现和应用研究进展枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性细菌，具有许多生物学特性，因此在科学研究和工业应用中备受关注。
以下将针对枯草芽孢杆菌的发现和应用进行综述。
首先，简要介绍枯草芽孢杆菌的发现。
枯草芽孢杆菌最早是由德国科学家C. Cohn于1872年从稻草中分离和鉴定出来。
随后，人们对其生物学特性和基因组结构进行了大量研究，发现它具有较小的基因组大小、高变异性以及丰富的代谢途径，这些特性为其广泛应用奠定了基础。
其次，探讨枯草芽孢杆菌的应用研究进展。
枯草芽孢杆菌在农业、医学、食品工业等领域都有广泛的应用价值。
在农业领域，枯草芽孢杆菌被广泛应用于植物生长调节、抗病虫害和土壤改良等方面。
它能够分解植物残渣，提高土壤有机质含量和养分供给，并产生一系列生物活性物质，如植物生长素和抗生素，从而促进植物的生长发育和抵抗病虫害。
此外，枯草芽孢杆菌还可以抑制一些植物病原真菌和细菌的生长，起到生物防治的作用。
在医学领域，枯草芽孢杆菌具有一定抗菌、抗肿瘤和免疫调节的功能。
研究表明，枯草芽孢杆菌能够产生抗菌物质，对一些常见病原菌具有较强的抑制作用，包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。
另外，枯草芽孢杆菌菌株还能够产生一些抗肿瘤物质，如秋水仙素，对于某些肿瘤细胞具有抑制作用。
此外，枯草芽孢杆菌还能够刺激人体免疫系统，增加免疫细胞的活性，并促进巨噬细胞的活化。
在食品工业中，枯草芽孢杆菌具有辅助酿造、发酵和防止食品腐败等功能。
枯草芽孢杆菌可以产生多种酶，如淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶等，可用于酿造业的辅助加工，提高酿酒的产率和质量。
此外，枯草芽孢杆菌还能够发酵产生乳酸、醋酸等有益物质，用于食品添加剂和调味品的生产。
同时，枯草芽孢杆菌也可以抑制一些食品腐败菌的生长，延长食品的保质期。
除了上述应用领域外，枯草芽孢杆菌还在环境治理、生物能源等方面有一定的研究和应用价值。
例如，枯草芽孢杆菌可以降解废弃物中的有机物，减少环境污染；它还能够利用废弃物中的纤维素和淀粉等生物质资源，生产生物能源，如乙醇和氢气等。
高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢杆菌的选育及酶基因阳性克隆的筛选的开题报告
高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢杆菌的选育及酶基因阳性克隆的筛选的开题报告一、研究背景其中淀粉分解酶和蛋白酶作为生物体内两种最主要的催化能力已经广泛应用于食品、工业、生物医学等多个领域。
目前，大多数市场上的淀粉分解酶和蛋白酶仍来自于传统的菌种发酵或者经过化学合成生产，这种生产方式存在成本高、污染大、产量低等缺点。
为了解决这些问题，近年来人们开始利用生物技术研究新型酶制品，以提高酶的生产效率和环境友好型。
二、研究目的本研究旨在筛选一株高淀粉酶和蛋白酶活力的枯草芽孢杆菌，并通过PCR技术开展酶基因阳性克隆的筛选，为高效生产淀粉酶和蛋白酶的工业应用提供理论和实际参考。
三、研究内容1. 选育高淀粉酶和蛋白酶活力的枯草芽孢杆菌2. 筛选酶基因阳性克隆3. 测定酶活力及酶的生产量四、研究方法1. 枯草芽孢杆菌的分离和筛选：通过样品的培养和筛选、形态学和存活力的初步鉴定，将具有优良代谢特性表现的菌株选出。
2. 克隆酶基因：利用DNA提取和PCR技术进行酶基因的扩增，获得酶基因的亚克隆，并进行酶基因阳性克隆的筛选。
3. 测定酶活力及酶的生产量：将选育出的枯草芽孢杆菌进行发酵培养，测定其淀粉酶和蛋白酶的活力和生产量。
五、研究意义本研究能够选育出一株高活性的淀粉酶和蛋白酶生产菌株，为高效、环保、经济地生产淀粉酶和蛋白酶的工业化应用提供理论和实际参考。
同时，对于推动生物制药产业、食品工业的升级和发展具有重要的推动作用。
六、研究计划1. 选育高淀粉酶和蛋白酶活力的枯草芽孢杆菌（2个月）2. 筛选酶基因阳性克隆（3个月）3. 测定酶活力及酶的生产量（2个月）4. 数据统计和分析（1个月）五、参考文献1. 郑凌峰, 林天. 枯草芽孢杆菌的生物学特性及酶应用[J]. 南方农业学报, 2014, 45(4):410-417.2. Che J, Roy I. Bio-based production of enzymes and enzymes used in bio-based production[J]. Biotechnology Advances, 2010, 28(6):791-804.。
枯草芽孢杆菌及其分离培养方法
1. 枯草芽孢杆菌及其分离培养方法1.1 枯草芽孢杆菌简介枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阳性细菌。
它是一种常见的土壤菌，同时也存在于水体、空气和植物表面等生物体的附属物中。
枯草芽孢杆菌具有良好的产生芽孢和分泌代谢产物的能力，因此在农业、医药和食品工业等领域有着广泛的应用前景。
1.2 枯草芽孢杆菌的分离培养方法枯草芽孢杆菌的分离培养是研究其生理特性和应用价值的基础工作之一。
下面将介绍常用的枯草芽孢杆菌分离培养方法。
1.2.1 选择性培养基为了选择枯草芽孢杆菌并抑制其他微生物的生长，常采用含有适当抑菌剂的选择性培养基。
例如，常用的选择性培养基有Mannitol-Egg Yolk-Polymyxin（MYP）和Bacillus Cereus Agar（BCA）等。
1.2.2 样品采集从土壤、水体或其他可能存在枯草芽孢杆菌的环境中采集样品。
样品的选择要考虑到可能存在的生物体和环境因素对细菌分布的影响。
1.2.3 样品处理将采集到的样品进行处理，常见的处理方法包括稀释、过滤、震荡等。
通过处理可以去除一部分不相关的微生物，并将枯草芽孢杆菌分散在培养基中。
1.2.4 培养基接种将处理后的样品接种在选择性培养基上，用无菌的铁环或吸管进行操作。
将接种好的培养基置于适宜的温度和湿度条件下进行培养。
1.2.5 培养条件调控根据枯草芽孢杆菌的生长特性，可以调控培养条件来促进其生长和芽孢形成。
例如，增加培养基中的营养物质浓度、调节培养温度和pH值等。
1.2.6 分离纯培养经过一段时间的培养后，可以观察到菌落的形成。
根据形态学特征，选择单个菌落划线分离，并进行纯培养。
通过多次传代培养，可以得到纯种的枯草芽孢杆菌菌株。
2. 枯草芽孢杆菌的应用价值2.1 农业领域枯草芽孢杆菌具有多种促进植物生长的特性，可以增强植物的抗逆性和抗病能力，提高作物产量和品质。
此外，枯草芽孢杆菌还可以降解农药和有机污染物，对环境具有修复作用。
枯草芽孢杆菌的培养、筛选分离和鉴别
03
枯草芽孢杆菌的筛选分离
枯草芽孢杆菌的分离纯化
制样品稀释液
取得土壤样g，放入盛 1 有99ml的无菌水锥形
瓶中，充分振荡。
培养
用移液枪将各个浓度梯度的一 3 定量稀释液接种到开始时制作 好的培养基上，用无菌刮铲涂 匀。37℃下倒置培养24小时。
加热筛选能形成芽孢的 细菌
在超净工作台中，将装有锥形瓶 2 的菌悬液加塞、包扎、摇匀后放
3
高压灭菌：将分装包扎的培养基放入 高压蒸汽灭菌锅中进行高压蒸汽霉菌， 用0.075MPa灭菌30分钟。（使用高 压蒸汽灭菌锅要注意放完冷气。灭菌 结束后等到气压降到“0”时才能打 开放气阀。）
培养基 制备
2
精确称取蔗糖30g、磷酸二氢钾4.5g、 硫酸铵2.5g、蛋白胨10g、碳酸钙 2g、酵母膏5g和琼脂20g，然后在 1000ml水中充分溶解。
道中的游离氧，造成肠道
2
低氧，促进有益厌氧菌生
长，间接抑制其它致病菌
生长。
4.
枯草芽孢杆菌菌体自身合成α -
4
淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤
维素酶等酶类，在消化道中与
动物体(人体)内的消化酶类一
同发挥作用。
3.
3
刺激动物(人体)免疫器官
的生长发育，激活T、B
淋巴细胞，提高免疫球
蛋白和抗体水平，增强
细胞免疫和体液免疫功
能，提高群体免疫力。
生物科学 进入人体，能100%到达大小肠，抑
制致病菌，促进有益厌氧菌生长，并产生 乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑 制其它致病菌生长。提高免疫球蛋白和抗 体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能， 提高群体免疫力。合成α -淀粉酶、蛋白酶、 脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与 动物体(人体)内的消化酶类一同发挥作用。
1株边鸡源产蛋白酶枯草芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性研究
1株边鸡源产蛋白酶枯草芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性研
究
孙丽萍;胡馨元;钮慧晶;王琴;裴彩霞;李毅;夏呈强
【期刊名称】《现代畜牧科技》
【年(卷),期】2024()2
【摘要】该试验旨在筛选具有高产蛋白酶能力的益生芽孢杆菌,扩大微生态制剂候选菌株资源。
以边鸡直肠内容物为分离来源,经脱脂奶粉平板初筛获得16株产蛋白酶菌株,液体发酵复筛后,选取1株蛋白酶活力高达119.7 U/mL的芽孢杆菌FRE76进行后续研究。
通过16S rRNA基因测序与进化树分析,并结合形态学与生理生化鉴定,判定该菌株为枯草芽孢杆菌。
病原菌抑制试验表明,该菌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用。
耐酸和耐胆盐检测发现,在pH值3.0和4.0时该菌株存活率均为50%以上,在胆盐浓度为0.1%和0.3%时菌株存活率均能达到60%以上。
该试验筛选获得的枯草芽孢杆菌FRE76,具有优良的蛋白酶生产性能、较好的致病菌抑制能力和较强的抗逆性,是一株潜在的益生菌菌株。
【总页数】6页(P33-38)
【作者】孙丽萍;胡馨元;钮慧晶;王琴;裴彩霞;李毅;夏呈强
【作者单位】山西农业大学动物科学学院;山西农业大学生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】S831.5
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5.藏羊源枯草芽孢杆菌的分离鉴定与生物学特性
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枯草芽孢杆菌实验报告
微生物技术综合实验年级：13级生物工程（专升本）班级：学号：姓名：徐红贞指导老师：刘凤霞教授日期：二零一三十月五号目录1实验目的及原理 (1)1.1实验目的 (1)1.2实验原理 (1)2实验材料 (1)2.1实验仪器 (1)2.2实验试剂 (1)2.3培养基 (2)2.3.1 生长培养基 (2)2.3.2鉴定培养基 (2)2.3.3摇瓶培养基 (2)3试验方法 (2)3.1仪器的准备 (2)3.2培养基的配置 (2)3.3初步筛选及鉴定 (2)3.3.1采集土样 (3)3.3.2富集培养 (3)3.3.3稀释分离、纯化 (3)3.3.4初筛 (3)3.4复筛及鉴定 (4)3.4.1革兰染色 (4)3.5酶活力的测定 (4)3.5.1摇瓶培养 (4)3.5.2酶液稀释 (4)3.5.3酶液测定 (4)4结果分析 (5)4.1平板涂布分离 (5)4.2平板划线分离 (5)4.3初筛 (5)4.4复筛 (5)4.5摇瓶培养 (6)4.6酶活力测定 (6)5参考资料 (7)6附录 (8)微生物上游技术综合实验枯草芽孢杆菌的分离、纯化、筛选及鉴定1.实验目的及原理1.1实验目的（1）学习从土壤中分离、纯化枯草芽孢杆菌的原理和方法。
（2）学习掌握枯草芽孢杆菌的鉴定方法。
（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力的测定的原理和方法。
（4）培养学生综合应用微生物实验方法的能力。
（5）培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
1.2实验原理选择合适与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
将土壤稀释液倒在不同类型的培养基平板上，在适宜的环境中培养几天，细菌或是其他的微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。
将初次筛选得到的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶的细菌才能够利用培养基中的淀粉成分来完成自身的生命活动，才能够生存。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件(
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，具有重要的应用价值，被广泛应用于农业生产中的抗病、增产、改善土壤等方面。
因此，对枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法进行研究具有重要意义。
以下将介绍枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法。
一、枯草芽孢杆菌分离方法：1. 样品采集：根据研究需要，选择合适的样品，如土壤、植物组织、水等。
采集样品时要注意避免外源性污染，尽量避免使用过多的抗生素。
2. 样品处理：将采集到的样品进行处理，如土壤样品需要经过悬浮液稀释法进行样品制备，植物组织需要进行消毒处理等。
3. 分离培养基选择：根据枯草芽孢杆菌的生长特性，选择合适的分离培养基。
通常可以选用液体培养基（如TSA、LB培养基）或固体培养基（如TSA、PDA培养基）。
固体培养基还可以添加适当的抑菌剂来抑制其他细菌的生长。
4. 分离培养：将样品制备好后，均匀涂布在选择的培养基上，然后进行培养。
液体培养基需要在适当的温度和速度下进行摇床培养，固体培养基需要静置培养。
培养时间一般为24-48小时。
5. 子培养：在培养基上出现孤立的菌落后，用离心管吸取菌落，再划线接种到新的培养基上，进行连续传代培养。
一般选择形态特征明显、菌落形状规则的菌落进行子培养。
6. 纯化：通过连续传代培养，最终获得纯种的枯草芽孢杆菌。
纯化的细菌可以通过形态观察、生理生化特性检测等方法进行初步鉴定。
二、枯草芽孢杆菌鉴定方法：1. 形态观察：观察菌落形态、色素、菌体形态等。
枯草芽孢杆菌的菌落通常呈乳白色或灰白色，形状为圆形或不规则形。
2. 胞内酶活性检测：通过检测枯草芽孢杆菌的胞内酶活性来鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。
常用方法为利用不同培养基的酶基质进行相关酶活性检测。
3. 生理生化特性检测：包括对枯草芽孢杆菌的耐温、耐酸碱性、氧化还原反应等生理生化特性的检测。
4. 分子生物学鉴定方法：利用分子生物学方法，如PCR、16S rRNA基因测序等来鉴定枯草芽孢杆菌。
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实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。
由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。
利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。
葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。
三、实验材料1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。
（学生自取）2. 培养基①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。
组成：牛肉膏0.5% 蛋白胨1% NaCl 0.5% pH 7.2～7.4 121℃，灭菌20min②酪素培养基（附录Ⅱ-1.10）：200 mL/500 mL△×1（10-12个平板，每组6个平板）* 酪素的母液浓度为4%，是将4g干酪素溶解于0.1N的30-35ml的NaOH水溶液中，水浴溶解20min，待溶解完全后加入60-70℃热水稀释到所需浓度（即定容到100 mL），即得到母液浓度围4%的酪素溶液。
各组分的母液由老师配制好，学生按照200ml的体积直接取样加入即可。
pH 6.5～7.0，121℃，灭菌20min，倒好平板后进行无菌检查。
③生理盐水：0.85% NaCl水溶液，9 mL/支×10支④其他：平皿10套、温度计、水浴锅、移液管、显微镜、涂布器2个，三角瓶（250m L，500 m L规格）、革兰氏染色液等。
四、实验内容1.采样学生从地表下10～15cm的土壤中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等等。
2. 增殖培养（富集培养）一般来讲，样品所占欲分离微生物的数量较少，利用微生物所需营养的区别，在增殖培养基中使某些微生物的生长受到抑制，而对某些微生物可促进它们的生长，从而达到分离所需微生物的目地，这种培养称为增殖培养。
取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和中央各取一点土，混匀，称取1g，置于装有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，六层纱布封口，于80℃水浴加热处理10min，以杀死样品中的微生物营养体细胞。
然后30℃，150 r/min，振荡培养24h。
取样镜检形成芽孢的情况。
3. 涂布分离将增殖培养液置于80℃水浴中加热10min，再次杀死不形成芽孢的营养体细胞，以浓缩芽孢杆菌（第二次加热处理前，取1ml培养液经适当稀释后作革兰氏染色，观察是否有枯草芽孢杆菌存在，本实验中略去该步骤）。
然后取1 mL处理液以10倍稀释法分别稀释到10-4，10-5，10-6等。
分别取0.1mL菌液于无菌的酪素培养基平板上（初筛平板，每个稀释度平均两皿），用灭过菌的涂布棒将菌液均匀涂布在酪素平板上，倒置于30℃培养箱中培养24~48h。
观察酪素平板上菌落周围的透明圈，挑(H/C)比值大的菌接入斜面培养基，30℃培养24h，备用。
4. 纯化用平板划线分离法在酪素平板或牛肉膏蛋白胨平板上分离纯化挑选出的菌株。
5. 纯种鉴定菌种经革兰氏染色，油镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。
①细胞形态，菌落特征，芽孢形成情况。
②产蛋白酶能力的测定：直接观察在酪素平板上菌落周围所形成的透明圈。
6.菌种保藏该实验分离得到的枯草芽孢杆菌作为后续实验的菌种使用。
五、结果与讨论绘制菌体形态图，计算不同单菌落的H/C。
六、实验任务获得的H/C比值大、产蛋白酶活力高的枯草芽孢杆菌菌株。
七、教学重点及难点1．掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法2．掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法八、教学方法和手段详细讲解和板书，并结合实物进行讲解和示范，强调操作注意事项。
实验二微生物的诱变育种一、教学目标及基本要求：1. 理解诱变剂对微生物的杀菌和诱变双重生物学效应；2. 学习紫外线诱变的方法和测定诱变剂最适剂量的方法。
二、实验原理紫外线的生物学效应主要是它能引起DNA结构的变化而造成的。
紫外线具有杀菌和诱变双重生物学效应，随着紫外线照射时间的增加，杀菌率和突变率随之提高。
但当照射时间延长到某一程度时，继续延长照射时间，其杀菌率虽然增加，突变率却下降。
紫外线的强度单位(剂量)为尔格/mm2，由于测定困难，在实际诱变育种中，常用紫外线照射时间或细胞的死亡率表示相对剂量，其中以细胞死亡率表示具有实际意义。
本实验以枯草芽孢杆菌为出发菌株，以营养缺陷的突变作为诱变效应的指标，测定紫外线诱变剂的最适剂量。
以照射时间为横坐标，以细胞存活率或死亡率和突变率为纵坐标作图，突变率最高值相对应的照射时间即为最适剂量。
三、实验材料1. 菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)2. 培养基肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1），细菌基本培养基（附录Ⅱ-1.9）3. 其它生理盐水，诱变箱，磁力搅拌器，涂布棒，离心管，离心机，培养皿等。
四、方法与步骤1. 菌体的培养取斜面菌种1环，接种于盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)16~18h。
取1ml培养液转接于另一只盛有20ml肉汤培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养(120r/min)6~8h。
2. 细胞悬浮液的制备取10ml培养液，3500/min离心10min，收集菌体，沉淀用10ml 生理盐水洗涤离心2次，之后将菌体充分悬浮于12ml生理盐水中。
3. 活菌计数法测定细胞悬浮液的浓度取1ml细胞悬浮液，逐步稀释为10-1、10-2、10-3……。
取最后3个稀释度的菌液各1ml，置于无菌空平皿中，然后倾注15ml融化并冷却至45~50℃的肉汤固体培养基，轻轻充分混匀，凝固后于37℃倒置培养1~2天，计数每皿的菌落数（每个稀释度作三个平行）。
按下式计算每毫升细胞悬浮液菌体的浓度（N0）。
菌体浓度(个/ml) = 菌落数(按杂菌总数计数原则)×稀释倍数4. 诱变处理(1) 取10ml菌液于φ90mm的培养皿中（带有磁棒），将皿放置于诱变箱内的磁力搅拌器上。
(2) 开启紫外灯，预热20min，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射15、30、45、60、75、90s。
(3) 取不同时间诱变处理的菌液1ml，以肉汤固体培养基平板，按照上述菌落计数的方法进行适当稀释后，采用肉汤固体培养基倾注法测定处理液中存活的细胞浓度（每个照射剂量做三个稀释度，每一稀释度平行做三个平皿）。
将结果填入表1。
表1 紫外线对枯草芽孢杆菌存活率的影响五、结果与讨论实验选择诱变时间时，全班共同绘制一条致死曲线，每个组或几个组选择一个诱变处理时间，最后统一进行绘制。
六、实验任务绘制细胞存活率曲线，选择合适的诱变剂量。
七、教学重点及难点紫外线诱变的方法和测定诱变剂最适剂量的方法。
八、教学方法和手段详细讲解和板书，并结合实物进行讲解和示范，强调操作注意事项。
实验三营养缺陷型的筛选一、教学目标及基本要求：理解选育营养缺陷型突变株的选育原理，掌握营养缺陷型突变株的筛选方法。
二、实验原理营养缺陷型是野生型菌株由于基因突变，致使细胞合成途径出现某些缺陷，丧失合成某些物质的能力，必须在基本培养基中外源补加该营养物质，才能正常生长的一类突变株。
其本质是一种减低或消除末端产物浓度，以解除反馈控制的代谢调控方式，使代谢途径中间产物或分支合成途径中末端产物得以积累。
营养缺陷型菌株广泛应用于氨基酸，核苷酸，维生素的生产中，也广泛应用于基因定位，杂交及基因重组等研究中的遗传标记制作。
三、实验材料1. 菌种枯草杆菌（B.subtilis）。
2. 培养基(1) 细菌完全培养基（CM）葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，蛋白胨1%，MgSO4·7H2O0.2%，琼脂2%，PH7.2。
(2) 细菌基本培养基（MM）葡萄糖0.5%，MgSO4·7H2O0.2%，柠檬酸钠0.1%，(NH4)2SO40.2%,K2HPO40.4%,琼脂2%(处理琼脂)。
配制基本培养基的药品均用分析纯；使用的器皿要洗净，用蒸馏水冲洗2~3次，必要时用重蒸馏水冲洗。
(3) 无氮基本培养基在基本培养基中不加(NH4)2SO4和琼脂。
(4) 二倍氮源基本培养基在基本培养基中加入2倍(NH4)2SO4，不加琼脂。
(5) 限制培养基（SM）向配好的液体基本培养基中加入0.1~0.5%的完全培养基，加入2%琼脂。
3. 溶液(1) 无维生素的酪素水解物或氨基酸混合液。
(2) 水溶性维生素混合液。
(3) 核酸水解液：取2g RNA，加入15ml 1mol/L NaOH；另取2g RNA，加入15ml 1mol/L HCl，分别于100℃水浴加热水解20min后混合，调整pH值为6.0，过滤后调整体积为40ml。
4. 其它：无菌小滤纸片，干净镊子，无菌移液管，培养皿，酒精灯等。