产蛋白酶菌株Bacillus subtilis GS-1发酵条件优化及蛋白酶水解应用初步研究
枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵条件的优化
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化
饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化周映华; 吴胜莲; 贺月林; 缪东【期刊名称】《《湖南农业科学》》【年(卷),期】2010(000)011【总页数】3页(P21-23)【关键词】枯草芽孢杆菌; 培养基; 发酵条件; 优化【作者】周映华; 吴胜莲; 贺月林; 缪东【作者单位】湖南省微生物研究所湖南长沙 410009【正文语种】中文【中图分类】S816.3枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）基我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，已被越来越多的研制成微生物制剂。
其制剂是无毒、无残留、无污染的“绿色”添加剂，具有广阔的发展前景，现已在畜牧业、饲料行业中广泛应用，显示出了巨大的社会效益和生态效益。
枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能产生抗菌素，在动物肠道内具有较强生物夺氧能力，这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率和防病，促进生长起到重要作用。
目前在工业化生产中，仍然存在发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题。
笔者对枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件进行了研究，以期提高枯草芽孢杆菌的产量并降低生产成本。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种供试菌种为枯草芽孢杆菌，由湖南省微生物研究所菌种保藏室提供。
1.1.2 培养基检测培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，葡萄糖1%，氯化钠0.5%，琼脂2%；种子培养基：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH 7.0～7.2；基础发酵培养基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%、大豆粕1%、淀粉0.3%、3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%。
pH均调为7.0～7.2。
1.1.3 仪器设备供试仪器：SHP-250生化培养箱、1600倍微生物显微镜、PHS—25型数显酸度计、福玛QYC—211摇床、电热鼓风干燥箱等。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件(
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。
胃蛋白酶生产工艺
胃蛋白酶生产工艺胃蛋白酶是一种重要的消化酶，能够在胃部分解蛋白质，帮助人体消化吸收。
胃蛋白酶的生产工艺主要包括菌种培养、发酵、提取和纯化等步骤。
以下是一个简要的胃蛋白酶生产工艺的介绍。
首先，选择合适的菌种进行培养。
常用的菌种是产胃蛋白酶的细菌，如枯草杆菌属的嗜热枯草杆菌（Bacillus thermoproteolyticus），也可以使用其他蛋白酶产生菌株。
菌种的选取要考虑其产量、生长速度和酶活性等因素。
然后，进行菌种的发酵过程。
将菌种接种到培养基中，控制好发酵条件，使菌株充分生长和繁殖。
发酵过程中要注意控制温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进胃蛋白酶的产生。
接着，进行胃蛋白酶的提取。
发酵液经过离心分离，得到含有胃蛋白酶的上清液。
胃蛋白酶的提取过程中可能需要进行蛋白酶的激活或去除杂质等步骤，以提高酶的纯度和活性。
最后，进行胃蛋白酶的纯化和精制。
采用适当的分离技术，如层析、电泳等方法，将胃蛋白酶从提取液中分离出来，并去除其他成分和杂质。
纯化过程中要控制好条件，确保胃蛋白酶的纯度和活性。
在胃蛋白酶生产工艺中，需要重点考虑的因素有以下几点：1.菌种的选取和培养条件：选择产胃蛋白酶能力强、生长快速的菌株，并控制好培养基成分和发酵条件，以提高胃蛋白酶的产量和活性。
2.发酵条件的控制：控制好温度、pH值、氧气和营养物质等条件，以促进菌株的生长和胃蛋白酶的产生。
3.提取和纯化工艺的选择：根据实际情况选择合适的提取和纯化方法，以最大限度地提高胃蛋白酶的纯度和活性。
4.产品的质量控制：对生产的胃蛋白酶进行质量检测和控制，确保产品的活性和纯度达到要求。
综上所述，胃蛋白酶的生产工艺包括菌种培养、发酵、提取和纯化等过程。
通过合理选择菌种和优化发酵条件，以及采用适当的分离和纯化技术，可以获得高纯度、高活性的胃蛋白酶产品。
溶剂稳定性蛋白酶产生菌Bacillus licheniformis YP1的发酵优化
・
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第６ 卷第 ５ 期 ２０ ０ ８年 ９月
溶剂 稳定 性 蛋 白酶 产 生茵 Ｂ ｃ ｌｓ ｉ ｅｉ ｒ ｉ Ｙ １的发 酵 优 化 ａｉｕ ｌ ｈｎ ｏｍ ｓ Ｐ ｌ ｃ ｆ
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枯草芽孢杆菌液态发酵的研究
枯草芽孢杆菌液态发酵的研究李情敏;何名芳;张凤英;张超凤;陈卫平【摘要】该研究选取了一株从无花果中分离出的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为试验菌株,它可以产生抗逆性强的芽孢,非常适合应用于益生菌饲料加工生产.在单因素试验基础上,进行L9(33)正交试验,获得芽孢产量高、原料成本低廉的液态发酵培养基最佳配方为碎米水解液6％、酵母粉0.7％、KH2PO40.5％;对该菌的摇瓶发酵条件进行了初步研究,确定了液态发酵的最佳条件为pH值为5,温度37℃,接种量6％,转速200 r/mm,培养时间19h.在此最佳培养基配方及发酵条件下,发酵液OD600mm值可达7.38.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)002【总页数】5页(P43-47)【关键词】枯草芽孢杆菌;液态发酵;培养基配方;培养条件;优化【作者】李情敏;何名芳;张凤英;张超凤;陈卫平【作者单位】江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;赣州农业学校食品教研组,江西赣州341100;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045;江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌330045【正文语种】中文【中图分类】TQ920.6益生菌的生理功能有很多，最重要的是可以促进肠道有益微生物的繁殖，降低病原菌数量，提高机体免疫的功能［1］。
益生菌制剂以无毒、无残留、无副作用、不污染环境等优点，使其成为了有效的抗生素替代物，在防治动植物疾病，促进机体发育，延缓人类衰老等方面被人们广泛使用［2］，并成为生态循环农业中的一个重要纽带。
由于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）可形成抗逆性极强的芽孢，在稳定性方面具有先天优势，且枯草芽孢杆菌是我国农业部和美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）允许作为饲料添加剂的菌种［3-4］，其可以产生抑菌活性物质［5-6］，也可以作为一种理想的抗生素替代物。
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化
土壤中高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【摘要】从海南土壤中筛选得到一株高产蛋白酶的菌株,并对其进行菌种鉴定、产蛋白酶发酵条件优化及蛋白酶分子质量测定.经筛选,得到一株高产蛋白酶的菌株,编号为CAUH83,蛋白酶活力达到126 U/mL.通过形态观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析,鉴定菌株CAUH83为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens).通过单因素试验优化,确定该菌株产蛋白酶的最优发酵条件:大豆粉3.0％、蔗糖3.0％、初始pH 6.0、培养温度30 ℃、培养时间48 h.在此优化发酵条件下,该菌株产蛋白酶酶活力达到1 932.3 U/mL,较优化前提高15.3倍.通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶谱分析表明该蛋白酶分子质量约51 kDa.%A strain with high yield protease was isolated from soil sample of Hainan. The identification, fermentation conditions optimization and molecular mass of the strain were determined. After screening, a strain CAUH83 with high yield protease was obtained and the enzyme activity was 126 U/ml. Through morphological observation, physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis, strain CAUH83 was identified asSerratia marcescens. The optimal fermentation conditions were optimized by single factor experiments as follows: soybean flour 3.0％, sucrose 3.0％, initial pH 6.0, culture temperature 30 ℃ and time 48 h. Under the optimal conditions, the highest protease activity of the strain was 1 932.3 U/ml, which increased 15.3 times higher than that of before optimization. The molecular mass of the protease was about 51 kDa by SDS-PAGE and protease zymogram analysis.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)004【总页数】6页(P66-71)【关键词】粘质沙雷氏菌;筛选鉴定;蛋白酶;发酵条件优化【作者】耿芳;杨绍青;闫巧娟;刘军;龚思怡;江正强【作者单位】中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学工学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083【正文语种】中文【中图分类】TS201.3蛋白酶(protelytic enzymes,EC 3.4)是催化肽键水解的一类酶,在食品、饲料、医药、化工等行业有着广泛的应用［1］。
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关 键 词 ：枯草杆菌 Ｇ 一 ；蛋 白酶 ；发酵优化 ； Ｓ １ 响应 面法 ； 白水解 蛋
中图分 类 号 ：Ｑ ３．７ ９９９
文献标 志码 ：Ａ 文章 编号 ：０２ — ５９ （０２ ４ ０７ — ９ ５９ ６７ ２１）０ — ０９ ０
微生 物 来 源 ，并 表 现 出潜 在 应 用 价 值 ，但 是
Ｍｎ Ｏ （ ． ／ ） Ｓ ０ １ｇ Ｌ 。 １ ２ 发酵粗 酶 液制备 ．
取 ５ｍＬ于 ３ Ｉ培 养 了 ２ ７ｃ ＝ ４ ｈ的种 子 培养 液 接 种 于含 １０ｍＬ发 酵培 养基 的三 角瓶 中。３ ０ ７℃摇 床 培养 ４ ２ ０ ｒｍ ｎ ，将 发 酵 所得 菌 液 ８ ０ ０ｒ ８ｈ（ ０ ／ ｉ） ０ ／ ａ ｒ ｎ离 心 １ ｉ ｉ ０ｍ ｎ获得 发酵 液上 清 ，即为蛋 白酶 的粗 酶液 ，用 于蛋 白酶 活性测 定 。 １ ３ 酶活 力测 定 ．
收 稿 日期 ： ０ ２— ３— ５ ２ １ ０ ０
基金项 目 ：广州市重大科技攻关资助项 目 （０９ １ Ｅ ２ ） ２０ Ａ 一 ０１ ；中央高校基本科研业务费专项基金资助项 目 （０ １Ｚ ） ） ２ １Ｚ Ｉ １ ； Ｘ８ 新世纪优秀人 才计 划资助项 目 （ Ｃ Ｔ一１ —０ ６ ） ＮＥ １ １０ ；中国博士后科学基金 资助项 目 （０ ２ ５ １ １ ） ２ １ Ｍ １８７ 作者简介 ：王方华 （９ ２年生 ） 男 ， １８ ， 博士后 ；通讯作者 ：王永华 ，杨博 ；Ｅｍａ ：ｙｎ ｂ＠ｓｕ． ｄ． Ｎ — ｉ ａｇｏ ｃ ｔｅｕ ａ ｌ
８ ０
中山大学学报 （ 自然科学版 ）
第５ １卷
蛋 白酶 在洗涤 剂 、皮 革制 备 、蛋 白水解加 工 等
行 业 已经 得 到 了广 泛 的应 用 … 。经 过 蛋 白酶 水 解
ｌ 材 料 和方 法
１ １ 菌种 和培 养基 ． 实验 用 菌株 为枯 草芽孢 杆 菌 Ｂ ｃ ｌ ｕ ｔｉ Ｇ ａｉｕ ｓｂｉｓ Ｓ ｌｓ ｌ
摘 要 ：利用 Ｐａ ｅ ｕｍｎ（ Ｂ ｌ ｋｔＢ ｒａ Ｐ ）试验和相应面优化方法对枯草杆菌 Ｇ 一 菌株发酵产蛋白酶的条件进行优 ｃ ｔ Ｓ １
化 ，以期 获得高活性的蛋 白酶发 酵液。同时 ，将 发酵所 产蛋 白酶用 于蛋 白水解 实验 ，以进一 步考察蛋 白酶 的水 解特 性。首先 ，通过 Ｐ Ｂ试验 ，筛选 出 ３个影响菌株发酵过程 中蛋 白酶活力 的主要 因子 （ 化铵 、初始 ｐ 氯 Ｈ值 及 培养 温度 ） 。其次 ，通过 响应面优化法 ，进一步探讨各参数之 间 的相 互关 系并最终 拟合得 出发酵产 酶活 的方程 。
ｐ ｏ ｅ ｓ ｒ ｒ ｆ ｒｔ ｙ ｒ ｌ ｓｓ ｐ ｏ ｅｎｓｆｏ ａ ｉ ｌｓ ｕ ｃ ｈａ ｈａ ｏ ｐ ａ ｔ ｓ ｕ ｃ ． Ｔ ｏｅ ｓ ｒ ｔ ａ ｅ ｍｏ ｅ ｐ ｅｅ ｏ ｈ ｄ ｏｙ ｉ ｒ ｔ ｉ ｍ ｎ ｍａ ｏ ｒ ｅ ｔ ｎ ｔ ｔｆ ｍ ｌｎ ｏ ｒ ｅ ｒ ｒ ｈｅ ｐｒ ｔａ ｅ ｗａ ｒ ｎ ｏ ｈ ｄ ｏｙ ｅ ｃ ｅ ｃ ｌｂ ｎ ｈａ ｏ ｏ ｅ ｙ ａ ｎ ｃｄ ｆＧｌ ｓ ｐ ｏ ｅ ｔ ｙ ｒ ｌｚ ｈ ｍｉａ ｏ ｄ ｔ ｔｃ ｍｐ ｓ ｄ ｂ ｍｉ ｏ ａ ｉｓ ｏ ｕ，Ｖａ ，Ｉｅ，Ｌ ｕ，Ｐ ｅ ｏ ｇ， ｌ ｌ ｅ ｈ ｒＡｒ ａ ａ ｒ ａ ｏ ｅ ｔａ ｒａ ｐ ｉａ ｉｎ ｎ ｐｒ ｔｉ ｙ ｒ ｌｓｓ ｎｄ ｈ ｄ ｇ ｅ ｔｐ ｔｎ ｉ ｌｆ ｐ ｌｃ ｔｏ ｓ ｉ ｏ ｅｎ ｈ ｄ ｏｙ ｉ ． ｏ
多肽能 增加 营养 的高效利 用 ＩＪ ６。因此 ，在食 品加
工 行业 中 ，利 用蛋 白酶水 解 的方法 改善食 品的风 味
ｇＬ ，玉米浆 干粉 （ ５０ｇＬ ，蛋 白胨 （． ／ ／） １． ／ ） １０ｇ
Ｌ ， Ｎ ４ Ｉ （ ． ｇ Ｌ） Ｋ ２ Ｏ （１０ ／ ， ） Ｈ Ｃ ５０ ／ ， ＨＰ ４ ． ｇ Ｌ）
Ｇ ａｇｈｕ５ ０ ４ ， ｈｎ ） ｕ ｎ ｚｏ ６ １ Ｃ ｉａ １
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结果 表明 ，在氯化铵 （． ６ ／ ） 初 始 ｐ （ ． ）以及培养温度 ２ ． ３ ７ ８ｇ Ｌ ， Ｈ ５６ ２４℃ 的条件下 ，发酵液 中蛋 白酶 的最 高酶活 力能 达到 ３ ２ ８４ Ｕ ｍ 。水解试验结果表明 ：相对于植物来源 的蛋 白，该蛋 白酶粗提物对 于动物来 源的蛋 白具 ７ ． １ ／ Ｌ 有较 大的水解偏 好型。该蛋 白酶粗提物对 于 由谷 氨酸 、缬 氨酸 、异 亮氨酸 、亮 氨酸 、苯 丙氨酸或 精氨 酸所组 成
Ｇｕ ｎ ｚ ｏ ０ ４ ａ ｇ ｈ ｕ ５１ ６ ０， Ｃｈ ｎ ｉ ａ；
２．Ｓ ｈ ｏ ｆＢｉ ｓ ｉｎ ｅ ａ ｄ Ｂｉｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ，Ｓ ｕｔ ｉ ａ Ｕｎ ｖ ｒｉｙ ｏ ｃ ｎ ｌｇ ， ｃ ｏ ｌｏ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｏ ｎ ｉ ｅ ｒｎ ｏ ｈ Ｃｈ ｎ ｉｅ ｓｔ ｆＴｅ ｈ ｏ ｏ ｙ
Ｊ１ ２ １ ｕ． ０２
产蛋 白酶菌株 Ｂ ｃｌ ｕｔｉ Ｇ ａｉｕ ｓｂ ｌ Ｓ一１ ｌ ｓ ｉｓ 发酵 条件优化 及 蛋 白酶水解 应用初 步研究
王方华 亮 ，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ，王永华 ，杨 博
（ ．华 南理 工 大学轻 工与食 品 学 院 ，广 东 广 州 ５０４ ； １ １６ ０ ２ ．华理 工 大 学生物科 学与工程 学院 ，广 东 广 州 ５ ０ ４ ） １６ １
目前 开发 的蛋 白酶 还不 能 满 足 市场 的多 样 化 需求 。
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１ ，低温冻存的菌种首先用 Ｌｒ ．ｅ ａｉ Ｌ ）培 ｕｉ Ｂ ｒ ｎ （ Ｂ ａ ｔ 养 基进行 种 子液 的培 养 。Ｌ Ｂ培养 基组 成 为 ：蛋 白
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修饰 后 的蛋 白 ，其 自身 的溶 解性 、热稳 定性 以及 在 酸性 条件 下 的抗凝 集 性 均 能得 到有 效 提 高 。 同时 ， 在水 解过 程 中所产生 的多 肽和 自由氨基 酸 ，使得 其
自身 的功 能特性 和营 养价值 也有 所 提高 Ｉ』 ４ 。研 究 表 明 ，低分子 量 的多 肽能 被肠道 直接 吸收 且很 少发 生 过敏 反应 。另外 ，已报 道多种 具有 生物 学功 能 的
第５卷 １
２１ ０ ２年
第 ４期
７月
中山大学学报 （ 自然科学版 ）