范亚苇-南昌大学-响应面法优化粗壮脉纹孢菌CGMCC 3088固态发酵产纤维素酶培养基

响应面法优化粗壮脉纹孢菌CGMCC 3088固态发酵产纤维素酶培养基张玮范亚苇 邓泽元李红艳李静（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047）摘要：采用Plackett-Burman 设计和响应面法对粗壮脉纹孢菌固态发酵产纤维素酶的培养基组成进行优化。

结果表明：豆皮和酒糟是粗壮脉纹孢菌发酵产纤维素酶的最优碳源。

通过PB试验筛选出豆皮、酒糟和硫酸铵的添加量是影响产酶的主要因子，最后通过最陡爬坡试验和中心组合试验优化得出产纤维素酶的最优培养基组合为：豆皮64%，酒糟34%，硫酸铵2%，在此培养基下粗壮脉纹孢菌发酵产纤维素酶的酶活为2.83IU/g，较优化前的1.17IU/g提高了141.88%。

关键词：粗壮脉纹孢菌；纤维素酶；Plackett-Burman 设计；响应面；培养基Optimization of solid state fermentation medium of Neurospora crassa CGMCC 3088 forcellulases by response surface analysisAbstract: Plackett-Burman design and response surface methodology were applied to optimize the components in solid state fermentation medium for cellulases production of Neurospora crassa CGMCC 3088. The result shows that bean hull and distillers’grains are the best carbon source on solid state fermentation medium. Plackett-Burman design was applied to determine the specific medium components affecting cellulases activity and found that bean hull，distillers’ grains and ammonia sulfate were the key factors. Based on these results, steepest ascent experiments and central composite design were used for further optimization. Finally, the optimal medium was: 64% bean hull, 34% distillers’ grains and 2% ammonia sulfate. Under these conditions, the activity of cellulases significantly improved 141.88%, from 1.17IU/g to 2.83IU/g.Key words: Neurospora crassa; cellulases; Plackett-Burman design; RSM; medium纤维素酶是一组能降解木质纤维素的复杂酶系，纤维素酶的来源广泛，利用微生物发酵产纤维素酶是目前纤维素酶生产的主流。

本实验使用的粗壮脉纹孢菌，是由实验室自行筛选并诱变育种的一株高产纤维素酶的菌株[1]。

它不仅具有健全的纤维素酶系，而且在高纤维含量的培养基上生长旺盛。

由于纤维素酶的调节因ace2只受纤维素的影响[2]，所以不同纤维原料的纤维组成和结构不同诱导生产纤维素酶的活性差异较大[3-5]。

本实验选取豆皮、豆渣、米糠、啤酒糟、酒糟5种不同农副产品为纤维底物，对比不同纤维对真菌发酵产纤维素酶的影响，寻找最适合粗壮脉纹孢菌发酵产纤维素酶的培养基配方。

本实验拟通过Plackett-Burman 设计筛选出对粗壮脉纹孢菌产纤维素酶具有显著影响作用的因子，然后用响应面法优化各主要影响因子以确定其最佳值。

从而得到产纤维素酶的最适培养基配方，为今后的研究奠定基础。

1.材料与方法1.1试验材料基金项目：江西省科技支撑计划20133BBF6002；食品科学与技术国家重点实验室重点项目（SKLF-QN-201105）作者简介：张玮：（1989—），女，硕士研究生，营养与食品卫生学专业E-mail:permanent_wei@*通讯作者：范亚苇：副教授，博士，E-mail:fanyw6601 @1.1.1 菌种粗壮脉纹孢菌(Neurospora crassa) CGMCC 3088，本实验室自行筛选并保存。

1.1.2 培养基斜面培养基：PDA培养基活化培养基：沙氏培养基1.2仪器与设备LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂；HD-650超净工作台苏州苏杰净化设备有限公司；HWS-150恒温恒湿培养箱上海精宏实验设备有限公司；AR323CN 电子天平奥豪斯仪器（上海）有限公司；HH-SII恒温水浴锅巩义市英峡华仪器厂；15R型高速冷冻离心机江西省立康科技公司；DFT-200粉碎机温岭市大德中药器械有限公司；722紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司1.3试验方法1.3.1孢子悬浮液的制备在超净工作台上称取1g活化好的孢子加入装有无菌水和玻璃珠的锥形瓶中（100ml/250ml），在摇床上充分震荡30min，用血球计数板计数并调整浓度为108个/ml1.3.2培养条件将1ml孢子悬浮液接种在已灭菌的固体培养基中，30℃恒温，70%恒湿培养3d测定其纤维素酶活。

1.3.3粗酶液的制备将发酵后的培养基用玻璃研钵粉碎均匀后，称取1g固体发酵物，加入0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠（PH5.2）缓冲液10ml，180rpm震荡30min。

4℃离心10min，取上清液即为粗酶提取液。

1.3.4酶活测定方法：（1）滤纸酶（FPA）活力[6]以Whatman 1号定性滤纸为底物。

取4支试管，编号后分别加入0.5ml适当稀释后的酶液和1ml柠檬酸缓冲液，在50℃水浴中预热5min。

向1号试管中加入1.5mlDNS溶液以钝化酶活性，做空白对照。

然后向各试管中加入1cm*6cm的滤纸条，50℃水浴30min。

取出后立刻向2，3,4号试管中各加1.5mlDNS试剂，终止反应。

充分摇匀后沸水浴5min，冷却至室温，用蒸馏水定容，在540nm波长下测吸光度。

（2）内切-β-葡聚糖酶（Cx酶）活力[7]取4支试管，编号后分别加入0.5ml适当稀释后的酶液，在50℃水浴中预热5min。

向1号试管中加入1.5mlDNS溶液以钝化酶活性，做空白对照。

然后向各试管中加入1ml柠檬酸缓冲液（PH5.2）配置的1%羧甲基纤维素，50℃水浴30min。

取出后立刻向2，3，4号试管中各加1.5mlDNS试剂，终止反应。

充分摇匀后沸水浴5min，冷却至室温，用蒸馏水定容，在540nm 波长下测吸光度。

（3）外切-β-葡聚糖酶（C1酶）活力[8]取4支试管，编号后分别加入0.5ml适当稀释后的酶液，在50℃水浴中预热5min。

向1号试管中加入1.5mlDNS溶液以钝化酶活性，做空白对照。

然后向各试管中加入1ml柠檬酸缓冲液（PH5.2）配置的1%微晶纤维素，50℃水浴30min。

取出后立刻向2，3，4号试管中各加1.5mlDNS试剂，终止反应。

充分摇匀后沸水浴5min，冷却至室温，用蒸馏水定容，在540nm 波长下测吸光度。

（4）β-葡萄糖苷酶（βG）活力[9]取4支试管，编号后分别加入0.5ml适当稀释后的酶液，在50℃水浴中预热5min。

向1号试管中加入1.5mlDNS溶液以钝化酶活性，做空白对照。

然后向各试管中加入1ml柠檬酸缓冲液（PH5.2）配置的1%水杨苷，50℃水浴30min。

取出后立刻向2，3，4号试管中各加1.5mlDNS试剂，终止反应。

充分摇匀后沸水浴5min，冷却至室温，用蒸馏水定容，在540nm波长下测吸光度。

（5）酶活换算：50℃，PH5.2条件下，1ml粗酶提取液每分钟水解底物产生1μmol产物的酶量定义为1个酶活单位，用IU/ml表示，换算成每克湿物料含有的酶活，用IU/g表示。

1.3.5PB试验设计Plackett-Burman设计（PB设计）是用尽可能少的试验次数使主效应得到精确的估计，节省大量人力、物力和时间等。

本实验选用试验次数N=12的Plackett-Burman试验设计，以豆皮，豆渣和酒糟为主要原料，选择酒糟、豆渣、（NH4)2SO4、KH2PO4、CaCl2、MgSO4六个因素为研究对象，另外选择3个虚拟项用于估计误差，以能代表纤维素总酶活的滤纸酶活为响应值，从中筛选出影响酶活的主要影响因素。

PB设计各因子水平见表1。

表1 Placket-Burman 实验设计因素水平Table 1 Level of variables chosen for the Plackett-Burman trials因素符号编码水平(code level)factors symbols -1 1酒糟 A 20% 40%豆渣 B 10% 20%虚拟项 C / /硫酸铵 D 0.50% 1.50%磷酸二氢钾 E 0.20% 0.40%虚拟项 F / /氯化钙G 0.05% 0.15%虚拟项H / /硫酸镁I 0.05% 0.15%1.3.6最陡爬坡试验设计响应面的考察必须在接近的领域里拟合方程才能更接近真实情况[10]。

最陡爬坡实验将响应值的变化和梯度方向作为爬坡方向，根据各因子的变化大小来判断变化步长，快速、高效的逼近最佳值区域。

根据Plackett-Burman试验数据分析可知，酒糟和硫酸铵对纤维素酶的活力有显著影响。

最陡爬坡试验设计见表2。

RUN 酒糟（%）硫酸铵（%）豆皮（%）FPA(IU/g)1 20 0.5 79.5 1.442 25 1.0 74 2.013 30 1.5 68.5 2.344 35 2 63 1.985 40 2.5 57.5 1.641.3.7中心组合试验设计筛选出影响粗壮脉纹孢菌发酵产纤维素酶的主要影响因子，并确定其最大响应区域后，图1粗壮脉纹孢菌固态发酵不同农副产品产纤维素酶能力Fig.1 Effect of different substrate on enzyme activity yield of Neurosporacrassa in solid fermentation采用两因素五水平的中心组合试验（central composition design ，CCD ）对酒糟和硫酸铵的添加量进一步优化，以获得该菌产纤维素酶的最佳培养基。