磷酸酶的测定方法
酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶是一种酶类物质，它在人体细胞内起着重要的催化作用，并具有重要的调节作用。
因此，在许多疾病的诊断中，检测酸性磷酸酶的活性和浓度是非常重要的。
以下是关于酸性磷酸酶的显示方法的中文介绍。
常见的酸性磷酸酶显示方法包括酶活力测定、基础染色和免疫染色等。
这些方法可以通过不同的化学试剂和仪器设备来实现，从而得出酸性磷酸酶的活性和浓度。
2. 酶活力测定法
酶活力测定法是用于检测酸性磷酸酶活性的一种方法，其原理是通过一系列的化学反应来形成可测定的产物。
这种方法通常使用p-nitrophenyl phosphate（pNPP）作为酶活力测量底物，它可以转化为p-nitrophenol。
测量产生的p-nitrophenol的光密度可以用于计算样品中酸性磷酸酶的活性。
3. 基础染色法
基础染色法是通过将酸性磷酸酶活性产生的颜色染到细胞和组织切片上来显示酸性磷酸酶的分布和浓度。
这种方法使用基础染料如甲基绿、苏木精、尤红和新绿等来染色，然后通过显微镜观察染色后的细胞和组织切片来判断样品中是否含有酸性磷酸酶。
免疫染色法是通过使用抗体来检测酸性磷酸酶的存在和浓度的方法。
该方法使用细胞和组织切片，将其与具有特异性抗体的二抗结合，然后用荧光素或酶标记的标记剂来标记结合的二抗。
最终，通过荧光显微镜或酶标的方法来检测抗体与酸性磷酸酶的结合情况。
总结：。
土壤酸性磷酸酶活性测定方法
土壤酸性磷酸酶活性测定方法土壤酸性磷酸酶活性的测定⑴原理该方法以对硝基苯磷酸二钠（即pNPP）为基质，基质在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成黄色色的对硝基苯酚（即pNP），该黄色溶液在410nm处有最大吸收光值，根据对硝基苯酚的生成数量与黄色溶液的吸光度呈正比来进行定量分析，以此来反映土壤酸性磷酸酶的活性，采用的是对硝基苯磷酸二钠比色法。
⑵测定方法①称取壤土0.2g、砂土0.5g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中，加入0.2 mL甲苯和4 mL ph6.5 磷酸缓冲液，再加1 mL 0.05 mol/L对硝基苯磷酸二钠溶液（用磷酸缓冲液配制），摇匀后加盖，放进36~37℃的培养箱中进行培养1个小时；②培养完成后取出加入0.5 mol/L的CaCl2 1 mL 及0.5 mol/L的NaOH 4 mL，摇匀；③而后在2500r/min下离心5min；取上层清夜于10ml 离心管4000r/min下再离心5min.④取上清液在410 nm处比色，并记录吸收光值。
⑶标准曲线的制作①取13支玻璃试管，按顺序编号，并按表2加入试剂。
表2对硝基苯酚标准曲线配制表离心管号0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、120.005?mol/mLpNP（mL）0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 0.09 0.10 0.11 0.12H2O（mL）0.8、0.79、0.78、0.77、0.76、0.75、0.74、0.73、0.72 0.71 0.70 0.69 0.68pNP的含量（?mol）0、0.00005、0.0001、0.00015、0.0002、0.00025、0.0003、0.00035、0.0004 0.00045 0.0005 0.00055 0.0006摇匀0.2mol/LpH6.5磷酸缓冲液（mL） 40.5mol/L CaCl2（mL） 10.5mol/L NaOH（mL） 4②混匀后，转入10mL的离心管中，在2500r/min下离心5min，再在4000r/min下离心5min以0号作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。
血清中碱性磷酸酶的测定
果。
误差分析
误差来源识别
分析测定过程中可能存在的误差来源，如试剂不稳定 性、操作不规范等。
误差评估
对误差进行定量评估，了解误差对测定结果的影响程 度。
误差控制
采取相应的措施控制误差，如定期校准仪器、规范操 作流程等，以提高测定结果的准确性和可靠性。
05 结论
CHAPTER
实验总结
实验原理
本实验基于碱性磷酸酶在pH值为9.6 的磷酸盐缓冲液中，能够将磷酸苯二 钠水解为苯酚和磷酸，苯酚在硫酸的 作用下可以形成稳定的苯酚钠盐，进 而通过分光光度计测定其吸光度，从 而计算碱性磷酸酶的活性。
02
探索其他相关指标与碱性磷酸酶的关联性，以更全面地评估肝
胆疾病的病情和治疗效果。
针对实验中的关键步骤和影响因素进行深入研究，以提高实验
03
的准确性和可靠性。
谢谢
THANKS
测定方法分类
根据测定原理，碱性磷酸酶的 测定方法可分为化学法和生物 法两类。
化学法包括酚试剂法、磷酸苯 二钠法等；生物法包括利用同 工酶的电泳法和免疫法等。
其中，酚试剂法由于操作简便、 准确度高，是目前临床上最常 用的测定方法。
03 实验步骤
CHAPTER
样本采集与处理
采集血清样本
从患者静脉采血，分离出血清， 避免溶血和污染。
数据转换
根据需要，将测量值转换为相应 的浓度或活性单位，以便进行比 较和解释。
结果判断与解读
正常范围判断
01
根据参考值范围，判断血清中碱性磷酸酶的活性是否在正常范
围内。
异常结果解读
02
对于异常结果，应结合临床情况和相关指标进行分析，以确定
可能的病因或病理状态。
土壤磷酸酶(酸性、中性和碱性磷酸酶
土壤磷酸酶测定（酸性、中性和碱性磷酸酶）1. 分析意义土壤有机磷转化受多种因子制约，尤其是磷酸酶的参与，可加速有机磷的脱磷速度。
在pH4-9的土壤中均有磷酸酶。
积累的磷酸酶对土壤磷素的有效性具有重要作用。
研究证明，磷酸酶与土壤碳、氮含量呈正相关，与有效磷含量及pH也有关。
磷酸酶活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标。
2. 试验原理Kroll等（1955）最早提出用苯基磷酸盐作基质，以酚的释放量表示磷酸酶活性。
测定磷酸酶主要根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。
前一种通称为有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法。
后一种称为无机磷含量法。
研究证明，磷酸酶有三种最适pH：4-5，6-7和8-10。
所以，测定酸性、中性和碱性反应土壤的磷酸酶，要提供相应的pH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。
测定磷酸酶常采用的pH缓冲体系有醋酸盐缓冲液（pH5.0-5.4），柠檬酸盐缓冲液（pH7.0），三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH7.0-8.5），硼酸缓冲液（pH9-10）。
测定磷酸酶时，用各种磷酸一酯作为基质。
常用的基质有苯磷酸二钠、酚酞磷酸钠、甘油磷酸钠、α或β萘酚磷酸钠、ρ-硝基苯磷酸钠等。
3. 试剂配制a. 0.5％磷酸苯二钠（用缓冲液配制）；b. pH5醋酸盐缓冲液、pH7柠檬酸盐缓冲液、pH9.4硼酸盐缓冲液；c. 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2.6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10mL 96％乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。
保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用；d. 酚的标准溶液：酚原液－取1g重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中；酚工作液－取10mL 酚原液稀释至1L（每毫升含0.01毫克酚）；e. 甲苯；f. 0.3％硫酸铝溶液。
4. 标准曲线绘制：取1、3、5、7、9、11和13mL酚工作液，置于50mL容量瓶中，每瓶加入5mL缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，即得0.0002、0.0006、0.0010、0.0014、0.0018、0.0022和0.0026mg ·g -1浓度的酚标准溶液梯度。
碱性磷酸酶测定
碱性磷酸酶测定一、试剂配制1、甲苯2、pH9.8氯化铵-氢氧化铵缓冲液：称取20g纯氯化铵，溶于少量水（我配200ml，用一百多毫升水溶40g氯化铵），然后加入浓氨水润洗烧杯和定容至100ml，用pH试纸测pH，pH为10即可，不用刻意调pH。
（氨水很臭，需要带口罩在通风橱配）3、8%铁氰化钾溶液（只能用一周，放冰箱保存）：取8g铁氰化钾，用水定容至100ml。
4、2%4-氨基安替比林（只能用一周，放冰箱保存）：取2g4-氨基安替比林，用水定容至100ml。
5、0.5%磷酸苯二钠溶液（用pH9.4硼酸缓冲液配）（1）先配制pH9.4硼酸盐缓冲液：称取4.768g硼砂（十水合四硼酸钠）和0.44g纯氢氧化钠，用蒸馏水定容至1000ml。
（硼砂需要用电炉加热配制，硼砂用称量纸称量，氢氧化钠需要用烧杯称量,基本不用配pH，pH试纸测为9）（2）称取5.05g磷酸苯二钠，用pH9.4硼酸缓冲液定容至1000ml。
6、酚标准溶液：酚溶液：称取1g苯酚用水溶至1L，保存于暗色瓶中。
（苯酚还是需要水浴加热，详细配法看脲酶测定，但由于1g很难准确称量，并在我配完发现天平托盘上结了一层苯酚，但测量后不影响标线的准确程度，R值为三个9）酚工作液：取10ml原液用水稀释至1L(1ml中含0.01mg/mL)二、测定过程1、称取5g过1mm筛的土样于绿色塑料瓶（每个样需要3个重复，前两个重复和第三个重复分开放，第三个重复为无基质重复，每天做两个无土样重复，此重复加甲苯、磷酸苯二钠溶液），加5滴甲苯（用滴管加5滴），盖盖盖子后用震荡机低速震荡15min（我选择160的速度），然后给第三个重复加入20ml蒸馏水，给前两个重复加入20ml磷酸苯二钠，盖上盖子后充分摇匀后在37摄氏度恒温箱培养2小时。
2、培养结束后过滤，过滤后取5ml滤液加入50ml容量瓶（用5ml枪加，由于过滤液体没那么多，每加一个样用两遍蒸馏水润洗枪），加水至大概20ml，再加0.25ml氯化铵-氢氧化铵缓冲液，0.5ml4-氨基安替比林液，0.5ml铁氰化钾溶液（用1ml枪加），每加一种都要充分摇匀。
碱性磷酸酶Km值的测定-毕业论文-
12
mmol/L
78
16
0
1/[S] 1 0.333 0.200 0.167 0.125 0.083 0.063 1/OD
2、作图
■ 以 [s ]为横轴，OD510为纵横作图，观 察曲线形状；查Km值
■ 以1／［s]为横轴，1／OD510为纵轴作图 观察曲线形状；查Km值
■ 比较两个值的差异.
OD510
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 底物液 0.05 0.15 0.25 0.30 0.40 0.60 0.80 0
(0.04M)
碳酸缓 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0
液(pH=10)
蒸馏水 0.95 0.85 0.75 0.70 0.60 0.40 0.20 1
■ 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其 底物，生成酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4一氨 基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌 的衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低 其反应式如下：
磷酸苯二钠+H2O Fra bibliotekKP OH- 苯酚
苯酚+4-氨基安替比林 K3Fe(CN)6 醌衍生物 （红色）
【实验操作】
碱性磷酸酶Km值 的测定
【实验目的】
■ 1 . 了解酶的Km值测定原理和方法
■ 2．掌握碱性磷酸酶（AKP）活性 测定的原理和方法
【实验原理】
■ 在温度，PH及酶浓度恒定的条件下，酶促 反应的初速度随底物浓度（S）增大而增加 但当底物浓度增大到一定极限时，则反应 速度趋于恒定，此最大反应速度Vmax，反 应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方 程来表示，即：
1/OD510
VMAX
土壤磷酸酶测定方法
磷酸单酯酶（对硝基苯磷酸盐法）(Tabatabai, 1994)1.原理：磷酸单酯酶水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对硝基苯酚的含量，来估算磷酸单酯酶的活性。
酸性和碱性磷酸酶的活性可以通过控制反应的pH值来分别测定。
2.试剂: （1）甲苯。
（2）pH 6.5缓冲溶液：取200 ml通用缓冲液至1000 ml烧杯中，用盐酸（0.1 mol ﹒L－1）溶液调至pH6.5，用水定容；或pH 11缓冲溶液：用氢氧化钠（0.1 mol﹒L －1）溶液调至pH11，用水定容。
通用缓冲液：称取12.1g三（羟甲基）氨基甲烷、11.6g丁烯二酸、14.0 g柠檬酸和6.3g硼酸于488 ml氢氧化钠溶液[C（NaOH）＝1 mol﹒L－1]中，然后用水稀释到1L，低温贮存备用。
)（4）对硝基苯磷酸二钠溶液（0.05 mol﹒L－1）：称取0.9303 g六水对硝基苯磷酸二钠溶于40 ml PH 6.5或者11的缓冲溶液，用同一种缓冲溶液稀释至50 ml，低温贮存。
（5）0.5 M CaCl2溶液：称取73.5 g CaCl2﹒2H2O溶解于700 mL水中，用水定容到1L。
（6）0.5 mol﹒L－1 NaOH溶液：称取20 g NaOH 溶解于700 mL水中，用水定容到1L。
（7）对硝基苯酚标准溶液：溶解1.0 g 对硝基苯酚于700 ml 水中，稀释至1L，低温保存。
配置工作曲线用的溶液。
将已经配置好的标准溶液用水稀释100倍，再分别吸取稀释后的标准溶液1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml于50 ml三角瓶中（分别含0 mg、0.01 mg、0.02 mg、0.03 mg、0.04 mg、0.05 mg的对硝基苯酚），分别用水调节至5 ml，再加入1 ml的CaCl2和4 ml 的NaOH溶液，轻摇几秒钟，滤纸过滤，400 nm－420 nm条件下比色。
3. 仪器:50mL三角瓶；培养箱；分光光度计4. 步骤:将1.00 g新鲜土样（< 2 mm）放入50mL三角瓶中，加入0.2 mL 甲苯、4 ml的缓冲液和1 ml的对硝基苯磷酸二钠溶液。
磷酸酶活性测定
磷酸酶活性测定磷酸酶可催化磷酸脂类或磷酸酐的水解,其活性的高低直接影响着土壤有机磷的分解转化及其生物有效性(耿玉清等，2008)。
土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，可作为反映土壤磷素水平的一项生物指标（于群英，2001）。
测定方法: 磷酸苯二钠比色法1. 试剂配制（1） pH9.8氯化铵―氢氧化铵缓冲液100mL：取20g纯氯化铵，溶于100mL浓氢氧化铵中。
（2） 8%铁氰化钾液100mL:取8g铁氰化钾，溶于蒸馏水中，稀释至100mL(此液只能用一周)。
（3） 2% 4-氨基氨替比林液100mL:取2g 4-氨基氨替比林溶于水中，稀释至100mL(此液只能用一周)。
（4） 0.5%磷酸苯二钠溶液500mL:取2.5g磷酸苯二钠溶于水中，稀释至500mL。
（5）酚的标准溶液：酚原液：取1g重蒸酚（phenol,又名石碳酸）溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。
酚工作液：取10mL酚原液稀释至1L（每mL含0.01mg酚）。
（6）甲苯。
2. 操作步骤（1）标准曲线绘制：取1，3，5，7，9，11，13mL酚工作液置于50mL容量瓶中，另取一管做空白对照，分别加入20mL蒸馏水。
再加入0.25mL缓冲液、0.5mL 4-氨基氨替比林液，0.5mL铁氰化钾液。
每次加入试剂要充分摇动，最后定容至50mL。
在15min内，在分光光度计上于510nm处比色测定溶液的光密度。
最后绘成标准曲线。
（2）土壤磷酸酶活性测定：称5.00g风干土样，置于50mL三角瓶中，加5滴甲苯后再加入20mL0.5%磷酸苯二钠,充分振荡后于37℃恒温箱中培养2h。
取培养后的滤液5mL，按标准曲线所述方法显色，比色测定。
土壤样品酶活性测定分三次进行：新鲜土样测量一次，风干后测量一次，风干土样保存1个月后再测量一次。
3. 结果计算磷酸酶活性，以2h后100g土壤中P2O5的毫克数表示。
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磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)：
土壤磷酸酶是植物根系与微生物的分泌产物。
磷酸酶与土壤P素转化密切相关，是土壤P素肥力的指标。
1、试剂配制
（1）甲苯
（2）磷酸苯二钠：称取6.75g磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L（1毫升含25mg酚）
（3）缓冲液
（4）pＨ9.0硼酸盐缓冲液
缓冲溶液配制：
(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)
A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。
B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL
醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA＋3mLB混合即得
（2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0）
硼砂－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）：
A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中
B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中
50mLA＋43mLB加水稀释至200mL，混匀即得
（3）硼酸盐缓冲液（pH9.0）
A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中
B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中
硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB混匀即得
（4）中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）
A：0.1M柠檬酸溶液：21.01g柠檬酸. H2O（或是19.21gC6H8O7）溶于1000mL 蒸馏水中
B：0.2M磷酸氢二钠：35.61g磷酸氢二钠.2 H2O（53.63g磷酸氢二钠.7 H2O或是71.7g磷酸氢二钠.12 H2O）溶于1000mL蒸馏水中
柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB混匀即得
（5）2.5％铁氰化钾
（6）0.5％的4－氨基安替吡啉溶液
（7）酚原液：2克酚溶液蒸馏水定容致1升（2mg/mL），溶液在暗色中稳定。
（8）酚工作液：取2.5mL原液稀释至100mL（0.05mg酚/mL）
2、操作步骤：
称取5ｇ土于50mL容量瓶中，加1mL甲苯，加塞塞紧轻摇15min。
再加入5mL磷酸苯二钠（6.75g溶于1L水）和5mL相应的缓冲液(酸性磷酸酶用pＨ5.0大醋酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液)，同时对每一土样都设置用5mL水代替基质的对照。
仔细摇匀后放入恒温箱,在37℃下培养24ｈ。
用热至38℃的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度(甲苯浮在刻度以上)，再用致密滤纸过滤。
取1mL滤液于100mL容量瓶中，加5mL pＨ9.0硼酸盐缓冲液，再加入3mL 2.5％的铁氰化钾和3mL 0.5％的4－氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。
待颜色稳定时（20-30min），在波长570nm处测定各样品的消光值。
土壤的磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。
磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用P的毫克数表示，结果需乘0.32；若用P2O5的毫克数表示，需乘2.29）。
标准曲线：分别向100mL容量瓶中注入1，3，5，7，9，11mL工作液并显色定容（分别相当于0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55mg酚），待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。
5mL pＨ9.0硼酸盐缓冲液，再加入3mL 2.5％的铁氰化钾和3mL 0.5％的4－氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然后加水定容。