构建点突变质粒步骤
重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达
重组pCMV-N-Tudor-SN点突变质粒的构建及表达杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【摘要】目的：构建Tudor-SN蛋白的Serine426（S426）、Serine781（S781）、Threonine240（T240）和Threonine429（T429）的点突变质粒，并使该重组质粒能够在HeLa细胞中融合表达。
方法：利用定点突变技术，对Tudor-SN蛋白进行S426A、S781A、T240A、T429A点突变，通过双酶切的方法获得Tudor-SN.Mutants片段，最后将其连入到pCMV-N-Flag载体中。
在HeLa细胞中转染该质粒，利用Western blot技术检测质粒表达效率。
结果：（1）重组质粒经双酶切鉴定，可以观察到载体与Tudor-SN.Mutants的条带。
（2）转染突变质粒后可看出HeLa细胞中有Flag蛋白表达。
结论：质粒构建成功，可以用于下一步科学研究使用。
%Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag. Methods:The Serine426 (S426), Serine781(S781), Threonine240(T240)andThreonine429(T429)of Tudor-SN were transformed into Alanine by site-directed mutagenesis technique. Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion, and then inserted into pCMV-N-Flag vector. The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot. Results:(1)The vector and Tudor-SN. Mutants could be observed by restricting double enzyme digestion.(2)Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid. Conclusion:The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully, and may be useful for further study.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2016(000)001【总页数】4页(P5-8)【关键词】人类Tudor-SN蛋白;pCMV-N-Flag;重组质粒;融合蛋白【作者】杨文栋;苏超;张春燕;赵亚丽;任媛媛;高星杰;杨洁;何津岩【作者单位】天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070;]天津医科大学医学生物化学与分子生物学系，天津300070;]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070; ]天津医科大学基础医学研究中心，天津300070;天津医科大学细胞生物学系，天津300070【正文语种】中文【中图分类】Q7Abstract Objective:To construct eukaryotic Flag expressing recombinant pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag.Methods：The Serine426（S426）,Serine781（S781）,Threonine240（T240）and Threonine429（T429）of Tudor-SN were transformed into Alanine by site- directed mutagenesis technique.Then the Tudor-SN.Mutants were obtained by restricting double enzyme digestion,and then inserted into pCMVN-Flag vector.The recombinant plasmids were transfected into HeLa and observed by Western blot.Results：（1）The vectorand Tudor-SN.Mutants could beobserved by restricting double enzyme digestion.（2）Flag was expressed by HeLa which was transfected with recombinant plasmid.Conclusion：The recombinant plasmids of pCMV-N-Tudor-SN.Mutants-Flag are constructed successfully,and may be useful for furtherstudy.Key words human Tudor-SN；pCMV-N-Flag；recombinant plasmid；fusion protein人类Tudor-SN蛋白，又称SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）或p100，该蛋白首次以EB病毒细胞核抗原2（epstein-barr virus nuclear protein 2，EBNA2）的转录共激活因子被发现[1]。
环状质粒 pcr 构建定点突变序列
环状质粒 pcr 构建定点突变序列标题：环状质粒PCR构建定点突变序列在遗传工程领域，环状质粒PCR技术被广泛应用于构建定点突变序列，以实现对目标基因的精确控制和调节。
本文将介绍环状质粒PCR构建定点突变序列的原理、步骤以及应用前景。
一、原理环状质粒PCR是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的技术，通过引入特定的引物和模板DNA，可以在特定位点引发突变。
其原理主要包括以下几个步骤：1.设计引物：根据目标基因序列，在突变位点的上下游设计引物，确保能够选择性扩增目标序列。
2.扩增反应：将设计好的引物与模板DNA一起加入PCR反应体系，进行多轮的循环反应，使目标序列得以扩增。
3.定点突变：在PCR反应体系中加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列进行配对，从而引发突变。
4.纯化和检测：通过凝胶电泳或其他检测手段，验证突变序列的引入是否成功。
二、步骤环状质粒PCR构建定点突变序列的步骤如下：1.设计引物：根据目标基因序列，利用生物信息学工具设计引物，确保引物的特异性和扩增效率。
2.模板制备：从目标基因所在的质粒中提取模板DNA，确保模板的纯度和完整性。
3.反应体系准备：根据PCR反应的需要，准备好反应缓冲液、酶、引物和dNTP等试剂。
4.扩增反应：将模板DNA与反应体系混合，利用PCR仪进行循环反应。
根据目标序列的长度和复杂性，设置合适的扩增程序和循环次数。
5.突变引入：在PCR反应的合适环节，加入含有目标突变碱基的核苷酸，使其与目标序列发生配对，引发突变。
6.纯化和检测：通过凝胶电泳等方法，纯化扩增产物并进行突变检测，确认突变序列的引入是否成功。
三、应用前景环状质粒PCR构建定点突变序列具有以下应用前景：1.基因功能研究：通过引入特定的突变序列，可以研究目标基因的功能和作用机制，揭示基因与表型之间的关系。
2.基因工程改良：利用定点突变序列构建新的基因表达载体，可以实现对基因表达的精确调控，为基因工程改良提供技术支持。
质粒构建
PCR（多聚酶链式反应）一、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。
基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1、变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2、退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3、延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
二、按下列组份配制PCR 反应液TaKaRa LA Taq（5 U/μl）0.5 μl10×LA PCR Buffer II（Mg2+ Plus） 5 μldNTP Mixture（各2.5 mM）8 μl模板DNA（λDNA）* 2.5 ng引物1（10 μM） 2 μl引物2（10 μM） 2 μl灭菌蒸馏水up to 50 μl*【50 μl PCR反应体系中模板DNA 推荐使用量】人基因组DNA 0.1 μg～1 μg大肠杆菌基因组DNA 10 ng～100 ngλDNA 0.5 ng～5 ng质粒DNA 0.1 ng～10 ng三、PCR 反应条件。
以λDNA 为模板，扩增 1 kbp、35 kbp 的DNA片段的PCR 反应条件如下：【1 kbp】95℃ 5 min.95℃30 sec.55℃30 sec. 35 Cycles72℃ 1 min.72℃10 min.【35 kbp】94℃ 5 min.98℃10 sec.68℃15 min. 35 Cycles72℃10 min.常用循环：95℃ 5 min.95℃45 sec.55℃45 sec. 35 Cycles72℃ 2 min.72℃10 min.四、可能出现的问题与解决方案：1、假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。
突变型PUMA质粒的构建及表达
研 究使 用 的 Ｐ Ｕ ＭＡ基 因来 源 于 ｐ Ｃ Ｅ Ｐ ４ 一 （ Ｈ Ａ） － Ｐ ｕ － ＭＡ质粒 ， 通 过野 生型 和 突变 型 质粒 的成 功 构 建 ， 旨 在 为 突变 型 Ｐ Ｕ ＭＡ对 肿 瘤 细胞 的促 凋 亡 功 能 研 究
奠定基 础 。
隆到 ｐ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ ２ ． Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ载 体 上 ， 构建 Ｐ Ｕ Ｍ Ａ 真 核 表 达 载 体
ｐ Ｉ Ｒ Ｅ Ｓ ２ 一 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ 一 （ ＨＡ） ． Ｐ Ｕ Ｍ Ａ， 利 用 定 点 突 变 技 术 构 建 ｐ ｌ Ｒ Ｅ Ｓ ２ 一 Ｅ Ｇ Ｆ Ｐ 一 （ Ｈ Ａ） ， 一 Ｐ Ｕ Ｍ Ａ— Ｔ ２ ８ Ｇ， 行 Ｐ Ｃ Ｒ及 测 序 鉴 定 ； 脂 质体分别 将两种 质粒转 染 Ｈｅ ｌ ａ细胞 ， 同 时设 未转染 的 阴性 对照组及转染 空 载体 组 （ ４个 实 验组 ） ； Ｐ Ｉ 染 色观 察 Ｐ Ｕ Ｍ Ａ 对细胞的促凋亡作 用 ； 流式 细胞仪检测细胞 凋亡率 ； Ｒ Ｔ — Ｐ Ｃ Ｒ 检测 Ｐ Ｕ ＭＡ的表达 ； Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂ ｌ ｏ ｔ 检测 突变 型 Ｐ Ｕ ＭＡ蛋 白和 标签蛋 白的表达 。结果 经Ｐ Ｃ Ｒ及 测序 结果 表 明 ， 正确 构 建野生型 、 突变 型 Ｐ Ｕ ＭＡ重组 质粒 ， Ｐ Ｕ ＭＡ基 因第 １ ０位氨基 酸的第 ２ ８～３ ０位 碱 基 由丝 氨 酸 （ Ｔ Ｃ Ｃ） 突 变 为 丙 氨 酸
Ａ ｃ ｔ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ０ １ ３ Ａ ｐ ｒ ； ４ ８ （ ４ ）
・３ ４ １・
突变型 Ｐ Ｕ ＭＡ质粒 的构建及表达
修饰组学点突变质粒构建
修饰组学点突变质粒构建在研究领域，大家常说“科学是个漫长的过程”，但在我看来，这句话的意思是“科学是一场持久战，考验的是耐心与毅力。
”今天咱们聊点儿有趣的——修饰组学点突变质粒构建。
别被这几个词吓到，咱们慢慢捋清楚，绝对让你瞬间明白是个啥意思。
说白了，它就是用一种高大上的方法，在实验室里研究基因怎么变、怎么转变、怎么活跃。
你可以把它想象成给基因换装，让它穿上新的“衣服”，然后看看它的表现如何。
你肯定会想，“怎么做到的？”呵呵，别急，咱这就开始给你讲一讲。
你得知道“质粒”是啥。
质粒其实就是一种细菌里的小小“工具箱”，它自带一堆基因信息，可以帮助细菌快速生产需要的物质。
科学家们聪明得很，发现质粒这个东西既然能在细菌里自如地“走来走去”，那也能让它变身成一种载体，帮忙运送某些基因到细胞里。
这时候的质粒就不单纯是个“小帮手”，它变成了科学实验中的“大明星”了。
不过，质粒要做“点突变”，可不简单。
你要理解，点突变就是在基因的某个地方做个小手脚。
就好像你平常打字时，不小心把“b”打成了“p”，这就是个突变——没啥大不了，效果差异小。
但要是让“b”变成了“x”，那可就麻烦了。
基因也是一样，哪里出点差错，可能就能让细胞的工作方式发生天翻地覆的变化。
这就要求科学家得精准地去改动，不能差一点点。
为了达到这个目的，首先你得有个“质粒载体”。
这种载体上有一堆小小的“插口”，你可以在这里插入新的基因，或者把原本的基因“修一修”。
听起来挺简单，实际上就像是给手机换个内存卡一样，你得找到对的插槽。
然后，再用一些工具，比如PCR扩增、酶切技术，把你想要的基因片段插进去。
好比你往盒子里装东西，得保证东西能完美fit进去，不然怎么盖上盖子？关键的步骤来了，那就是“点突变”了。
点突变的过程听起来有点像是神奇的魔法。
科学家会通过一种叫做“定点突变”的技术，改变质粒上的特定基因位置。
就像你想修个电路，得去准确地找到坏掉的那根电线。
你可以通过化学方法，或者使用一些叫做“引物”的小工具，把目标区域的基因给“换掉”，然后看看它会不会变得更厉害或者更弱。
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR )等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化), 包括碱基的添加、删除、点突变等。
一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点,弓I物一般长25~45 bp ,设计的突变位点需位于引物中部。
二、反应1.使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。
2.反应体系：(1) 10x pyrobest Buffer: 5 ul(2 ) dNTP Mixture(10 mM) : 1 ul(3 )模板DNA(5~50 ng) : lul(4) primer 1 (125 ng) : 1 ul(5 ) primer 2 (125 ng) : 1 ul(6 ) pyrobest DNA polymerase ( TaKaRa ) (5 U/ul) : 0.25 ul(7 )加无菌蒸憎水至50ul.三.产物沉淀纯化1.加1/10体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上(或-20°C冰箱)5min ,离心弃上清。
2.70-75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中(此步可省略，直接用Dpnl 酶切)。
四、Dpnl酶切1.酶切体系(1) Buffer : 2 ul(2 ) BSA (100x ) : 0.2 ul(3 ) DNA : xul(4) Dpnl: 0.5 ul(5 )加无菌去离子水至20 ul。
2.3(TC酶切1~4 h。
3.65°C水浴15min终止反应。
五、转化将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株,利用抗生素筛选突变子。
六、测序验证注意事项1.引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
质粒定点突变操作步骤
质粒定点突变
1.简介
定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
本实验主要原理是设计一对包含突变位点的引物，和模板质粒退火后用高保真DNA聚合酶循环延伸后用Dpnl 酶切延伸产物。
由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经过dam甲基化修饰的，对Dpnl敏感而被切碎（Dpnl 识别序列为甲基化的GATC，GA TC在几乎各种质粒中不止一次出现），而体外合成的突变质粒没有甲基化不被消化因此得以在成功转化，随后得到突变的质粒克隆。
2.材料
2.1试剂
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（诺唯赞Vazyme Biotech，#P505-d1-AA）
2 × Phanta Max Buffer（诺唯赞Vazyme Biotech，#PB505）
dNTP Mix (10 mM each)（诺唯赞Vazyme Biotech，# P031-01/02）
DMSO
3.步骤
1、设计一对包含突变位点的互补引物。
2、反应体系
反应程序
所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分混匀，用完之后请及时放回-20℃保存。
3、反应产物加入0.5 μl Dpnl酶，37 ℃静置>2 hs。
4、静置后取2 μl加入100 μl Turbo进行转化，后面步骤同分子克隆。
质粒的构建
质粒的构建一、质粒构建的基本原理1.1 质粒结构质粒是一种环状DNA分子，通常大小在1-200 kb之间，其中包含了一个或多个基因编码序列，以及与复制、表达等相关的功能序列。
质粒通常由多个功能区域组成，包括基因插入位点、选择标记、复制起点、多克隆位点等。
1.2 质粒构建方法质粒构建一般分为以下几个步骤：基因克隆、质粒挑选、连接反应、转化、筛选，这些步骤通常需要借助于PCR、限制性内切酶、DNA连接酶、转化试剂等。
1.3 质粒的应用质粒构建技术广泛应用于基因工程、蛋白质表达、基因敲除、基因组编辑等领域。
通过构建特定功能的质粒，可以实现对基因的操控和调控，对生物学功能进行研究。
二、质粒构建的方法与步骤2.1 基因克隆质粒构建的第一步通常是通过PCR扩增目的基因，得到目的基因片段。
基因片段的选择根据实验需要，可以是全长基因、部分序列、突变体等。
2.2 质粒挑选选择合适的质粒载体是质粒构建的关键一步。
通常质粒载体的选择考虑到基因插入位点、复制起点、选择标记等功能。
常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pET等。
2.3 连接反应将基因片段与质粒载体进行连接反应，通常需要利用DNA连接酶将两者连接起来。
连接反应后，通过热激酶等方法将连接产物转化到大肠杆菌等宿主细胞中。
2.4 转化转化是将连接后的质粒DNA导入到宿主细胞中的过程，通常采用化学转化、电穿孔转化、热激等方法进行。
2.5 筛选通过选择标记或多克隆位点等方法对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目的质粒的阳性克隆。
通常可以利用抗生素抗性筛选、荧光报告基因筛选等方法。
三、质粒构建的应用3.1 基因工程质粒构建技术可以用于将外源基因导入到宿主细胞中，实现基因的操控和表达。
通过构建携带感兴趣基因的质粒，可以实现对基因编码蛋白质的表达和研究。
3.2 蛋白质表达利用质粒携带外源基因序列，在宿主细胞中进行蛋白质表达。
通过构建携带目的基因的质粒，可以实现对特定蛋白质的大量表达和纯化。
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构建点突变质粒步骤
一、引言
本文旨在介绍构建点突变质粒的具体步骤。
点突变是指在DNA的序列中改变单个碱基，通常用于研究蛋白质结构和功能。
点突变可以通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术实现。
二、材料和方法
2.1 PCR扩增
PCR（聚合酶链式反应）是指在高温下使DNA变性，然后利用Taq聚合酶进行DNA扩增。
PCR扩增需要设计两个引物，引物的长度一般为20-30bp，引物的浓度一般为0.1uM。
PCR扩增的反应条件如下：94℃变性2min→94℃ 30s→58-65℃ 30s→72℃ 1min/kb（循环30-35次）→72℃5min停止反应。
PCR扩增的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。
2.2 DNA纯化
将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。
将样品加入吸附柱，再加入洗涤缓冲液将杂质洗掉，最后加入洗脱缓冲液使DNA从柱子中洗脱出来。
2.3 定向克隆
定向克隆是指利用限制性内切酶切割DNA，然后进行质粒载体的克隆。
先将PCR产物与质粒载体酶切后连接，然后转化到大肠杆菌中，通过筛选获得阳性克隆子。
在定向克隆的过程中需要注意引物的合成和酶切位点的选择，以保证克隆效率和准确性。
2.4 测序
测序是指对克隆子的DNA序列进行测定和分析。
将克隆子的DNA片段进行扩增和纯化后送到生物技术公司进行二代测序，得到测序结果后进行序列比对和分析。
三、结论
通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术，可以实现构建点突变质粒的目的。
本文介绍了具体的步骤和注意事项，希望能够对相关科研工作者提供一定的参考。