感染性克隆突变体构建流程卡1
基因克隆重组体构建、筛选与鉴定
基因克隆重组体构建、筛选与鉴定无论化学合成还是PCR扩增获得的目的基因要想导入宿主细胞克隆，进行后续功能的研究，必须与载体片段进行重组体构建。
目前，目的片段与载体连接主要有几个途径，一条途径是T 载体连接，另一条途径是酶切连接重组，还有一条途径是应用Gateway 技术进行重组。
利用Taq 聚合酶扩增目的基因往往会在每条链的3′端加上一个突出的碱基A，或者扩增后加上A 碱基。
T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3′端带有一个突出的T碱基，在连接酶的作用下，就可以通过AT 配对形成含有目的片段的克隆重组体。
构建到T 载体上的目的基因经鉴定后，为了后续功能研究，一般要通过酶切连接构建到表达载体上。
用于基因克隆的载体具有一段集中存在的单一限制性酶切位点，可以供目的基因插入使用。
而目的基因在获得的同时，一般人为地在基因序列两端也加入了相对应的酶切位点，利用相应的限制性内切酶，可以把环形质粒和目的基因切成带有相同黏性末端或平末端的DNA 片段。
酶切产物经纯化回收获得目的片段，在连接酶的作用下，对应的末端会通过碱基配对形成重组体。
酶切连接重组过程中，若载体和目的基因使用的是一种相同的限制性内切酶，就是一种单酶切的连接方式，在连接的重组体中，目的基因有正向连接和反向连接两种插入方式；如果载体和质粒都是采用两种相同的限制性内切酶切割（不全产生平末端），则目的基因酶切片段的两端就会分别与载体酶切末端互补连接，目的基因只能以一种特定的方向插入载体分子。
在酶切连接重组前，就要根据载体的多克隆位点序列设计目的基因序列两端的酶切位点，且一定要避免目的基因内部不能存在相同的酶切位点。
Gateway 重组技术是在离体条件下产生重组DNA 分子的新方法，其基础是在重组酶λ整合酶催化的位点特异性重组反应，该方法具有位点特异性特征。
在构建过程中，可以不依赖限制性内切酶，在重组酶的作用下可以高效、快速地将目的基因克隆到载体的特定重组位点。
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序
基因克隆的顺序通常包括以下步骤：
1. 选择目标基因：确定需要克隆的基因，可以是某个特定的基因，也可以是一段DNA序列。
2. 提取DNA：从源生物体中提取目标基因的DNA，通常使用DNA提取试剂盒来提取。
3. 制备质粒：选择一个适当的质粒，将其准备好作为目标基因的载体。
质粒通常是一段环状的DNA分子，可以自复制并在细胞中稳定存在。
4. 执行DNA切割：使用限制性内切酶将目标基因和质粒切割成相应的DNA片段。
内切酶是能够识别特定DNA序列并在其特定的位置进行切割的酶。
5. 连接DNA片段：将目标基因的DNA片段与质粒的DNA片段连接起来。
这可以通过DNA连接酶来实现，DNA连接酶能够催化两个DNA片段的连接。
6. 转化宿主细胞：将连接好的质粒转化到宿主细胞中，通常使用细菌作为宿主细胞。
转化可以通过电穿孔、化学方法或热激转化等方式进行。
7. 筛选重组细胞：利用筛选性培养基或标记基因等方法筛选出含有重组质粒的
细胞。
8. 纯化重组质粒：从筛选出的重组细胞中提取重组质粒。
9. 分析重组质粒：对提取出的重组质粒进行测序、限制性酶切等分析，确认克隆基因的准确性。
10. 表达目标基因：如果希望表达克隆的基因，可以将重组质粒转化到表达宿主细胞中，例如真核细胞或类似细胞。
需要注意的是，基因克隆的具体步骤可能会因实验目的、实验方法和克隆体的复杂性而有所不同。
突变体构建
突变体构建1。
定点突变:快速，高效，简便设计原理：引物与模板链退火，pfu DNA聚合酶合成突变链.DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板(甲基化质粒模板）设计引物：引物包含5’端重叠区和3'端延伸区.引物长度:除突变点之外，两条引物的长度大约为30个核苷酸,5’端重叠区包含15—20个碱基,3’端延伸区包含至少10个碱基.突变引物：突变点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。
退火温度的计算不包括突变碱基.如图:5’ 3' 3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G延伸区重叠区2。
嵌合型突变体的构建：将一个基因与另一个基因,互换构建嵌合型突变变体，可以通过overlapping PCR的方法获得。
●原理:比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B.A的序列为5—atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc—3,B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3.●首先我们要设计引物,假设引物的序列为：A1：5-atgcatgctagctagaacgct—3A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt—3B1:5—acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc—3B2:5-cgttttaaaaaattatcccct—3（设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列.）●步骤：(1）以A1，A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因(2)回收A，B基因(3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物,扩增A+B,这样我们就利用重组PCR 的方法将A+B拼接起来了。
克隆基因的操作流程
克隆基因的操作流程
克隆基因是一种基因工程技术，它可以将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中。
克隆基因的操作流程包括以下几个步骤：
1. 选择目标基因：首先需要确定感兴趣的基因，这个基因可以是任何生物体中的基因，如人类、动物、植物等，也可以是一种人工设计的基因。
2. 剪切DNA：通过限制性内切酶，将目标基因从DNA分子中切割出来。
这些切割出来的DNA片段被称为限制性内切片段。
3. 连接载体：将目标基因插入到载体DNA中。
载体是一种DNA 分子，可以承载基因并将其引入到目标生物体中。
在这个步骤中，需要使用一种酶来将目标基因和载体DNA连接起来。
这个过程被称为“重组”。
4. 转化宿主细胞：将重组后的载体DNA转化到宿主细胞中，使宿主细胞能够表达目标基因。
5. 筛选：筛选出表达目标基因的宿主细胞。
这个步骤可以通过一些特定的实验方法来实现，如PCR、Southern blotting等。
6. 验证：验证目标基因是否被正确地插入到宿主细胞中，并且是否表达出来。
通过这些步骤，就可以成功地克隆基因了。
克隆基因技术在医学、农业、工业等领域中有着广泛的应用，可以用来生产新药、改良农作物品种、生产高效酶等。
构建点突变质粒步骤
构建点突变质粒步骤
一、引言
本文旨在介绍构建点突变质粒的具体步骤。
点突变是指在DNA的序列中改变单个碱基，通常用于研究蛋白质结构和功能。
点突变可以通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术实现。
二、材料和方法
2.1 PCR扩增
PCR（聚合酶链式反应）是指在高温下使DNA变性，然后利用Taq聚合酶进行DNA扩增。
PCR扩增需要设计两个引物，引物的长度一般为20-30bp，引物的浓度一般为0.1uM。
PCR扩增的反应条件如下：94℃变性2min→94℃ 30s→58-65℃ 30s→72℃ 1min/kb（循环30-35次）→72℃5min停止反应。
PCR扩增的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。
2.2 DNA纯化
将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。
将样品加入吸附柱，再加入洗涤缓冲液将杂质洗掉，最后加入洗脱缓冲液使DNA从柱子中洗脱出来。
2.3 定向克隆
定向克隆是指利用限制性内切酶切割DNA，然后进行质粒载体的克隆。
先将PCR产物与质粒载体酶切后连接，然后转化到大肠杆菌中，通过筛选获得阳性克隆子。
在定向克隆的过程中需要注意引物的合成和酶切位点的选择，以保证克隆效率和准确性。
2.4 测序
测序是指对克隆子的DNA序列进行测定和分析。
将克隆子的DNA片段进行扩增和纯化后送到生物技术公司进行二代测序，得到测序结果后进行序列比对和分析。
三、结论
通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术，可以实现构建点突变质粒的目的。
本文介绍了具体的步骤和注意事项，希望能够对相关科研工作者提供一定的参考。
分子克隆之载体构建完整步骤
分子克隆之载体构建完整步骤一、目的片段的扩增和酶切PCR反应的基本成分包括：模板DNA(逆转录所得cDNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液及水。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在。
准备：A.模板DNA：质粒DNA，逆转录cDNA或挑菌落B.引物配制：a)存储液100uM：公司合成的引物干粉，13000rpm离心2min，加入管壁nmol数x10ul的ddH2O振荡充分溶解。
b)工作液10uM：上下游引物存储液各10ul加80ul ddH2O混匀配制100ul工作液。
终浓度200-400nM。
1. PCR反应体系(50ul)Taq酶体系：Thermo10x buffer （无Mg2+）5ulMgCl2（25mM）5uldNTP （10mM）1ul上下游引物工作液1ul模板cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ulTaq DNA聚合酶0.5ulddH2O 补充至50 ul注：1. 其他体系如菌落PCR反应20ul按比例调整即可。
2. 其他公司Taq酶或2x buffer mix已包含Taq酶、dNTPs时作相应调整。
PCR仪设置反应条件：95℃ 5min 预变性循环x30-35：变性95℃ 30s退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-3~5℃）延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：Taq酶效率约1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸4-10℃ 保温高保真Pfu酶体系（优选）：Thermo10x buffer 5uldNTP （10mM）1ul上下游引物工作液1ul模板DNA或cDNA（质粒DNA 不超过100ng）2-4ulpfu DNA聚合酶1ulddH2O 补充至50 ulPCR仪设置反应条件：95℃ 5min 预变性循环x30：变性95℃ 30s退火60℃ 30s （退火温度为引物Tm值-5℃，特殊酶如NEB公司Phusion高保真酶需要高退火温度，参考官网）延伸72℃ 60s （延伸时间根据产物长度：pfu酶合成效率约600-1kb/min）72℃ 7 min 补充延伸4℃ 保温2. 琼脂糖凝胶电泳验证取5ul样品+1ul DNA Loading buffer（6x）混匀上样，150V恒压电泳30min，凝胶成像仪紫外观察保存电泳图片。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
项目名称+实验步骤
编号KB2016PRRSV-0201-DC
试验名称 感染性克隆突变体1
试验类型
预实验 对照试验产品研发试验替补试验 复核试验
目的意义
验证蓝耳N糖基化位点突变对抗原免疫原性的影响
研究内容 1.在pUC19-PRRSV载体上突变gene1的位点1 2.将突变好的片段双酶切，回收，连到pWSK载体上去
技术路线
人员安排
江雪梅
进度安排 pUC19-PRRSV突变体构建 2016年9月12-2016年9月14日
突变体测序，筛选 2016年9月18日-2016年9月22日
将突变体转移到pWSK载体上去 206年9月24日-2016年9月30日
试验材料
1. 质粒pUC19-PRRSV
2. 质粒pMD-19T-AP
3. 质粒pWSK-PRRSV
4. 引物F:CCggcgcgccagaaagggaaaatttataa
5. 引物R1:gactcacaCtccctatcccaaatatctcgggatgg
6. 引物F1:atagggaGtgtgagtcaagtttatgttgacatcaag
7. 引物R:gctgggaccatgccggccttaatt
8. 测序引物Fcx1：gcatgaccgatgtagtgagaacgat
9. 限制性内切酶AscⅠ、PacⅠ
10. T4连接酶
11. 大肠杆菌菌株：DH5α，BL21(DE3)
试验方法
1. 引物F、R1以质粒pUC19-PRRSV为模板，PCR扩增片段A（1126 bp）；F1、R以质粒pUC19-PRRSV
为模板，PCR扩增片段B（2411 bp）。
2. 引物F、R以片段A和片段B为模板，PCR扩增片段C（3521 bp）。
3. 用AscⅠ、PacⅠ双酶切片段C，胶回收基因片段C（3496 bp）；用AscⅠ、PacⅠ双酶切质粒
pMD-19T-AP（2702 bp+15 bp），胶回收载体片段（2702 bp）。
4. 将基因片段C（3496 bp）和载体片段（2702 bp）用T4连接酶连接，转化大肠杆菌D
H5α感
受态细胞。
5. 提取质粒与质粒pUC19-PRRSV比较大小（一样大），酶切鉴定后送测序，测序正确的质粒即
为重组质粒pUC19-突变体1。
6.
用AscⅠ、PacⅠ双酶切质粒pUC19-突变体1（3496 bp+2702 bp），胶回收3496 bp片段；用
AscⅠ、PacⅠ双酶切质粒pWSK-PRRSV（约5500 bp+3496 bp），胶回收约5500 bp片段。
7. 将3496 bp片段和约5500 bp片段用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
8. 筛选重组子，重组质粒即为感染性克隆突变体1。
结果汇总分析
结果复核检验
样品保存
样品编号 保存条件和数量
样品保存人 保存位置和日期
样品理论保存时间 样品详细备案
执行人/日期 复核人/日期
执行人/日期 复核人/日期
执行人/日期 复核人/日期
制卡人 发卡人
接卡人 执行人
收卡人 归档人
注：制卡人指方案制定人员；发卡人指对该流程卡终审确认签字人，两人签字有效；接卡人指项目主管或
助管；执行人指参与实验操作的人员；收卡人必须是部门主管或助管和发卡人共同签字；归档人由学术委
员会常务委员任命二人共同负责签字。
大项目命名原则：公司名称+时间+项目+发卡人（接卡人）名字首字母简称
如：KB2016PRRSV-DZS
子项目命名原则：公司名称+时间+项目+子项目代码+发卡人（接卡人）名字首字母简称
如：KB2016PRRSV-01-DZS
流程卡编号原则：公司名称+时间+项目+子项目代码+子项目中试验步骤+发卡人（接卡人）
名字首字母简称，如：KB2016PRRSV-0101-DZS
子项目代码需由方案初审通过后经统筹中心备案领取。