分子克隆方法之同源克隆方法(20160115)
+
目的载体线性化（PCR 或酶切）及纯化
同源反应 目的质粒
转化
单片段克隆原理图一
cDNA 5’ CDS区域 AAA… 3’ PCR获取包含目的基因CDS序列的片段 目的基因片段
质粒
与基因互补序列 （18-27bp） 正向引物(实线)
目的基因片段 5’ 3’ 反向引物(实线)
3’
5’
质粒同源序列 （15-20bp）
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μLቤተ መጻሕፍቲ ባይዱTotal 50μL
*建议模版量小于10ng (尤其是模板为含目的基因片段的质粒)
已有质粒改造 之 突变
质粒突变流程图
以质粒为模版用包含同源序列的 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化
同源反应
目的质粒
转化
质粒突变原理图一
引物（实线） 需突变区域（渐变色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线性化示意图
质粒突变原理图二
第三轮及之后PCR示意图
同源反应示意图
已有质粒改造 之 插入片段
质粒插入片段流程图
以质粒为模版用包含同源序列的 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化
同源反应
目的质粒 转化
质粒插入片段原理图一
引物（实线） 需插入区域（渐变色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线性化示意图
质粒插入片段原理图二
第三轮及之后PCR示意图
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
目的质粒
转化
质粒片段缺失原理图一
引物（实线） 需缺失区域（紫色）
第一轮PCR示意图
第二轮PCR示意图
第二轮PCR线性化示意图
质粒片段缺失原理图二
第三轮及之后PCR示意图
同源反应示意图
目的质粒
第三轮及之后PCR线性化示意图
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
+
目的载体线 性化（PCR 或酶切）及 纯化 线性化载体
5’ 3’
3’ 5’
同源反应
目的质粒
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
质粒同源序列
5’ 3’
PCR扩增出含质粒同源序列的目的基因片段
3’ 5’
单片段克隆原理图二
PCR产物纯化 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’
+
目的载体线性 化（PCR或酶 切）及纯化
线性化载体
3’--->5’外切酶活性
同源反应示意图
目的质粒
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR仪设置
98℃ 55℃ 72℃ 72℃ 12℃ 10s 5s 30s/kb 30s/kb +∞ ≤30Cycles
*建议模版量小于10ng
*扩增条带特异时无需切胶回收，可 直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至 ≤35Cycles
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
多个片段PCR 及其产物纯化
+
目的载体线 性化（PCR 或酶切）及 纯化 线性化载体
同源反应
目的质粒
多片段克隆原理图（方法二）---适用于仅多片段融合或单个位置仅一个点突变
引物设计 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 突变位点设计在同源序列内 3’ 5’
多个片段PCR 及其产物纯化
*已线性化质粒： pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neo PCDNA3.1+ pcDNA6myc-His_A pDsRed-Monomer-C1 pEGFP-N1 pGEX-6P-1 …
从头合成质粒 之 多片段克隆
多片段克隆流程图
从cDNA PCR获取包含目的片段1
含目的片段1的质粒
用包含同源序列的引物做PCR 扩增出含同源序列的片段1
*同源反应产物可保存于-20℃
同源反应体系(简便版)
5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total 2 μl 7μl 1 μl 10μl
已有质粒改造 之 缺失片段
质粒片段缺失流程图
以质粒为模版用包含同源序列的 引物做PCR，扩增得到线性质粒
PCR产物纯化
同源反应
ddH2O 5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total Up to 10 μl 2 μl 25～200 ng 1 μl 10μl
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*建议模版量小于10ng
*扩增条带特异时无需切胶回收，可 直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至 ≤35Cycles
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
ddH2O 5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total Up to 10 μl 2 μl 25～200 ng 1 μl 10μl
同源反应示意图
目的质粒
第三轮及之后PCR线性化示意图
PCR反应体系(以Takara PrimeSTAR为例)
PCR反应体系(Takara PrimeSTAR)
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
片段1 PCR产物 纯化
+
片段2 PCR产物 纯化
+
片段3 PCR产物 纯化
+… +
目的载体线性化 （PCR或酶切） 及纯化
同源反应 目的质粒
转化
多片段克隆原理图（方法一）---更适用于单个位置突变数较多
引物设计 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 突变位点设计在同源序列内 3’ 5’ 3’ 5’
ddH2O 5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total Up to 10 μl 2 μl 25～200 ng 1 μl 10μl
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
多片段克隆同源反应体系（标准版） ddH2O 5×CE MultiS Buffer 线性化克隆载体 插入片段扩增产物1 插入片段扩增产物2 插入片段扩增产物3 …… Exnase® MultiS Total Up to 10 μl 2 μl [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) [0.01 × 片段碱基对数] ng (0.15 pmol) 1 μl 10μl
PrimeSTAR Max Premix（2×） 25μL Primer 1 1μL Primer 2 1μL ddH2O 22.5μL Template 0.5μL Total 50μL
PCR仪设置
98℃ 55℃ 72℃ 72℃ 12℃ 10s 5s 30s/kb 30s/kb +∞ ≤30Cycles
*同源反应37℃ 30min，后置于冰上 5min
*同源反应产物全部用于转化 100μL感受态细菌 (慢病毒载体需要用Stbl3感受态)
*同源反应产物可保存于-20℃
同源反应体系(简便版)
5×CE II Buffer PCR所得线性化质粒 Exnase® II Total 2 μl 7μl 1 μl 10μl
PCR仪设置
98℃ 55℃ 72℃ 72℃ 12℃ 10s 5s 30s/kb 30s/kb +∞ ≤30Cycles
*建议模版量小于10ng
*扩增条带特异时无需切胶回收，可 直接用DNA纯化试剂盒纯化 *扩增效率不佳时，可延长至 ≤35Cycles
同源反应体系（Vazyme产品）
同源反应体系(标准版)
分子克隆之同源克隆方法
第一部分---从头合成质粒
单片段克隆 多片段克隆
第二部分---已有质粒改造
突变 缺失 插入
从头合成质粒 之 单片段克隆
单片段克隆流程图
从cDNA做PCR获取包含目 的基因CDS序列的片段
含目的基因片段的质粒
用含有质粒同源序列的引物做PCR扩增 出含质粒同源序列的目的基因片段 PCR产物纯化
PCR仪设置 98℃ 10s 55℃ 5s 30-35Cycles 72℃ 30s/kb 72℃ 30s/kb 12℃ +∞ *扩增条带特异时无需切胶回收， 可直接用DNA纯化试剂盒纯化
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介1.分子克隆技术的定义2.分子克隆技术的发展历程二、分子克隆技术的原理1.基本原理2.克隆过程详解三、分子克隆技术的应用1.基因工程2.生物制药3.基因诊断4.转基因技术四、分子克隆技术的操作步骤1.设计引物2.PCR扩增3.酶切鉴定4.连接转化5.筛选重组子6.鉴定克隆子五、分子克隆技术的注意事项1.实验操作规范2.试剂选择与储存3.防止污染4.优化实验条件六、分子克隆技术的发展趋势1.高效自动化设备2.单细胞克隆技术3.基因编辑技术4.个性化医疗正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，主要用于复制特定DNA序列。
该技术在我国科研领域得到了广泛的应用，为基因研究、生物制药、转基因技术等领域提供了重要的技术支持。
自20世纪70年代以来，分子克隆技术不断发展，为生命科学研究带来了革命性的变革。
二、分子克隆技术的原理分子克隆技术的基本原理是将目标DNA片段通过PCR扩增，然后利用限制性内切酶切割得到特定片段，将这些片段连接到载体DNA上，最后将连接产物转化到受体细胞中。
在转化过程中，载体DNA与受体细胞的染色体DNA 结合，实现目标基因的复制和表达。
克隆过程详解：首先，设计一对特异性引物，使目标DNA片段在PCR扩增过程中产生特定的扩增子。
接下来，通过PCR扩增得到目的基因。
然后，利用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，得到具有粘性末端的目的基因片段。
将目的基因片段与载体DNA连接，形成重组载体。
最后，将重组载体转化到受体细胞中，实现基因的克隆。
三、分子克隆技术的应用1.基因工程：分子克隆技术为基因工程提供了重要的技术支持，使得科学家可以对基因进行改造、编辑，进而创造新的生物品种和药物。
2.生物制药：分子克隆技术在生物制药领域具有广泛应用，如制备抗体、细胞因子、酶等生物制品。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以快速、准确地检测特定基因序列，为遗传病诊断提供依据。
利用同源序列法克隆基因的基本步骤
利用同源序列法克隆基因的基本步骤一、概述基因克隆是现代生物学研究中的重要技术手段之一，其主要目的是在体外构建包含目标基因的DNA分子。
同源序列法是一种常用的基因克隆方法，通过在一个已知基因的上下游区域找到相同的DNA序列，然后利用PCR或限制酶技术将目标基因从细胞中扩增、截取并插入到适当的质粒载体中。
本文将介绍利用同源序列法克隆基因的基本步骤。
二、材料与设备准备1. 目标基因的DNA序列- 确定目标基因的DNA序列，并设计引物2. PCR试剂盒3. DNA酶- 包括限制酶和连接酶4. DNA纯化试剂盒5. DNA电泳仪器6. 质粒载体及相关试剂7. 载体宿主细胞三、PCR扩增目标基因1. 初始步骤- 设计适当的引物，确保引物的序列与目标基因的同源序列相匹配 - 准备PCR试剂盒和PCR仪器2. PCR扩增- 按照试剂盒说明书的操作步骤，进行PCR扩增反应- 调节PCR反应条件，使扩增得到高特异性和高产量的目标DNA片段四、DNA片段纯化1. 提取PCR产物- 使用DNA纯化试剂盒，将PCR产物从反应混合物中纯化出来2. 纯化后的DNA片段检测- 使用DNA电泳仪器，检测纯化后的DNA片段是否符合预期大小五、限制酶切与质粒载体处理1. 限制酶切- 根据预先设计好的限制酶切位点，对目标基因DNA片段和质粒载体进行限制酶切2. 质粒载体处理- 在限制酶切反应后，使用连接酶将目标基因DNA片段连接到质粒载体上六、DNA片段转化与宿主细胞处理1. DNA片段转化- 将连接好的质粒载体转化到适当的宿主细胞中2. 宿主细胞处理- 处理转化后的宿主细胞，筛选带有目标基因的正反应克隆子七、目标基因测序确认1. 选取克隆子- 从宿主细胞中分离带有目标基因的正反应克隆子2. 目标基因测序- 对克隆子进行测序确认，确保目标基因的序列正确无误八、结语利用同源序列法克隆基因是一项关键而复杂的实验技术，需要准备充分的材料与设备，严格按照步骤进行操作。
同源克隆过程简介
同源克隆简介一、材料准备和冷诱导 (2)二、RNA提取和反转录 (2)三、PCR扩增基因中间片段和回收 (2)四、体外连接和转化 (3)五、菌落筛选和测序 (3)六、序列分析和race引物设计 (3)七、race法获取基因的3’和5’末端 (4)八、基因全长拼接和生物信息学分析 (4)同源克隆简介一、材料准备和冷诱导1.材料培养2.材料冷诱导二、RNA提取和反转录1. RNA提取准备(参考文件夹RNA提取相关知识)2. RNA提取过程(参考文件夹RNA提取过程)3.RNA反转录为cDNAa) RNA 5ul/8ul体系 oligodT 1ul15ul RNaseFree-ddH2O 补足15ulb)70℃ For 5 minc)冰预 For 5 mind)加入 5×buffer 5uldNTP 1.25ul体系 RRI 1ulM-MLVR 1ulRNaseFree-ddH2O 1.75ule)42℃ For 1h三、PCR扩增基因中间片段和回收1.同源引物设计理解如何进行设计，并学着去同源引物设计（参考生物信息学材料）2.PCR体系(25ul)cDNA模板 2.5ulddH2O 17.2ulBuffer 2.5ulTaq酶 0.4uldNTP 0.4ul引物上下游各1ul,共2ul（参考抗寒基因引物文件夹）3.反应程序1)94℃ for 5min2)94℃ for 30s3)45℃-58℃ for 45s4)72℃ for 1min5)Go to 2 , 5 times6)94℃ for 30s 7)55℃ for 45s8)72℃ for 1min9)Go to 6, 30times10)72℃ for 10min11)16℃ for ever12)end其中反应体系和程序可根据实际情况进行改变，注意理解每一步的原由。
4.电泳检测理解琼脂糖凝胶电泳全过程及相关注意事项（查阅资料）5.切胶回收参考DP209--离心柱型--普通D（pdf文件）四、体外连接和转化1.体外连接参考pGM-T克隆试剂盒2.转化1)准备工作a LB培养基配制b 感受态细胞制备2)转化过程参考pGM-T克隆试剂盒五、菌落筛选和测序1．利用а互补作用进行蓝白斑筛选，从转化的平板中挑去白斑画线扩大培养；2．选择画的好的线，进行菌落PCR，过程同普通PCR ,只是把原来的模板换作ddH2O；3．选择PCR出条带的线条进行摇菌，送公司进行测序。
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
同源重组法分子克隆 -回复
同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。
同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。
本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。
一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。
同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。
同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。
同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。
两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。
接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。
1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。
一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。
2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。
需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。
3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。
4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。
5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。
6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。
7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。
同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术的概念与原理二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因2.构建基因表达载体3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与表达三、分子克隆技术在科研和生产中的应用四、分子克隆技术的发展趋势正文：一、分子克隆技术的概念与原理分子克隆技术是指在体外将各种来源的遗传物质——DNA 片段，与适当的载体DNA 相结合，然后导入受体细胞，使这些DNA 片段在受体细胞内复制、表达的操作技术。
分子克隆技术的原理主要基于重组DNA 技术，通过切割、连接、导入等步骤，实现外源基因与载体DNA 的重组，从而形成一个新的基因表达载体，最终达到在受体细胞中表达目的基因的目的。
二、分子克隆技术的操作步骤1.提取目的基因提取目的基因是分子克隆技术的第一步，通常采用PCR 扩增或化学合成的方法获取目的基因。
PCR 扩增是一种常见的方法，通过设计特定的引物，从基因组DNA 中扩增出目的基因。
化学合成则是根据目的基因的序列，通过化学合成方法直接合成目的基因。
2.构建基因表达载体构建基因表达载体是分子克隆技术的核心步骤，主要包括以下几个方面：（1）选择合适的载体：常用的载体有大肠杆菌的质粒等，根据实验目的和受体细胞的类型选择合适的载体。
（2）切割载体：使用限制性内切酶切割载体，暴露出载体的粘性末端，便于与目的基因连接。
（3）连接目的基因：将提取到的目的基因与切割后的载体DNA 片段通过DNA 连接酶连接，形成重组载体。
（4）转化受体细胞：将重组载体导入受体细胞，使目的基因在受体细胞内表达。
3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是分子克隆技术的关键步骤，根据受体细胞的类型选择不同的导入方法。
常用的方法有转化、转染、显微注射等。
4.目的基因的检测与表达在将目的基因导入受体细胞后，需要对目的基因进行检测和表达。
检测方法包括PCR、Western blot、南方杂交等，表达方法包括实时荧光定量PCR、Western blot、酶联免疫吸附试验等。
同源克隆法原理和方法
同源克隆法原理和方法同源克隆法呀，那可是个很有趣的东西呢。
同源克隆法的原理就像是找失散多年的亲人一样。
它基于基因的同源性，也就是相似性啦。
如果把基因比作一群有着家族特征的人，那些有着高度相似序列的基因就像是近亲。
我们可以根据已知的基因序列信息，在其他生物或者同一生物的不同组织里找到相似的基因。
这就像是凭借着家族的一个特征去找到其他有同样特征的家族成员。
那它的方法呢？首先得有一个已知的基因片段或者序列，这就像是我们有了一个家族成员的线索。
然后提取目标生物的基因组DNA，这基因组DNA就像是一个装满各种宝藏信息的大盒子。
接着利用设计好的引物，引物呢就像是一把精准的钥匙，只能打开特定的基因锁。
通过PCR技术来扩增可能存在的同源基因。
这个过程就像是一场寻宝游戏，我们拿着钥匙在大盒子里寻找我们想要的宝贝。
在这个过程中呀，要注意引物设计一定要准确，可不能马虎，就像你要去参加一场很重要的比赛，准备工作得做足了。
同源克隆法的安全性嘛，哎呀，那还挺不错的呢。
因为它主要是在基因层面操作，只要遵循实验室的规范操作，就像我们遵守交通规则一样，不会有太大的危险。
不会突然像个调皮的小鬼一样搞出什么大麻烦。
它的稳定性也比较可观，只要实验条件合适，就像植物在适宜的环境里生长一样，结果是比较可靠的。
它的应用场景可多啦。
在植物育种方面，就像是给植物做一场基因升级。
比如说，想要提高作物的抗病虫害能力，就可以用同源克隆法找到抗病虫害相关的基因，然后把它转到作物里。
这就好比给作物穿上了一层坚固的铠甲。
优势也很明显呀，它相对比较简单直接，不需要特别复杂的设备和技术，这难道不棒吗？这就像你不需要开着豪车也能到达目的地一样。
给你说个实际案例吧。
在水稻育种中，科学家想要提高水稻对盐碱地的耐受性。
他们就利用同源克隆法找到了一些在耐盐碱植物里存在的同源基因，然后把这些基因转到水稻里。
哇塞，结果水稻真的就像个坚强的战士一样，在盐碱地里也能茁壮成长啦。
无缝克隆,同源重组克隆
简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。
它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。
装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。
（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。
首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。
然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。
最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。
这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。
下面是组装的示意图。
材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。
如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。
4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册（实用版）目录一、引言二、分子克隆技术的概念与原理1.定义与概念2.分子克隆技术的基本原理三、分子克隆技术的操作步骤1.载体的选择与构建2.目的基因的获取与扩增3.基因片段的连接与重组4.转化与筛选5.克隆子的鉴定与分析四、分子克隆技术的应用1.在基因工程中的应用2.在蛋白质工程中的应用3.在生物制药中的应用五、分子克隆技术的发展趋势六、结论正文一、引言分子克隆技术是现代生物技术领域中的一项重要技术，它在基因工程、蛋白质工程、生物制药等领域具有广泛的应用。
本文将详细介绍分子克隆技术的概念与原理、操作步骤以及应用和发展趋势。
二、分子克隆技术的概念与原理1.定义与概念分子克隆技术是指在体外将不同来源的基因片段通过基因工程技术进行拼接组装，形成一个新的基因表达载体，并将其导入受体细胞，使目的基因在受体细胞中表达的技术。
2.分子克隆技术的基本原理分子克隆技术的基本原理主要包括以下几个方面：（1）载体的选择与构建：选择适合目的基因的载体，并将其构建为重组表达载体；（2）目的基因的获取与扩增：从原始基因中获取目的基因，并通过PCR 等方法进行扩增；（3）基因片段的连接与重组：将目的基因与载体进行连接，形成重组基因表达载体；（4）转化与筛选：将重组基因表达载体导入受体细胞，并通过筛选得到表达目的基因的克隆子；（5）克隆子的鉴定与分析：对克隆子进行鉴定与分析，以确认其是否表达目的基因。
三、分子克隆技术的操作步骤1.载体的选择与构建选择适合目的基因的载体，如质粒、噬菌体等，并将其构建为重组表达载体，主要包括载体的切割、目的基因的插入、连接以及重组表达载体的转化等步骤。
2.目的基因的获取与扩增从原始基因中获取目的基因，可以通过基因合成、PCR 等方法进行扩增，获得足够量的目的基因。
3.基因片段的连接与重组将目的基因与载体进行连接，形成重组基因表达载体。
这一步通常采用 DNA 连接酶进行催化连接，同时需要使用适当的缓冲液和试剂。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆主要技术：（1）限制性内切酶酶切与连接基因克隆也叫DNA分子克隆，即在体外重组DNA分子，而实现该技术的关键是一种被称作限制性核酸内切酶的工具酶。
每一种限制性核酸内切酶可以识别DNA分子上特定的碱基序列，切断DNA分子。
依据碱基互补的原理，在DNA连接酶的作用下可以把切开的DNA片段连接起来，因此可以把目的片段连接到合适的载体上形成重组子。
（2）转化与转染作为表达载体，必须具有复制起始序列、多克隆位点及选择标记，可以在宿主细胞中进行自我复制或整合到宿主基因组中进行复制。
作为宿主的工程菌或细胞在某些化学条件或物理刺激下会改变其细胞膜的通透性，从而易于将细胞表面附着的外源基因吸收到胞内，这一过程即转化（工程菌）或转染（细胞）。
利用选择标记可以很容易鉴别成功导入目的基因的工程菌或细胞，比如抗生素抗性筛选—凡是成功导入重组载体的工程菌或细胞均获得某种抗生素抗性，而未导入的工程菌或细胞则不能在含该抗生素的培养基中生长。
（3）聚合酶链式反应聚合酶链式反应，即PCR。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火-- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94 C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C（具体退火温度根据引物的Tm值确定）左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。