无缝克隆,同源重组克隆 (1)
无缝克隆说明书+原理+实例
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。
二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。
一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法[发明专利]
![一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f8e69c02b80d6c85ec3a87c24028915f814d847a.png)
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510507988.5(22)申请日 2015.08.18C12N 9/12(2006.01)C12N 15/63(2006.01)(71)申请人翌圣生物科技（上海）有限公司地址201203 上海市浦东新区张江高新科技园区蔡伦路781号504室(72)发明人方筱玉(74)专利代理机构上海旭诚知识产权代理有限公司 31220代理人郑立(54)发明名称一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法(57)摘要本发明涉及一种重组酶复合物，该重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec 同源重组酶，包括RecE、RecT 和Gamma 蛋白。
本发明还提供了一种体外同源重组无缝克隆的方法，只需将两端带有载体末端序列的PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在该重组酶复合物的催化下，高效率地将目标DNA 定向克隆到任意载体的任意位点，克隆阳性率可高达95％以上。
本发明的方法尤其适用于DNA 大片段的克隆。
本发明弥补了传统克隆方法操作繁琐、费时、失败率较高等缺陷，可以为DNA体外重组提供一种快速便捷高效的克隆方法，在细胞学基础研究和工农业生产、医药保健等方面奠定重要的基础。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页序列表3页 附图1页CN 105087517 A 2015.11.25C N 105087517A1.一种重组酶复合物，其特征在于，所述重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，所述重组酶复合物包括RecE、RecT和Gamma蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组酶复合物，其特征在于，所述RecE、所述RecT和所述Gamma蛋白三种重组酶的含量比例为1:1:2。
3.一种体外同源重组无缝克隆的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一：制备线性化克隆载体；步骤二：制备插入片段PCR产物，通过在引物5’端引入所述线性化克隆载体的末端同源序列，使得所述插入片段PCR产物的5’端和3’端分别带有和所述线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列；步骤三：将步骤一中获得的所述线性化克隆载体与步骤二中获得的所述插入片段PCR 产物在如权利要求1或2所述的重组酶复合物的作用下进行重组反应；步骤四：将步骤三中获得的重组产物进行细胞转化，获得转化细胞；步骤五：将步骤四中获得的所述转化细胞进行培养，并进行克隆鉴定，得到经所述克隆鉴定为阳性的重组DNA分子。
无缝克隆同源重组克隆
1.1.1Gibson assembly简介INTRODUCTION原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法;它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA;装配原理基于DNA片段间的重叠区域,过程依赖于三种酶：DNA 外切酶T5 exonuclease, 高保真DNA聚合酶;Phusion polymerase和耐热DNA连接酶Taq DNA ligase的共同作用;首先,T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分,由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补,所以DNA片段退火,互补的序列重新配对连接;然后,在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板,沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上,填补缺口;最后,连接酶将两条DNA 单链黏合起来,密封裂缝;这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了;下面是组装的示意图;材料MATERIALS❒试剂REAGENTSNAD,H2O ,1 M MgCl2,1 M DTT,10 mM dNTP mix,1 M Tris-HCl pH ,50% PEG-8000, mg/ mL Tag ligase, μg/ mL T5_ExO,Phusion1×、LB培养基、抗生素据载体而定、LB平板相应抗性❒实验前准备SETUP于冰水浴中配制如下反应体系;如果不慎将液体粘在管壁,可通过短暂离心使其沉入管底;4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到mL,每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mLmg/ mL Tag ligase 10 μLμg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion1×25 μL4× . buffer 500 μL加水365 μL,存于-20°C冰箱,有效期1年;实验步骤PROCEDURE1.设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段,NEB推荐同源片段的长度为15-40 bp,同时要求这部分对应的退火温度高于4°C;2.进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳,胶回收;或者PCR产物回收试剂盒回收;3.进行重组反应,以20 μL反应体系为例：组分加入量Isothermal assembly Master Mix 10 μL线性化载体10-100 ng 1-2 μL插入片段8-9 μL 3-5×载体Sterilized ddH2O 补足至20 μL50°C反应15-60 min4.反应产物转化、涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法;针对性建议1.在选择克隆位点时,应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域;当克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时,重组效率将达到最大;如这部分区域GC 含量高于70%或者低于30%,重组效率会受到较大影响;2.Gibson组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200 bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性末端形成稳定的二级结构,如发夹结构或者茎环结构,那么成功率会大受影响;。
无缝克隆同源重组克隆
Gibson assembly简介（INTRODUCTION）原理： Gibson assembly 是一种 one step, one pot 的迅速基因组装方法。
它只要要将基因片段和需要的三种酶混淆在同一个管内在50°C 下培育 15-60 min 就能够获得组装好的DNA 。
装置原理鉴于DNA 片段间的重叠地区，过程依靠于三种酶：DNA外切酶（T5 exonuclease）,高保真 DNA 聚合酶。
（ Phusion polymerase ）和耐热 DNA连结酶（ Taq DNA ligase ）的共同作用。
第一， T5 核酸外切酶消化DNA 片段的链方向是从 5’到 3’. 每个 DNA 片段分别形成一个单链的突出部分，因为着这两个相邻的突出片段有一部分拥有同源性能够互补，因此 DNA 片段退火，互补的序列从头配对连结。
而后，在空缺的部分 DNA 聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿 3'方向将对应的脱氧核苷酸连结到单链上，填充缺口。
最后，连结酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂痕。
这样拥有重叠地区的DNA 片段就组装成一整条DNA 分子了。
下边是组装的表示图。
资料（MATERIALS）试剂（ REAGENTS ）NAD ，H2 O ，1 M MgCl 2，1 M DTT ，10 mM dNTP mix ，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85μ g/ mL T5_ExO，Phusion(1培育基、抗生素（据载体而定）、)×、LBLB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP ）于冰水浴中配制以下反响系统。
假如不慎将液体粘在管壁，可通太短暂离心使其沉入管底。
4x isothermal assembly bufferNAD20 mgH2O300μL1 M MgCl 2300μL1MDTT300μL10 mM dNTP mix600μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到 7.5 mL ，每管分500 μL存于 -20 °C 或 -80 °C 冰箱 ,够 3000 个反响2×assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase10μL0.85 μ g/ mL T5_ExO100μLPhusion(1 ×)25μ L4× G.A. buffer500μL加水 365 μL，存于 -20 °C 冰箱，有效期 1 年。
无缝克隆——让载体构建更简单
让载体构建更easy，分子克隆其实可以ze么快！每个做过分子实验的人可能都会有这样的经历：在经过N次的PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？今天就给大家详解一下可以一步法快速构建同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。
无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。
突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。
我们先来将传统克隆与无缝克隆做下比较：无缝克隆相较于传统克隆的方式，优势显而易见，，主要体现以下几点：1、可以不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作；2、可同时连接多个DNA片段，最多可达10个；3、不附加任何多余序列，精确定向连接；4、体系反应时间仅需20min，快速反应。
那无缝克隆到底应该怎么做呢？下面我们就来详细了解下无缝克隆其原理：在基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增阶段，与常规PCR法是相同的。
唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。
图1：无缝克隆原理图在用无缝克隆方式进行分子克隆时，主要操作步骤分为以下3点：1、线性化目的载体（图1左上）：用酶切或是PCR方式1）质粒酶切法在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。
2）质粒PCR法如果没有合适的酶切位点，你也可以通过PCR方法实现载体的线性化。
图2.PCR法线性化载体示意图。
在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段2、PCR获取目的片段。
设计的引物５’端需要和线性化载体末端有15~25bp的重叠（图中蓝色和黄色片段）；图3：目的片段同源的引物设计针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR 引物，其重叠区域为15~25 bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。
同源重组法分子克隆 -回复
同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。
同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。
本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。
一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。
同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。
同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。
同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。
两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。
接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。
1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。
一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。
2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。
需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。
3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。
4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。
5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。
6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。
7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。
同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。
同源重组技术的原理和应用
同源重组技术的原理和应用同源重组技术（Homologous recombination technology，HRT）是一种常用的基因编辑技术，它能够在特定部位改变DNA序列，用于治疗某些遗传性疾病、研究基因表达调控和蛋白质结构等方面。
本文将介绍同源重组技术的原理和应用。
1. 同源重组技术的原理同源重组技术是利用质粒、病毒等载体携带的外源基因通过靶向指向的方式将其导入到细胞或生物体中，从而达到改变生物体基因组的目的。
具体来说，同源重组技术是基于DNA的相互作用原理进行的。
DNA由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）构成，它们之间形成了氢键，使得两条互补的DNA链可以通过这些氢键相互结合。
在同源重组中，DNA分子的另一端则通过DNA酶和锌指核酸酶来实现切割和精准定位。
一旦发现了具备相同序列的区域，这些酶就会将外源基因定向到位点，与染色体上的同源序列组成DNA双链，从而取代了原有的序列，以达到修复或替换某些基因的效果。
2. 同源重组技术的应用同源重组技术的应用广泛，其中最重要的是对基因的编辑和修复。
以下将介绍几种常见的同源重组技术应用：(1)质粒介导同源重组质粒介导同源重组是一种常用的基因工程技术。
这种技术主要是利用菌单倍体的同源重组能力，通过转化质粒来实现有选择性地在DNA的特定区域插入新基因。
这种技术特别适用于菌类以及一些单细胞真菌和原生生物。
(2)病毒介导同源重组病毒介导同源重组则运用了病毒自身的重组机制特征，对其进行了改造，使其能够以带选择性的方式在目标细胞中整合外源基因。
这种方法目前已经广泛应用于人类基因治疗领域，尤其在修复致病基因和引入新基因方面取得了显著进展。
(3)基因组编辑基因组编辑技术可以通过同源重组来治疗遗传性疾病。
比如，在用于治疗Friedreich's ataxia（FA）的基因治疗研究中，研究团队采用基因克隆技术构建了能够靶向FA基因的重组质粒，并通过同源重组的方式将其导入细胞中。
无缝克隆技术原理
无缝克隆技术原理
无缝克隆技术原理. 基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增，与常规PCR法是相同的。
. 唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。
. 通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密的连在一起而无需酶联，直接用于转化。
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中文名: 无缝克隆
外文名: Seamless Cloning/In-Fusion Cloning
特点: 依靠自身酶系将缺口修复
类型: 克隆方法。
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1.1.1Gibson assembly
简介（INTRODUCTION）
原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。
它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。
装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）, 高
保真DNA聚合酶。
（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。
首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。
然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。
最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。
这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。
下面是组装的示意图。
材料（MATERIALS）
❒试剂（REAGENTS）
NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH ，50% PEG-8000，mg/ mL Tag ligase，μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB 平板（相应抗性）
❒实验前准备（SETUP）
于冰水浴中配制如下反应体系。
如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。
4x isothermal assembly buffer
NAD 20 mg
H2O 300 μL
1 M MgCl2300 μL
1 M DTT 300 μL
10 mM dNTP mix 600 μL
1 M Tris-HCl pH 3 mL
50% PEG-8000 3 mL
加水到mL，每管分500 μL存于-20°C或-80°C冰箱,够3000个反应
2× assembly mix: best combination:
100 reaction 1 mL
mg/ mL Tag ligase 10 μL
μg/ mL T5_ExO 100 μL
Phusion(1× ) 25 μL
4× . buffer 500 μL
加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。
实验步骤（PROCEDURE）
1.设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，NEB推荐同源片段的长度为
15-40 bp，同时要求这部分对应的退火温度高于4°C。
2.进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收。
或者PCR产物回收试剂盒回收。
3.进行重组反应，以20 μL反应体系为例：
组分加入量
Isothermal assembly Master Mix 10 μL
线性化载体10-100 ng (1-2 μL)
插入片段8-9 μL (3-5×载体)
Sterilized ddH2O 补足至20 μL
50°C反应15-60 min
4.反应产物转化、涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。
针对性建议
1.在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。
当克隆位点上
下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。
如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。
2.Gibson组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200 bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性
末端形成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，那么成功率会大受影响。