载体、点突变
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。
一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。
二、反应1. 使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。
2. 反应体系：（1）10x pyrobest Buffer：5 ul（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul（7）加无菌蒸馏水至50ul.三、产物沉淀纯化1. 加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离心弃上清。
2. 70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用DpnI 酶切）。
四、DpnI酶切1. 酶切体系（1）Buffer ：2 ul（2）BSA（100x）：0.2 ul（3）DNA ：x ul（4）DpnI：0.5 ul（5）加无菌去离子水至20 ul。
2. 30℃酶切1~4 h。
3. 65℃水浴15min 终止反应。
五、转化将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。
六、测序验证注意事项1. 引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
2. Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChange®、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒、QuikChange®、XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。
蛋白质工程的定点突变
20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物指导DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
蛋白质工程的定点突变
20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。
可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。
这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。
定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。
寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。
为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。
如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物知道DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。
(图）单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。
在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。
由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。
由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。
环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。
待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。
定点诱变技术
Family gene shuffling library of chimeras
Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Fragment with DNAseI
第三章 DNA突变技术
基因突变包括单个碱基或片断的替换，基
因片断的插入与删除等。
根据其特点可将基因突变技术分两大类：
1.位点特异性突变
定点突变
2.随机突变 表型筛选
随机突变
易错PCR法(Error-prone PCR)
降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
适用于插入片段长度在 1.0kb以下的多点突变。
Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa)
X
XXX
X
Reassemble fragments
XXX
X
Select best recombinants
XXX
XX
X
XX
X
XX
X
XXX X
XXX X
XXX X
XX XXX X X X X X
XX X
X
XX X
X
XX X
X
XX X
XXXXXX NhomakorabeaXX
X
Repeat for multiple cycles
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
基因定点突变技术
寡核苷酸介导的定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 的生物化学家 ( michael smith )发明 的.
寡核苷酸定点突变基本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有目的基因 完全互补。
• 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型
子代链。 • 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突变体其中
基因已被定向修改
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取代 野生型基因中的相应序列。
• 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点，如 果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位诱变引入 限制位点。
• 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互 作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改 造启动子或者DNA作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白 的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改变PCR条件提 高PCR过程中的随机出错，这种方法适用于未知的蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 不过这种方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不会出 现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有局限性。定点突变 适用于蛋白结构已有初步了解的基因，比PCR随机突变更有目的 性，也更为精确，简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景，相信这 个技术在不远的将来还会有更大的改进和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
构建点突变质粒步骤
构建点突变质粒步骤
一、引言
本文旨在介绍构建点突变质粒的具体步骤。
点突变是指在DNA的序列中改变单个碱基，通常用于研究蛋白质结构和功能。
点突变可以通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术实现。
二、材料和方法
2.1 PCR扩增
PCR（聚合酶链式反应）是指在高温下使DNA变性，然后利用Taq聚合酶进行DNA扩增。
PCR扩增需要设计两个引物，引物的长度一般为20-30bp，引物的浓度一般为0.1uM。
PCR扩增的反应条件如下：94℃变性2min→94℃ 30s→58-65℃ 30s→72℃ 1min/kb（循环30-35次）→72℃5min停止反应。
PCR扩增的产物可以通过琼脂糖凝胶电泳分离。
2.2 DNA纯化
将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶切下，用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。
将样品加入吸附柱，再加入洗涤缓冲液将杂质洗掉，最后加入洗脱缓冲液使DNA从柱子中洗脱出来。
2.3 定向克隆
定向克隆是指利用限制性内切酶切割DNA，然后进行质粒载体的克隆。
先将PCR产物与质粒载体酶切后连接，然后转化到大肠杆菌中，通过筛选获得阳性克隆子。
在定向克隆的过程中需要注意引物的合成和酶切位点的选择，以保证克隆效率和准确性。
2.4 测序
测序是指对克隆子的DNA序列进行测定和分析。
将克隆子的DNA片段进行扩增和纯化后送到生物技术公司进行二代测序，得到测序结果后进行序列比对和分析。
三、结论
通过PCR扩增、纯化、定向克隆和测序等技术，可以实现构建点突变质粒的目的。
本文介绍了具体的步骤和注意事项，希望能够对相关科研工作者提供一定的参考。
克隆点突变系列常见问题及解决方法
克隆点突变系列常见问题及解决方法一、克隆1)、平板上长不出克隆或克隆数目很少a)、感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率>107 cfu/μg。
每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。
b)、线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：请务必预先检测线性化克隆载体和插入片段PCR产物的浓度。
常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大。
因此，我们强烈推荐您通过琼脂糖电泳来测定样品中的DNA浓度。
c)、载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化DNA加入重组反应体系内的总体积不应超过4 μl (反应体系体积1/5)。
尝试对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。
d)、感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。
e)、当载体和片段的均大于10K时，克隆效率下降，属正常情况。
f)、少数情况：插入基因本身含细胞毒性，即便有正确克隆也因为克隆细胞无法生长导致试验失败。
2)、多数克隆不含插入片段(假阳性)a)、克隆载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。
提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物，都可以有效减少甚至消除环状质粒残留。
b)、反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(扩增克隆载体或者扩增插入片段)为环状质粒。
当扩增产物直接用于重组反应时，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。
尽量使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI 消化、扩增产物进行胶回收纯化，都可以有效减少甚至消除环状模板质粒残留。
3)、克隆含有不正确的插入片段a)、PCR产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。
b)、载体线性化不完全：如果线性化载体不是由空载体酶切或扩增制备，而是由已插入其他不同片段的载体酶切或扩增制备而成，不完全酶切或残留环状模板质粒将导致很高的转化背景，使部分克隆中含有不正确的插入片段。
载体、点突变
TransGen: Easy/Fast Mutagenesis System
Easy点突变与Fast点突变的区别—— • Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶 • Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶—— 扩增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，扩增 10Kb左右的质粒只需2个小时！ （请参考《金品是怎样炼成的》）
• 筛选方法： ♣体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化 质粒的大肠杆菌（DMT）降解，而去甲基化的 扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。 ♣体外降解：DpnI识别序列5’-GmATC-3’（在 DNA序列中，一般每256bp中出现一次）。甲 基化模板可被DpnI识别、切割，而去甲基化的 扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。
• 选择质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒： 试剂品质很关键 质量不好的试剂盒很可能会抑制下游连接
• 克隆感受态细胞的选择： 基因对感受态细胞的偏好性很大， 即使是Top10也有可能遇到无法正常进行实 验的情况，因此需要我们针对自己的实验进行 适当的摸索和选择。
• 克隆感受态细胞的选择：
Top10 DH5α JM109 XL1-Blue 适用于毒基因的克隆 普遍使用 同源重组率低，提取质粒质量最好 适合非甲基化DNA的转化 （必要时可以代替DMT） 具有T1、T5噬菌体抗性， 在液体培养基中生长速y~ 3’端热力学不稳定，3’－“A”容易 脱落 直接导致TA克隆效率低 How~ PCR产物置于4℃保存1～2天内使用 不要冷冻PCR产物 PCR结束后立即使用效果最好
• 克隆胶回收片段： Why~ 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤； (受到损伤的DNA不是连接的最佳底物) 3’-“A”容易在电泳过程中被核酸外切 酶降解，导致TA连接效率低； 试剂残留的抑制。 How~ 操作中通过细节注意避免
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•
反应温度： TOPO酶的工作温度为20℃～37℃
• 反应时间[优化指南]： [优化指南]
PCR产物 PCR纯化产物 PCR产物 / PCR纯化产物 25℃ 10min 25℃ 5min 25℃ 15min 【大片段、特殊结构】 25℃ 20min 【大片段、特殊结构】 胶回收产物/ 胶回收产物/加A产物 25℃10～15min
TransGen TOPO Vector
• • • • • • • pEASY-T1 Cloning Vetor pEASY-T1 Simple Cloning Vetor pEASY-T3 Cloning Vetor pEASY-Blunt Cloning Vetor pEASY-Blunt Simple Cloning Vetor pEASY-E1 Expression Vetor pEASY-E2 Expression Vetor
TOPO克隆成功的关键
• • • • 引物设计 PCR条件 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒 克隆反应设置（DNA加入量、反应的温 度和时间） • 克隆感受态细胞的选择
•
引物设计： ♣引物不能磷酸化。 PCR注意事项： ♣后延伸设置为72℃10～20分钟； 目的： 保证扩增片段完整，可以有效降低扩增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时，该步骤相当于加A反应； ♠使用Taq系列DNA聚合酶扩增（如EasyTaq、rTaq等），请选用粘端克隆载体； ♠使用Pfu系列DNA聚合酶（如EasyPfu、Probest等）扩增，请选用平端克隆载体； ♠使用复合DNA聚合酶（如TransHiFi、LA等）扩增， 既可用粘端载体，也可用平端载体（一般推荐用粘端）。
TOPO克隆和传统T4克隆比较
TOPO克隆 无需纯化可直接用于克隆 （若无杂带和引物二聚体） 5分钟 室温范围内放置即可 T4 DNA Ligase克隆 PCR产物 反应时间 反应温度 需要纯化，否则抑制连接 过夜（12小时） 需要用仪器严格控温 载体+片段 +T4 DNA Ligase Buffer +T4 DNA Ligase （污染几率大） ～60% 费时
• 选择质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒： 试剂品质很关键 质量不好的试剂盒很可能会抑制下游连接
• 克隆感受态细胞的选择： 基因对感受态细胞的偏好性很大， 即使是Top10也有可能遇到无法正常进行实 验的情况，因此需要我们针对自己的实验进行 适当的摸索和选择。
• 克隆感受态细胞的选择：
Top10 DH5α JM109 XL1-Blue 适用于毒基因的克隆 普遍使用 同源重组率低，提取质粒质量最好 适合非甲基化DNA的转化 （必要时可以代替DMT） 具有T1、T5噬菌体抗性， 在液体培养基中生长速利用PCR实现点突变的传统方法 • QuickChange ，GeneTailor， Easy /Fast Mutagenesis System 三种市售点突变试剂盒的比较传统方法 Nhomakorabea仅利用PCR
• 反向PCR定点突变 • 重叠延伸PCR定点突变 • 大引物PCR定点突变
• QuickChange ，GeneTailor，Easy/Fast Mutagenesis System也是基于PCR原理实 现点突变，但它们与传统方法的区别主 要在于可以对突变克隆进行初步的筛选 • 筛选原理：降解甲基化质粒模板 • 筛选依据： 来自大肠杆菌的质粒99%发生甲基化； PCR是去甲基化过程，PCR产物（发生 突变的产物）是去甲基化的产物。
• 筛选方法： ♣体内降解：原始质粒模板可以被能降解甲基化 质粒的大肠杆菌（DMT）降解，而去甲基化的 扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。 ♣体外降解：DpnI识别序列5’-GmATC-3’（在 DNA序列中，一般每256bp中出现一次）。甲 基化模板可被DpnI识别、切割，而去甲基化的 扩增产物（发生突变的产物）不会被降解。
Stratagene： QuickChange Mutagenesis System
• 优点： ♠筛选方法：DpnI限制性内切酶 • 缺点： ♠引物完全重叠，线性扩增， 产物不可见，可操作性差 ♠扩增产物为线状 ♠无DMT体内消化降解模板
Invitrogen： GeneTailor Mutagenesis System
• PCR产物不新鲜： Why~ 3’端热力学不稳定，3’－“A”容易 脱落 直接导致TA克隆效率低 How~ PCR产物置于4℃保存1～2天内使用 不要冷冻PCR产物 PCR结束后立即使用效果最好
• 克隆胶回收片段： Why~ 紫外照射和EB对dsDNA造成损伤； (受到损伤的DNA不是连接的最佳底物) 3’-“A”容易在电泳过程中被核酸外切 酶降解，导致TA连接效率低； 试剂残留的抑制。 How~ 操作中通过细节注意避免
引物设计
扩增特点
模板降解方 法
线性扩增， 完全重叠 线性扩增，产物不可见 DpnI酶体外降解 Stratagene QuickChange 突变位点位于 产物为线状 两条引物上
Invitrogen GeneTailor TransGen Easy/Fast Mutagenesis
部分重叠 突变位点位于 一条引物上 部分重叠 突变位点位于 两条引物上
指数扩增， 指数扩增，产物可见 产物为环状
DMT细胞体内降解 DMT细胞体内降解
指数扩增， 指数扩增，产物可见 产物为环状
DpnI酶体外降解
DMT细胞体内降解 DMT细胞体内降解
TransGen: Easy/Fast Mutagenesis System
Easy点突变与Fast点突变的区别—— • Easy Mutagenesis System： 使用EasyPfu酶 • Fast Mutagenesis System： 使用FastPfu酶—— 扩增速度比Taq更快、保真性比Pfu更高，扩增 10Kb左右的质粒只需2个小时！ （请参考《金品是怎样炼成的》）
• 目的片段浓度很低： Why~ 无法保证有效碰撞 How~ 浓缩DNA
• 毒基因： Why~其本底表达产物对宿主生长有明显抑制 How~ 选用Top10
• 基因特殊结构： Why~ 具有高AT、高GC、反向重复序列的 基因，不容易连接 How~ 调整、摸索连接体系和条件 尝试不同的载体，不同的骨架对片 段偏好性不同
操作
载体+片段 （污染几率小）
克隆效率 特点
>85% 省时（至少节约1天） 快速、高效
TOPO的局限性
• TOPO载体受原理所限，连接大于3Kbp 大于3Kbp 的外源片段时效率低于T4原理载体。 • TOPO载体受原理所限，克隆数要少于T4 原理载体。 (Control Insert≈1000)
• 优点 ♠引物部分重叠，指数扩增 ♠扩增产物可见，易于操作 ♠筛选方法：DMT体内降解 • 缺点： ♠突变点在一条引物上 ♠无DpnI限制性内切酶降解模板
TransGen：
综合了上述两种试剂盒的优点！ 综合了上述两种试剂盒的优点！ ♠引物部分重叠； ♠优化~两条引物上均有突变点，突变效率高； 优化~ 优化 ♠DpnI体外降解筛选 + DMT体内降解筛选=双重筛选 双重筛选！ 双重筛选
•
• •
目的片段加入量：跑电泳可见的浓度，加入1µl即可。 1 优化指南： 优化指南 如果按照上述操作没有得到理想的结果，请按照以下具体要求调整： ♣ 700bp以及更小的片段：保证20ng ♣ 700bp以上的片段：保证30~100ng 700bp 30~100ng ♣ 2Kbp左右的片段：保证40ng ♣ 3Kbp左右的片段：保证60ng ♠片段加入的最大量：4µl，浓度很低时也有一定的连接效率， 体积大于5 µl会破坏反应体系平衡； ♠片段加入的最小量：0.5µl，浓度非常高时需要稀释，否则会产生抑制， 可以补充无菌水方便操作。
TOPO 克隆技术 基因定点突变技术
实验技术服务部 张琛 北京全式金生物技术有限公司
TOPO克隆技术
• • • • TOPO克隆原理 TOPO克隆策略 TOPO克隆成功的关键 TOPO克隆常见问题及解决方法
TOPO克隆原理
• TOPO指Vaccina Virus Topoisomerase • TOPO克隆技术应用的是来自牛痘病毒的拓扑异构酶 • 特点： ♣ 由316个氨基酸组成 ♣ 具有快速解旋作用 ♣ 识别5’-CCCTT-3’或5’-TCCTT-3’ ♣ 同时具有限制性内切酶和连接酶的功能 ♣ 不需要外界提供能量 ♣ 在反应开始的1~2分钟内即可完成80%的反应
所谓连接失败实为误判！ 所谓连接失败实为误判！
２．PCR鉴定重组子失败： 现象：用通用引物鉴定时，扩增产物既无 目的带又无载体自连带 How~ 预变性95℃ 10min （彻底裂解菌体、释放DNA） 最好能用通用引物鉴定
所谓连接失败实为误判！ 所谓连接失败实为误判！
３．菌落多为淡蓝色或FishEye： Why~ 插入片段没有影响LacZ基因读码框 插入片段小（小于400bp） How~ 不要丢弃平板！ 进行进一步鉴定
Mach1-T1
OmniMAX2-T1
TL-Blue
TOPO克隆常见问题及解决方法
• • • • 克隆数少（确认感受态细胞效率正常时） 克隆阳性率低 PCR鉴定重组子失败 菌落多为淡蓝色或FishEye（白边蓝芯）
１．克隆数少或阳性率低：
胶回收片段 产物不新鲜 DNA浓度低 反应时间
毒基因
基因特殊结构
TOPO克隆——原理
TOPO克隆——过程
TOPO克隆——过程
TOPO克隆快速 快速、便捷、高效 高效
载 体
片 段
5 min
产 物
Sekiguchi et al. 1997 JBC
TOPO克隆——克隆策略
PCR产物 有无杂带？有无引物二聚体？ 均有或有杂带 Gel Extraction Kit 均无 基因克隆、转化 无杂带，有引物二聚体 PCR Purification Kit