TOPO克隆
topo克隆原理
topo克隆原理
Topo克隆是一种基因克隆技术，可以用来制备大量相同的DNA 分子。
这种技术基于一种称为Topo酶的酶的作用，它可以切割DNA 双链并重新连接它们，从而产生一个环形分子。
Topo酶在DNA分子的两端或内部形成缺口，然后将DNA分子接成一个环。
然后，DNA聚合酶可以使用这个环形模板来合成新的DNA分子。
由于Topo酶可以自行关闭环形分子，所以该技术是高效的。
Topo克隆技术的具体步骤如下：首先，将目标DNA分子与Topo 酶混合，Topo酶会在DNA分子的两端或内部形成缺口，并将DNA分子接成一个环。
然后，将混合物加入到包含DNA聚合酶和四种核苷酸（A、T、C、G）的反应体系中。
DNA聚合酶使用环形模板合成新的DNA 分子。
最后，将反应产物转化到宿主细胞中，宿主细胞会复制新的DNA分子并产生大量相同的DNA分子。
Topo克隆技术可以用于制备大量目标DNA分子，包括基因、DNA 序列、调控元件等。
它是一种非常常用的基因克隆技术，被广泛应用于分子生物学、基因工程等领域。
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gateway技术
Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
图1 Gateway技术的灵活性Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
二、一项强大而可靠的技术Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。
BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
载体、点突变
•
反应温度： TOPO酶的工作温度为20℃～37℃
• 反应时间[优化指南]： [优化指南]
PCR产物 PCR纯化产物 PCR产物 / PCR纯化产物 25℃ 10min 25℃ 5min 25℃ 15min 【大片段、特殊结构】 25℃ 20min 【大片段、特殊结构】 胶回收产物/ 胶回收产物/加A产物 25℃10～15min
TransGen TOPO Vector
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TOPO克隆成功的关键
• • • • 引物设计 PCR条件 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒 克隆反应设置（DNA加入量、反应的温 度和时间） • 克隆感受态细胞的选择
•
引物设计： ♣引物不能磷酸化。 PCR注意事项： ♣后延伸设置为72℃10～20分钟； 目的： 保证扩增片段完整，可以有效降低扩增背景； 使用Taq系列DNA聚合酶扩增时，该步骤相当于加A反应； ♠使用Taq系列DNA聚合酶扩增（如EasyTaq、rTaq等），请选用粘端克隆载体； ♠使用Pfu系列DNA聚合酶（如EasyPfu、Probest等）扩增，请选用平端克隆载体； ♠使用复合DNA聚合酶（如TransHiFi、LA等）扩增， 既可用粘端载体，也可用平端载体（一般推荐用粘端）。
TOPO克隆和传统T4克隆比较
TOPO克隆 无需纯化可直接用于克隆 （若无杂带和引物二聚体） 5分钟 室温范围内放置即可 T4 DNA Ligase克隆 PCR产物 反应时间 反应温度 需要纯化，否则抑制连接 过夜（12小时） 需要用仪器严格控温 载体+片段 +T4 DNA Ligase Buffer +T4 DNA Ligase （污染几率大） ～60% 费时
4重组表达质粒的构建——基因的克隆
重组表达质粒的构建——基因的克隆长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。
对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。
选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。
为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。
为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。
除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。
原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种：1）酶切连接这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。
如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。
2）TA克隆TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3´末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3´末端A正好匹配。
这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3´末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。
目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。
3）TOPO克隆TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。
PCR需要注意的一些问题
PCR需要注意的一些问题敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。
PCR产物纯化残余反应成分包括抑制克隆，测序和标记反应的引物，核苷和热稳定聚合酶。
因此，一般在进一步操作之前需要纯化PCR产物。
包括多次酚：氯仿抽提及随后的PEG沉淀或异丙醇沉淀的纯化步骤虽然有效，但是耗费时间，且会丢失产物。
MaligenRapid PCR Purification System在10分钟内从反应成分中纯化PCR产物。
它对80bp到10kb很大范围的PCR片段都有效，有效回收95％的原有样品（图26）。
图26. 扩增后PCR片段的纯化使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。
峰值包含约1μg扩增产物的完整PCR体系。
引物36到40碱基长。
将峰值反应纯化，对纯化前（泳道A）和纯化后（泳道B）的洗脱液水相使用琼脂糖凝胶电泳分析。
部分PCR产物可能需要通过凝胶电泳，和影响克隆和测序的非特异性PCR产物分离纯化出来。
使用Maligen Gel Extraction System将目的产物从琼脂糖中纯化出来，这是一种基于硅土的，从凝胶中快速纯化DNA片段的技术。
PCR产物克隆PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。
但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。
TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的专利权。
TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。
Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统都提供一个线性含3`-T突出端的载体用于直接高效地连接PCR产物。
系统中也包含感受态细胞和S.O.C培养基, 使得实验操作更为简单方便。
所以TA克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需将PCR产物进行优化，不需把PCR产物做平端处理（Invitrogen另有平端载体供高确限度酶克隆）。
关于TOPO和GATEWAY
Gateway®克隆的强大性和灵活性
在目的基因（go或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®入门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体，创建各种各种各样的表达克隆。当每一个基因具有进行Gateway®重组的att序列时它们就可能在载体间穿梭。
Gateway技术原理
Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个反应构成的（表2和图4）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
6）用10-50μl，涂于平板上，正放5min后，37摄氏度倒置培养过夜
7）直接进行PCR检测，或挑取菌落在50μl含有50μg/ml氨苄或25μg/ml Zeocin™的LB培养基（置于200μl微量离心管中）培养4h
或者：
Fresh PCR product1.33 µl(from Step 1)
Salt Solution0.33µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
TOPO Vector（载体）0.33 µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
FINAL VOLUME2.00µl
1)连接：按上表进行配制溶液后，轻轻混匀，室温静置5min
2）转化：将试管置于冰盒中进行冰浴5-30min
（图2）
TOPO克隆高效性原理
Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。
pBM16A-TOPO快速克隆试剂盒说明书
pBM16A-TOPO Clone Smart kit保存条件：-20℃保存，有效期一年。
试剂组成：组成CL071-01CL071-02pBM16A-TOPO Vector(20ng/μl)20μl20μl×310×TOPO Reagent20μl20μl×3Control Insert5μl5μlM13F引物干粉管0.1OD0.1OD×3M13R引物干粉管0.1OD0.1OD×3产品介绍：pBM16A-TOPO快速克隆试剂盒利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将片段克隆到载体中。
不仅适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶扩增的带A尾的PCR产物。
试剂盒中的pBM16A-TOPO载体为线性化的质粒。
可以用引物对M13F和M13R进行菌落PCR鉴定阳性克隆。
产品特点：⑴连接反应仅需5分钟。
⑵适用于平末端PCR产物和带A尾的PCR产物。
⑶载体采用了新的制备工艺，无需蓝白斑筛选。
注意事项：⑴片段的选择：各种DNA聚合酶扩增的PCR产物。
⑵引物要求：PCR引物5’端不能进行磷酸修饰，普通商业化引物即可。
操作步骤：1.连接反应按下表，在一个0.2ml PCR 管中依次加入加完试剂后，轻轻混匀低速离心，使溶液集中在管底。
注意：此步骤不要在低温条件下（冰水浴）上操作。
2.反应温度及片段要求室温下（20-30℃）放置0-5分钟，然后将离心管放置在冰上。
如当天不进行转化实验。
请将连接产物置于-20℃保存。
注意：DNA 片段的用量见下表室温下（20-30℃）反应时间5-30分钟，如果室温较低，推荐使用PCR 仪器控制温度。
可以设置25℃反应5分钟。
如果PCR 产物电泳检测仅有很锐利明亮的条带，无引物二聚体和非特异性条带存在，可直接取0.5-1µl PCR 产物原液进行克隆。
Gateway
Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。
由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。
在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。
ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。
需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。
同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。
当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。
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Powerful PCR Cloning Tools
Topo TA克隆方法（Topo TA Cloning Kit）
Topo TA克隆原理与TA克隆一样，唯一不同的是TA克隆用的是T4连接酶把PCR片断连接到T 载体上，而Topo TA Cloning用的是DNA Topoisomerase。
Topoisomerase的用途一般使用在复制DNA前把超螺旋DNA切割使之解旋后，再连接成线性DNA。
Topo TA克隆即使用Topoisomerase高效连接的特性把含3`A端的PCR扩增片断快速连接到3`T 端载体上，整个反应只需五分钟！一般T4连接酶需过夜才能高效连接。
Topo TA克隆系统提供Topoisomerase I载体，感受态细胞，SOC培养基等。
Topo平端克隆方法和长PCR片断克隆法（Zero Blunt Topo PCR Cloning Kit）（Topo XL PCR Cloning Kit）
因为越来越多高确限度热稳定酶如Pfx、Pfu被用于PCR扩增，使到PCR后都只是平端产物。
这种平端克隆往往效率低，并且有非特异性背景菌落产生，造成筛选困难。
Topo平端克隆主要改良载体设计，把ccdB （Control of cell death）基因并入到mcs中，如果没有DNA片断插入，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNA gyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡。
如果有插入片断，则ccdB基因表达受到阻碍，所以细胞可生长。
这样可以把高背景的缺点改善，节省筛选的时间。
Topo平端克隆与Topo TA方法一样，操作简单快速。
T OPO PCR表达克隆法
传统限制酶切法必须把目标片段切下来再连接至表达载体上，这会导致一些非原始蛋白的其他氨基酸也混在其中，从而影响蛋白表达和蛋白的功能。
利用TOPO克隆技术把PCR产物直接克隆至表达载体，则可避免这种情况。
TOPO PCR表达克隆法仍利用特异引物把目标基因PCR扩增后，再利用高效的Topoisomerase 酶把产物快速连接到T表达载体上，这是到载体上的目标基因不含非编码区，Invitrogen提供了原核细胞、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞的各种PCR克隆表达系统。