ClonExpress MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书
无缝克隆说明书+原理+实例
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。
二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。
PCR产物不经过酶切,直接快速,定向克隆入任何载体的方法
PCR产物不经过酶切，直接快速，定向克隆入任何载体的方法默认分类2010-08-13 23:15:45 阅读260 评论0 字号：大中小订阅上海捷瑞生物工程有限公司提供的EZfusion PCR定向克隆同源重组试剂盒，专门为把PCR 产物快速，定向，有效的克隆到任何目标载体而设计。
有效的避免了在克隆过程中遇到的合适内切酶的选择，磷酸化，补平，加A，使用中间载体等等一系列复杂步骤。
无需连接酶，只需要把目标载体线性化(平末端，粘性末端都可以)，PCR产物无需任何酶促处理，直接和目标载体混合，20-30分钟一站式解决所有问题。
技术原理：根据酶切后线性化载体的两端序列，分别在目的基因两端设计15 base与载体末端同源的序列，PCR扩增的产物两端就会分别带有15 bp与线性化载体两端相同的序列。
PCR 产物和线性化载体与EZfusion Enzyme酶充分混匀，22 ℃温浴30 min后，按传统方法转化E. coli competent cells，就可以高效、定向地将PCR产物克隆到目标载体上。
如下图：适用范围：1、PCR cloning into any vector2、Long PCR DNA (up to 12 kb) cloning3、Gene transfer from one vector to another4、High-throughput (HTP) PCR cloning5、In vitro joining of DNA fragments优点：1适用于各种自备载体、插入片断、或者酶切位点，只要线性化载体就行（单酶切、双酶切均可），不用酶切PCR产物，不用补平或加A处理，不用去磷酸化载体，不用连接；2. 适用于各种PCR酶（常规Taq、各种高保真酶均可）的扩增产物；3. 混合温育30分钟即可转化，节约时间和精力；4. 精确定向克隆，即使载体单酶切也可以定向，表达产物没有多余的氨基酸；5. 重组效率高、转化率高，可用于高通量操作，批量克隆, 重复性高、可靠性好；6. 根据实验需要选择适合的表达载体，选择最佳酶切位点，酶切载体后得到线性化载体（单酶切或者双酶切均可），得到PCR产物和线性化载体后，加入EZfusion Enzyme酶，混合，22°C保温30分钟后转化，就可以高效、精确、定向将PCR产物克隆到目标载体上。
CloneSelect Imager, ClonePix2细胞筛选系统和QPix微生物克隆挑选
７天追踪克隆生长－聚集每个成像时间点叠加成像
系统参数
成像 软件 白光成像 数据追踪 相机 成像速度 分辨率 仪器 源板类型 源板载量 仪器尺寸 仪器重量 整合性 监管部门获批
3% Day 1 5% Day 2 15% Day 3 55% Day 7
ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔ Ｉｍａｇｅｒ 专用成像软件预装在高性能ＰＣ上，Ｗｉｎ ７操作系统 透射光 １个内部的条形码阅读器可以追踪每个板数据 整合１６位冷ＣＣＤ相机 ９６孔板：２．５分钟 标准：３．６微米；最大：１．８微米
９６孔板或者３８４孔板 １块 ７２０ｍｍ（宽）×４５８ｍｍ（高）×５７０ｍｍ（深） ５５ｋｇ ＯＥＭ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ ａｖａｉｌａｂｌｅ
ＣＥ标志
09
ＱＰｉｘ微生物筛选系统
ＱＰｉｘ系列微生物筛选系统可自动挑选特异性微生物，具有运行速度快、精度高、性能稳定等优点，是微生物筛选的理 想工具。作为自动化微生物筛选产品的鼻祖，Ｇｅｎｅｔｉｘ发展出多项独特的技术和工具，并据此设计了一系列适合不同通 量以及实验应用要求的筛选系统，包括：
具有特定细胞表面标记的细胞 根据细胞内报告基因的表达筛选克隆（ｅ．ｇ． ＧＦＰ） 昆虫杆状病毒筛选，杆状病毒蛋白表达系统，自动挑取琼脂糖培养基上形成的病毒斑
ＣｌｏｎｅＰｉｘ系统
选择多孔板
条形码 可追踪 克隆
机械挑选臂可精确、 轻轻挑取和转移克隆
堆板器可操作 １￣６－孔培养 板和９６孔转
移板
自动化 移去和 替代板盖
04
工作站 可清洗 和消毒
系统参数
成像 软件
白光成像
荧光成像
数据追踪 相机 成像速度 分辨率 仪器 污染 源板类型 终板类型 源板载量 终板载量 挑取头 挑取针大小 挑取速度 洗浴 挑取系统液流 针头干燥 仪器尺寸 仪器重量 压缩机 压缩元件 尺寸 重量 最小运作压力 最小操作体积 监管部门获批
ClonExpress One Step Cloning一步法定向克隆无缝克隆讲座
Vector with One Insertion Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform 3.5 hr over all
Vector with Multi Insertions Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform
BamHI (1794) SalI (596) SalI (355) Eco RI (16) Xho I (347) Xho I (1424) SalI (1473) SalI (1965) SalI (2220) Xho I (2381)
ORF
ORF
2514 bp
Poor sites for digestion: buffer choice Poor sites for ligation: blunt-sticky ends ligation
First and most important thing: Select you cloning site GC content/repeat sequence 40-60%/try to avoid
Vector with One Insertion Design specialized primers Amplify your insertion by PCR Linearize your cloning vector Mix them and react for 30 min Transform
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆随着生物技术的不断发展，分子生物学技术成为现代生命科学研究中的重要工具之一，通过对生物分子的研究，人们可以深入了解生命体的组成和运作方式，为解决人类和社会面临的诸多问题提供依据和解决途径。
其中，DNA序列分析和基因克隆是现代生命科学研究中最为基础和重要的研究方法之一。
而为了加速DNA序列分析和基因克隆，快速克隆技术应运而生。
快速克隆技术是一类利用高效的DNA重组技术将外源DNA序列导入宿主细胞，并产生可重现、高效、无需寻找突变位点的定向克隆方法。
它不仅缩短了基因克隆的时间，而且方便了对DNA序列的修饰。
快速克隆技术的主要优势在于，可以直接对目标DNA序列进行点突变、插入、删减等修饰，从而实现对基因功能的探究，为分子生物学研究提供有力手段。
快速克隆技术主要包括克隆扩增和重组克隆两种方法。
克隆扩增是一种在PCR反应中同时进行克隆扩增和定向作用的技术，通过使用末端限制性核酸内切酶和pCR®4-TOPO®克隆载体，可以实现PCR产物的快速克隆扩增。
重组克隆则利用了DNA重组酶的高效作用，在宿主细胞内完成DNA重组反应，将目标DNA序列在不损失信息的情况下导入到载体中，从而实现快速、准确、方便的基因克隆。
在快速克隆技术的应用中，需要注意一些技术要点。
首先，对于目标DNA序列的选择需要仔细考虑，得到的DNA序列必须保持完整性，并且没有任何突变；其次，在重组克隆中，DNA重组反应必须充分进行，可以通过调节DNA浓度、DNA重组酶的用量和反应时间等因素来达到最佳反应效果；此外，对于载体的选择也非常重要，通常会选择T/A克隆载体，如pCR®4-TOPO®克隆载体，在克隆扩增反应中具有很好的适用性，而在重组克隆中，较常用的载体有pET-28a，pGEX等。
使用快速克隆技术进行基因克隆，需要进行单克隆鉴定。
clonepix工作原理 -回复
clonepix工作原理-回复clonepix是一种图片克隆技术，它能够复制和粘贴图像素材以快速生成新的图像。
这种技术基于计算机图像处理和深度学习算法，通过分析和学习原始图像的特征来创建一个可以生成类似效果的模型。
本文将详细介绍clonepix的工作原理，从图像采集到生成和优化的整个流程。
首先，为了开始克隆过程，我们需要采集一张原始图像作为输入。
这张图片可以是用户自己提供的，也可以从网络上下载。
在采集过程中，我们还可以使用一些图像处理技术来优化图像质量，例如调整亮度、对比度、饱和度等。
接下来，将采集到的原始图像输入到模型中进行处理。
模型通常由深度神经网络构建，包括输入层、隐藏层和输出层。
输入层接收原始图像数据，并将其转化为适合网络处理的格式。
隐藏层是模型的核心，它由多个神经元组成，每个神经元执行一系列计算来提取图像的特征。
这些特征可以是颜色、纹理、形状等。
在克隆过程中，模型不仅学习原始图像的特征，还学习如何将这些特征应用于新的图像生成。
模型会使用反向传播算法来调整权重和偏置，以最小化生成图像与原始图像之间的差异。
这个训练过程需要大量的数据和计算资源来获得准确和高效的结果。
一旦模型训练完成，就可以开始生成新的图像。
用户可以选择以原始图像为基础，并指定要克隆的特定区域。
模型会根据用户的指示和学习到的特征，将原始图像中的特定区域与其他区域进行匹配、复制和粘贴。
这个过程涉及到图像分割、特征匹配和像素操作等多个步骤，以确保生成的图像在视觉上与原始图像一致。
除了基本的克隆功能，clonepix还提供了一些额外的工具和功能来优化生成图像的质量。
例如，用户可以调整克隆的透明度、尺寸和位置，以实现更精确的效果。
此外，clonepix还支持批量处理和自动化操作，使用户能够快速生成大量的克隆图像。
要注意的是，clonepix是一种生成性模型，它并不是一个完美的复制工具。
生成的图像可能会有一些细微的差异和瑕疵，这是由于模型的训练和图像生成过程中存在的限制所导致的。
dna assembly mix无缝克隆原理
dna assembly mix无缝克隆原理DNAAssemblyMix是一种新型的基因克隆试剂，它的出现为基因克隆领域带来了革命性的变化。
这种混合物集成了多种功能，能够简化基因克隆过程，提高克隆效率，并降低错误率。
本文将详细介绍DNAAssemblyMix无缝克隆原理，帮助读者更好地理解其优势和应用。
一、无缝克隆原理DNAAssemblyMix无缝克隆原理的核心在于其独特的组装方式。
传统的基因克隆方法需要人工构建载体，操作过程繁琐，容易出错。
而DNAAssemblyMix则采用了一种自动化、智能化的组装方式，将目的基因和载体DNA预先混合，通过特定的酶反应，将两者连接起来，形成重组子。
这种方式大大简化了克隆步骤，降低了人为误差，提高了克隆效率。
二、关键技术1.酶切位点设计：DNAAssemblyMix的关键技术之一是酶切位点的合理设计。
通过对载体DNA和目的基因进行精确分析，选择合适的酶切位点，能够保证在特定条件下，目的基因能够准确无误地连接到载体上。
2.自动化组装：DNAAssemblyMix采用自动化设备进行组装，能够实现大规模生产。
这种自动化设备能够精确控制反应温度、时间等条件，确保基因克隆的准确性和稳定性。
3.质量控制：DNAAssemblyMix的生产过程中，严格控制每个环节的质量，包括原料筛选、生产环境、生产过程等。
通过严格的质量控制，确保产品的稳定性和可靠性。
三、应用领域DNAAssemblyMix无缝克隆原理的应用领域非常广泛，包括生物医药、农业、环保等领域。
在生物医药领域，DNAAssemblyMix可以用于基因治疗、药物筛选等研究；在农业领域，DNAAssemblyMix可以用于基因编辑、抗病抗逆性等方面的研究；在环保领域，DNAAssemblyMix可以用于环境监测、生物修复等方面的研究。
四、优势与前景DNAAssemblyMix的优势在于其自动化、智能化、高效、稳定等特点。
无缝克隆,同源重组克隆
简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。
它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。
装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。
（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。
首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。
然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。
最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。
这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。
下面是组装的示意图。
材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。
如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。
4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。
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ClonExpressTM MultiS试剂盒中提供pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl)和Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)各5 μl，需要时可进行阳性对照 反应，每次反应各加1 μl。 体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡
注意: 1. 线性化克隆载体的使用量应在50～200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围 时，直接选择最低/最高使用量即可。 2. 插入片段DNA使用量应大于10 ng。当使用上述公式计算DNA最适使用量低于这个值时，直接使用 10 ng即可。 3. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体 积的1/5，即4 μl。
40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。 克隆载体线性化方式可以为限制性内切酶酶切消化，也可以为反向PCR扩增。 A 线性化克隆载体由酶切制备
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首先设计第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物(与载体相邻的两个插 入片段)，如图二所示
其次设计第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物。用于片段之间进行重组的 同源序列可以添加至前方片段的反向扩增引物中，也可以添加至后方片段的正向扩增引物 中，还可以两片段各添加一部分。以将同源序列添加至前方片段 (第一片段)的反向扩增 引物中为例，引物具体设计方案如图三所示：
ClonExpressTM MultiS
One Step Cloning Kit
Vazyme Biotech Co., Ltd
网站/Web: 咨询热线/Tel: 400-600-9335 销售/Sales: sales@ 技术支持/Support: support@ 技术服务/Service: service@
图二：第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物设计示意 注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物 退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。
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PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。 ClonExpressTM MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不 是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需 纯化直接用于重组反应。 PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都 会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量 的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方 式可查阅表二。
４．６ 反应产物转化、涂板 取20 μl冷却的反应液，加入到200 μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2 min。加入900 μl SOC或LB培养基，37℃孵育10 min充分复苏。37℃摇菌45 min。取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将 平板倒置，于37℃过夜培养。
４／实验方案
４．１ 实验流程概览（图一） 1).线性化克隆载体制备 (参见4.2)； 2).插入片段扩增引物设计 (参见4.3)； 3).插入片段PCR扩增 (参见4.4)； 4).进行重组反应 (参见4.5)； 5).反应产物转化、涂板 (参见4.6)； 6).克隆鉴定 (参见4.7)。 B
ClonExpressTM MultiS 重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。克隆载体酶切产 物加热失活内切酶 (参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活) 后可直接用于重组反应。 线性化克隆载体由反向PCR扩增制备 我们推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (PhantaTM Super-Fidelity DNA Polymerase, Vazyme, P501) 以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线 性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。 CloneExpressTM MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板为预 线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。 克隆载体酶切产物或 PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接 使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5kb) 克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提 高 DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 (其电泳位置不同于线性化克隆载体) 。不 同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。
注意: 我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30 min左 右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
扩增特异
胶回收
有明显非特异性扩增
表二：扩增产物推荐使用方式 注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5)。 * 当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将DpnI 失活， 以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。
４．３ 插入片段扩增引物设计 ClonExpressTM MultiS 引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入同源重组序列，使得扩 增产物之间以及扩增产物与线性化克隆载体之间都具有能够相互同源重组的完全一致的序 列 (15 bp～20 bp)。以pUC18作为克隆载体、进行三插入片段顺序拼接克隆 (5’至3’按克 隆顺序依次为：第一片段、第二片段、第三片段)为例，引物具体设计方案如下：
C113-01 (10 rxn)
40 μl 20 μl 5 μl 5 μl
C113-02 (25 rxn)
100 μl 50 μl 5 μl 5 μl
01/ 02
３／贮藏条件
本产品应置于-20℃储存。
双酶切线性化：线性化完全，转化背景 (假阳性克隆) 低。推荐使用。 单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
PCR扩增情况
PCR模板类型 与克隆载体抗性相同 的环状质粒 预线性化质粒、 基因组、cDNA
快速实验方案 DpnI 消化后直接使用* 直接使用 胶回收
最佳实验方案 胶回收或DpnI 消化后胶回收
或者涡旋混匀)。置于37℃反应30 min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却 5 min。之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
注：ClonExpressTM MultiS 重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使 是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克 隆 (无插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备 线性化克隆载体。
Vazyme biotech co., ltd.
使用说明书
Version 3.2
目 录 Catalog
１／产品概要
ClonExpressTM快速克隆技术 ClonExpressTM技术是一种简单、快速并且高效的DNA定向克隆技术，可将插入片段PCR 产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和 线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。这种两端带有载体末端 序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后，在ExnaseTM的催化下，仅需反应 30 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。 ClonExpressTM MultiS是新一代的重组克隆试剂盒，该试剂盒中包含有专门针对多片段重 组反应而优化的反应缓冲液和重组酶ExnaseTM MultiS。使用该试剂盒，可以一次实现多 至五个插入片段的顺序拼接克隆。此外，ExnaseTM MultiS还兼容常规酶切、PCR反应体 系。克隆载体酶切产物或PCR产物以及插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于 重组克隆，极大的简化了实验步骤。 产品优点 -简单、快速、高效 -适用于向几乎任何载体的任何位点进行多片段拼接克隆 -无需考虑插入片段自身携带的酶切位点 -可一次实现多至五个插入片段的顺序拼接克隆 -线性化克隆载体和PCR产物可不进行纯化直接克隆 应用范围 -多片段拼接克隆 -全基因合成
产品概要 产品组成 贮藏条件 实验方案 参考实例 注意事项品组成
组 分
5 × CE MultiS Buffer ExnaseTM MultiS pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl) Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)
TM
环状质粒 扩增特异 PCR制备 有明显非特异性 扩增 预线性化质粒、 基因组、cDNA
胶回收
表一：线性化克隆载体的使用方式 注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) 。
４．２ 线性化克隆载体制备 选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列 且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在
图三：第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计示意 注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温 度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。