大片段DNA的克隆
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
扩增较大片段DNA的PCR方法
PCR技术（八）：扩增较大片段DNA的PCR方法一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。
Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校读活性（3'-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由10*-4降到10*-3，从而提高PCR产物的准确性。
但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA聚合酶ＩKlenow片段）或Ampli Taq（全长的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。
因而以往的P CR反应产物限制在5.0kb以内。
超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。
即使将延伸时间定为30分钟（10倍于通常所需）亦无改进。
利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增美国华盛顿大学医学院的Barnes WM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，Pfu DNA聚合酶虽然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。
因此必需将Pfu DNA聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反应顺畅进行。
实验证实，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小为27-33nt,即可使反应有效进行。
当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
大片段DNA的克隆
大片段DNA的克隆通常超过3Kb以上的片段不太容易构建到载体上，成功率也是非常的低，根据笔者多年的经验成功克隆过5kb左右的基因片段，先将一些心得与大家分享：第一：PCR产物确保正确，扩增长片段往往会出现点突变，缺失插入突变，甚至是并非自己想要的片段，此时就要要求所用的TAQ酶是高质量高保真高前进能力的酶--推荐primerstar，并且保证所设计的引物的特异性，如果有错配的可以尝试不加MCS 的巢式引物，拿第一次PCR产物再用加MCS的引物去扩，可保证起特异性和效率性。
第二：连接要求有效，通常大片段与载体相连接由于空间位阻的原因不太容易得到阳性克隆，所以一定要保证以下几点-目的基因绝对的大量保证在载体的10-15倍摩尔比值；载体最好不要太小，可以直接尝试表达载体；最好使用过夜16度连接（24h以上），快速连接的效果对于大片段来讲并不占优势；连接酶可适当多加。
第三：转化要高效，由于大片段克隆到载体上通常加上载体会比较大，有时甚至超过10-20kb，这时会严重影响转化效率和细菌的生长速度，可以考虑电转或者，300-400ul的感受态细胞，严格按要求转化，使用DH5a时，可能消耗能量的原因，细菌长得很慢，可以考虑用TOP10,或DH5a多培养一段时间第四：不轻易放弃，长出来的菌因为质粒很大，去做菌落PCR不一定能检测出来阳性菌，可以考虑照样接种，次日提质粒酶切鉴定。
也可以多对比几个不同的载体，相信一定能做出来的。
第五：实在是做不出来，将其肢解成多个小片段，每个片段构建到T载上，最后拼接到一起。
第六：克隆大片段真核基因，要保证高质量的RNA，以确保完整的片段，并且需要高质量的逆转录酶，可以将RNA的量加到说明书的上限，保证足够浓度的完整的cDNA片段。
如果大片段的外显子不是很多，还可以考虑用基因组或BAC/YAC来调取目的基因。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
DNA体外重组技术介绍
星活性: 酶切反应条件不能满足最适 条件,导致某些酶产生第二活性.
EcoR I*
GAATTC
AATT
酶切反应体系的建立：
标准的酶切体系 1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推 荐的Buffer和温度，反应1h
酶切体系组成
• 内切酶 根据实验目的选择，保存，使 用，稀释（避免失活与污染）
第五章
DNA体外重组技术
概述
一、DNA重组技术相关概念
克隆(clone) 来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细 胞
或克动 隆物 化（(c常lo被ni成ng为) 副本或拷贝）。 获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。
DNA克隆(DNA cloning)
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子。
• 大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶， 分解X-gal，使菌落为蓝色。
pBR322质粒：一种克隆质粒
结构：
ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。
Ampr, Tetr：
Ampr
两个抗性基因用于
Tetr
筛选阳性克隆。
Pst I, BamH I：
两个单酶切位点用于 ORI 插入目的基因
pfxBlue: 克隆质粒
质粒载体
体 酵母人工染色体
粘性载体
二、不同载体的特点与分类 （一）质粒载体 1. 质粒(plasmid)
定义: 细菌染色质以外的双链环状DNA， 能自我复制和表达其携带的遗传信息。
染色质 质粒 细菌培养
大肠杆菌
质粒扩增并表达蛋白质
DNA片段的克隆及常见的问题
TA克隆载体简介 TA克隆载体简介
新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 PCR
pCF-T：TA快速克隆载体 ： 快速克隆载体 pCF-Blunt：多克隆位点为平端，不带T，，其他序列与pCF-T 相 ：多克隆位点为平端，不带 ，，其他序列与 ，，其他序列与 适合平末端DNA片段快速连接 同，适合平末端 片段快速连接
主要内容
DNA克隆简介 克隆简介 DNA克隆的操作步骤 克隆的操作步骤 DNA克隆常见问题及解决方案 克隆常见问题及解决方案
TA克隆的流程 克隆的流程
I.高纯度的基因资源
杂交筛选或PCR扩增目的基因 II.杂交筛选或 扩增目的基因
III.目的基因的纯化 III.目的基因的纯化 IV.目的基因与T载体的连接、 IV.目的基因与T载体的连接、转化 目的基因与 V.目的基因的筛选及鉴定 V.
• •
根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA 根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA Marker的量及其荧光的强弱 样品进行定量。 样品进行定量。 使用此法还有一个突出优点， 使用此法还有一个突出优点，即它可令操作者直观地获 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 DNA样品的完整性及其大小
反应体系 目的PCR 片段 目的 对照插入片段（ 对照插入片段（700 bp, 50 ng/µl） ） pBS-T载体 载体 Ligase 10×Ligation Buffer × 无菌去离子水 2 – 7 µl —— 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl 阳性对照 —— 1 µl 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl
克隆技术简介
克隆技术介绍张勋学号：160820216摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。
人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。
本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。
一、克隆技术实质1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆(Clone)”的术语。
学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。
早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。
1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。
在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。
克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。
克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。
时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。
这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。
简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。
但克隆与无性繁殖是不同的。
克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。
植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。
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通常超过3Kb以上的片段不太容易构建到载体上，成功率也是非常的低，根据笔者多年的经验成功克隆过5kb左右的基因片段，先将一些心得与大家分享：
第一、PCR产物确保正确，扩增长片段往往会出现点突变，缺失插入突变，甚至是并非自己想要的片段，此时就要要求所用的TAQ酶是高质量高保真高前进能力的酶——推荐primerstar，并且保证所设计的引物的特异性，如果有错配的可以尝试不加MCS的巢式引物，拿第一次PCR产物再用加MCS的引物去扩，可保证起特异性和效率性。
第二、连接要求有效，通常大片段与载体相连接由于空间位阻的原因不太容易得到阳性克隆，所以一定要保证以下几点-目的基因绝对的大量保证在载体的10-15倍摩尔比值；载体最好不要太小，可以直接尝试表达载体；最好使用过夜16度连接（24h以上），快速连接的效果对于大片段来讲并不占优势；连接酶可适当多加。
第三、转化要高效，由于大片段克隆到载体上通常加上载体会比较大，有时甚至超过10-20kb，这时会严重影响转化效率和细菌的生长速度，可以考虑电转或者，300-400ul的感受态细胞，严格按要求转化，使用DH5a时，可能消耗能量的原因，细菌长得很慢，可以考虑用TOP10,或DH5a多培养一段时间
第四、不轻易放弃，长出来的菌因为质粒很大，去做菌落PCR不一定能检测出来阳性菌，可以考虑照样接种，次日提质粒酶切鉴定。
也可以多对比几个不同的载体，相信一定能做出来的。
第五、实在是做不出来，将其肢解成多个小片段，每个片段构建到T载上，最后拼接到一起。
第六、克隆大片段真核基因，要保证高质量的RNA，以确保完整的片段，并且需要高质量的逆转录酶，可以将RNA的量加到说明书的上限，保证足够浓度的完整的cDNA片段。
如果大片段的外显子不是很多，还可以考虑用基因组或BAC/Y AC来调取目的基因。
原文地址:/biotech/exp/molbio/DNA/2010/a818444974.html。