InFusion克隆技术介绍
无缝克隆说明书+原理+实例
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。
HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。
将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。
图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。
1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。
设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。
二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。
三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。
大连In-Fusion Cloning
建立In-Fusion应体系
3.线性化载体的纯化必须胶回收，低电压运行，确保线性分子和环状分子载体彻底分离。
转化感受态细胞 插入片段确认
反向PCR扩增
1.当找不到合适的酶切位点，可以采用反向PCR的方法。 2.同时这也是一种突变的方法（缺失，插入，点突变）。 3.引物设计时，15 nt悬挂的同源碱基可以来源于插入片段。 4.为了保证载体骨架完整性，推荐使用高保真酶，如CloneAmp HiFi PCR Premix（639298）。
7
Q2：引物合成的纯化方式和修饰要求？ A2：脱盐处理即可，较长引物可以PAGE纯化。 3’-OH，而5’无需磷酸化处理。
Q4：引物 除了15 bp的同源序列和目的基因的特异 性序列，还可以包含其它的序列？
A4：可以，在15 bp同源序列之后引入其它适当序 列，用于酶切位点构建、读码框的完整性和融合标 签。15 bp+其它序列+GSP序列。
规格
10 rxns 50 rxns 100rxns 10 rxns 50 rxns 100rxns
Cloning Enhancer
Nucleo -Spin
Stellar Competent Cells
CloneAMP HiFiPCR Premix
Lyophilized
√ √ √ √ √ √ √ √ √ √
推荐5:1或者10:1；插入片段50-100 bp时，推荐10:1或者 50:1。
A5：50 bp-15 kb，8-15 kb的克隆效率可能会 下降。
Q7：PCR产物如何纯化？
A7：如果PCR产物电泳检测显示单一条带，可以采用Cloning Enhancer（639613）处理； 小于350 bp的PCR产物，建议采用Cloning Enhancer（639613）处理； 如果PCR产物含有非特异性背景，请采用切胶方式分离目的片段回收纯化，推荐NucleoSpin Gel and PCR Clean-up（740609）。
克隆技术的研究与应用
克隆技术的研究与应用近年来，克隆技术作为一种前沿科技，不断引起了人们的关注，同时也在生物学、医学、农业等领域发挥着重要作用。
克隆技术的研究与应用，不仅推动了生命科学的发展，也对社会的进步带来巨大的贡献。
一、克隆技术的定义与原理克隆技术，是指利用人工手段将某一个个体的基因或一组基因复制出来，并转移到另一个宿主细胞中，在宿主细胞中进行复制和生长，从而获得一系列与原基因相同或相似的新个体。
克隆技术的原理主要是利用细胞分裂的能力和基因工程技术，通过对细胞核和DNA进行操作，实现对个体遗传信息的复制和改变。
二、克隆技术在生物学研究中的应用1、基因克隆基因克隆是通过克隆方法得到与原基因相同或相似的基因序列，并进行分析和研究。
基因克隆技术可以用来制备基因库，对基因的结构和功能进行研究，并且可用于制备各种重要蛋白质。
2、细胞克隆细胞克隆是指利用克隆方法获得一组相同或相似的细胞群体，以便进行相关实验和研究。
细胞克隆技术在细胞学研究中发挥着重要作用，为细胞学的进一步研究提供了理论基础和实验手段。
三、克隆技术在医学领域的应用1、组织和器官移植组织和器官移植是利用克隆技术实现的一种医学手段，在多种疾病治疗中发挥着重要作用。
克隆技术可以用于制备人工器官替代病患自身的受损和失效的组织器官，从而恢复其正常功能。
2、药物研发克隆技术可以用于药物研发中，例如以克隆技术获得人体生长激素基因，并进行基因重组，得到大量的生长激素，用于药物制备。
克隆技术可以利用重组技术进行药物靶标的发现和验证，从而为药物研发提供重要的基础研究手段。
四、克隆技术在农业领域的应用1、动植物育种克隆技术可以用于动植物的优良品种育种，在动物育种中，克隆技术可以解决种畜生繁殖率低、死亡率高等问题，从而大幅度提高其繁殖效率和生产水平；在植物育种中，利用克隆技术获得的干细胞可实现对优良品种的无性繁殖，极大地提高了良种的繁殖效率。
2、基因转移克隆技术可以利用基因工程技术，将优良基因或抗病基因移植到其他品种或物种中，从而实现物种间基因的跨越转移和融合，为农业生产提供了重要的技术支撑。
基因克隆实验手册
插入片段 线性化载体
推荐使用的试剂盒
产品信息
DNA Ligation Kit <Mighty Mix> P4
Blunting Kination Ligation (BKL) Kit
P6
TaKaRa DNA Ligation Kit LONG P4
Mighty TA-cloning Kit
P6
Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR®
↓ ③42℃反应45秒后，在冰中放置1～2分钟
↓ ④加入已预先37℃保温的SOC培养基，使终体积为1 ml。
↓ ⑤37℃振荡培养1小时（160～225 rpm）
↓ ⑥取适量涂布于LB选择培养基、37℃过夜静置培养
5. PCR扩增确认插入片段DNA 6. 培养、纯化质粒
PCR扩增确认插入片段DNA请参考第5页
TCGA 5’ Hin d Ⅲ
线性化载体 ※
C TAG A G C T
※ 利用限制性内切酶酶将环状载体DNA切断后，切胶 回收、或必要时进行去磷酸化反应
转化
·感受态细胞
形成菌落
进行菌落PCR 确认插入片段
·EmeraldAmp® MAX PCR Master Mix等
·电泳相关制品
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基因克隆实验手册
※ PCR扩增产物是平滑末端时进行dA加尾反应。
【目的DNA片段】 带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
infusion克隆原理
infusion克隆原理
Infusion克隆是一种提取特定的基因的过程，它能够让研究人员和其他从事科学研究的人员获得特定细胞识别等基因信息，以用于做
为他们实验或研究。
基因克隆技术通过提取一系列核酸（DNA）和蛋白
质（RNA），以建立某种特定细胞的克隆，以及特定酶的催化。
研究人员在进行Infusion克隆的实验的时候，需要确定提取的
基因的类型，以及确立表达这些基因所需要的诱因。
受克隆的基因被
提取到试管中，使用特定的催化酶。
当所需的蛋白质在细胞中被发现，基因信息将被提取出来，以供下一步实验。
Infusion克隆可以用于从细胞提取DNA，以及提取特定类型细胞
以外物质，例如乳腺母细胞。
同时，研究者也可以将这种克隆技术用
于更进一步的深入的研究和实验，例如分离具有特定遗传序列的基因，作为芯片。
此外，Infusion克隆也为研究人员提供了一个更加容易的方式来分享和传播与特定目标有关的基因研究信息。
总而言之，Infusion克隆技术通过提取一系列基因信息，为研究人员提供了一种工具，作为进行下一步实验，深入研究和分享基因信
息的可靠途径。
此外，流入克隆还可以提供更直观的测定细胞状态的
方法，以及能够将基因提取并传播的一种可靠的方式。
克隆技术的原理及过程
克隆技术的原理及过程
克隆技术是指利用生物学手段产生一种与原始个体基因完全一
致的后代。
克隆技术的原理是利用细胞分裂的能力和基因复制的原理，将一个成熟细胞的基因组复制到一个无性生殖的胚胎中，从而产生一个与原个体基因完全一致的后代。
克隆技术的过程可以分为以下几个步骤：
1.采集供体细胞：从一个生物体中采集一个成熟细胞，通常使用皮肤细胞或血细胞作为供体细胞。
2.细胞核移植：将供体细胞的细胞核移植到一个去核的卵细胞中。
这可以通过使用一个微针将细胞核插入卵细胞内来完成。
3.激活卵细胞：使用化学物质或电脉冲激活卵细胞，使其开始分裂。
4.移植胚胎：将发育良好的克隆胚胎移植到一个代孕母体中。
5.孕育后代：如果胚胎发育成功并且嵌入代孕母体，它将组成一个克隆胎儿并最终出生为克隆后代。
克隆技术具有广泛的应用前景，包括用于动物繁殖、药物开发、疾病治疗和农业生产等领域。
但是，由于克隆技术的伦理和道德问题，以及技术上的一些挑战，它仍然是一个备受争议和受限制的领域。
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4重组表达质粒的构建——基因的克隆
重组表达质粒的构建——基因的克隆长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。
对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。
选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。
为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。
为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。
除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。
原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种：1）酶切连接这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。
如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。
2）TA克隆TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3´末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3´末端A正好匹配。
这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3´末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。
目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。
3）TOPO克隆TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。
利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体
利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体【摘要】目的：本研究以构建存活素增强型绿色荧光蛋白(survivin ＆efp)融合基因慢病毒表达载体（pcfusurvivin）为例来探讨infusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值。
方法：根据infusion技术原理，克隆引物设计时，在survivin 同源序列的两侧分别引入经ae i线性化的载体pcfu两端各15个碱基，将以此引物扩增的聚合酶链式反应（pcr）产物与线性化pcfu用infusion交换酶在室温下作用30min，使survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换，取2μl交换液进行转化，挑取阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。
将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293t 细胞，观察survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。
结果：每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数，阳性率达90%以上，瞬时转染pcfusurvivin可获得survivin ＆efp融合蛋白在293t细胞中的表达。
结论：该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术，使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费。
关键词】基因；克隆细胞；基因，病毒value of infusion clonin techhique on routine vector construction lin chao ui fan lin chen lian londepartment of cardioloy，union hospital，fujianmedical university，fuzhou，fujian，350001，abstract：objective:to introduce a simple method for the clonin of pcr products.methods:the infusion clonin technique was described by constructin a rebinant lentivirus vector (pcfu) with survivin ＆efp fusion ene as a sample.the survivin cdna was amplified with survivin ene specific primers with 15 bp extensions homoloous to the pcfu ends.by the action of the infusion enzyme at room temperature for 30 minutes，the sinlestranded pcr frament and vector ends were fused due to the 15 bp homoloy.finally，clones derived from transformation were chosen randomly and identified.results:about 103 positive clones for inserts were obtained after transformation with 2 μl of exchanin products，and the ratio of the positive colonies was more than 90%.after 24 h the pcfusurvivin was transfected into 293t eukaryotic cells，the expression of the survivin ＆efp fusion ene can be confirmed with fluorescence microscope.conclusion:the liation independent property makes the infusion pcr clonin technique rapid，reliable and hiher costeffective，avoidin the need for multiple sub clonin steps.key words：enes;clone cells;enes,viral传统的聚合酶链式反应（pcr）产物克隆技术包括补平末端克隆、ta克隆以及连接酶依赖性克隆等。
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选择片段 纯化
混合
引物设计 PCR扩增
重组载体
In-Fusion克隆不受限制性内切酶酶切位点的限制: • 在cDNA序列中插入内含子,荧光蛋白基因 • 在cDNA序列添加UTRs • 转换纯化标签例如Myc 转换为His • 缺失蛋白表达区域…
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8/16/2020
•
In-Fusion Kit 常见问答
Q1.如何选择PCR酶？ A1.可以使用任何PCR酶。由于科研人员进行克隆表达的实验较多，我
们推荐使用高保真的PCR酶。
Q2.载体和插入的DNA片段末端结构有限制吗？ A2.没有特别的限制。无论是平滑末端、粘性末端或者末端有无A尾均可
进行有效的连接反应。
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8/16/2020
•
技术支持
：800-810-6261；010-80720985 / 86
：
service@. cn
：
我们将竭诚为您服务！
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8/16/2020
•
Thank You ！
3Q！！！！
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8/16/2020
•
•
引物设计网络工具
在线支持工具
/infusion
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8/16/2020
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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8/16/2020
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产品列表
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8/16/2020
•
In-Fusion®基因克隆技术原理示意图
50 ℃，15 min单管反应
In-Fusion专利酶
In-Fusion是一种快速、简单、高效的基因克隆技术！
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•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
这是一款让您随心所欲地实现基因定向克隆的产品！
3
8/16/2020
•
In-Fusion®基因克隆特点
4
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
5
8/16/2020
•
主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
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8/16/2020
•
Cloning Enhancer的实用例
未经处理
Up to 5X Higher Efficiency
Cloning Enhancer处理
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8/16/2020
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主要内容
1 In-Fusion®克隆技术的原理 2 In-Fusion®优点及应用实例 3 In-Fusion®系列产品介绍 4 常见问答
In-Fusion专利酶
【结果】
In-Fusion 连接反应 50 ℃ 15 min
反应液 直接转化
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•
引物设计原则
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列 引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
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8/16/2020
•
引物设计原则
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【方法】使用TaKaRa高品质PCR酶分别扩增1 kb、2 kb、3 kb的目的DNA片段 和2.7 kb的载体，并将扩增产物混合，使用In-Fusion® HD试剂盒完成 克隆。利用高效率的感受态细胞StellarTM Competent Cells（产品编 号：636763）转化并进行蓝/白斑筛选。
•
可同时克隆两个或多个DNA片段
Step 1: 制备线性化载体
片段1 片段2片段3
线性化载体
Step 2: 目的DNA片段扩增 重组载体 Step 3: 一次In-Fusion连接反应
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•
克服传统克隆技术的限制
克服其它克隆技术的限制
其它克隆技术的限制
•载体的限制 •不同克隆试剂盒都需要与之匹配的载体 •必须使用提供的载体
Q3.载体和插入的DNA片段的长度有限制吗？
A3.没有特别的限制。载体和插入的DNA片段即使超过10 kb也可以进 行连接反应，只是连接效率会有所降低。插入的DNA片段只要不少 于50 bp就可进行有效的连接反应。
Q4.线性化载体末端是否需要进行去磷酸化处理？
A4.线性化载体末端磷酸基团的存在与否不会影响In-Fusion连接效率。 因此，不需要对线性化载体进行去磷酸化处理。
In-Fusion不受限制性酶切位点的限制，因此在目的 片段及使用的载体中是否存在合适的酶切位点并不妨 碍克隆。
In-Fusion能够在一次反应中同时克隆多个片段，无 需进行亚克隆。
In-Fusion系统能够高效克隆0.05-15 kb DNA片段。
In-Fusion是基因定向克隆技术，因此无需进行目的 基因片段正确插入的克隆的筛选。
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In-Fusion®克隆技术的优点
1 简便、快速、高效的克隆技术 2 不附加任何多余序列 3 不受限制性内切酶酶切位点的限制 4 可同时克隆两个或多个DNA片段
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简便、快速、高效的克隆技术
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8/16/2020
•
简便、快速、高效的克隆技术
In-Fusion HD无论是克隆长基因片段还是克 隆多个基因片段都能保持较高的克隆效率。
In-Fusion是无缝克隆：不附加任何多余碱基序列。 In-Fusion技术已经成功用于多项高通量克隆工程。
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•
In-Fusion®克隆技术的应用
多片段克隆 插入突变位点
构建载体模型 高通量克隆
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8/16/2020
•
应用实例
实例：多个DNA片段（1 kb, 2 kb, 3 kb)同时克隆
•必须进行限制性内切酶酶切和连接 •需要独一无二、兼容的酶切位点 •极少的合适酶切位点
•亚克隆繁琐 •多片段不能同时克隆
•对于大片段克隆效率较低 •对于插入片段有限制
•非定向克隆需要筛选目的片段插入方向 正确的克隆
•会附加多余碱基序列
•不适合中型和大规模克隆工程
In-Fusion解决方案
只要载体末端和插入片段末端具有15个同源碱基， In-Fusion就可以将任意PCR片段插入任意线性化载 体中。
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8/16/2020
•
不附加任何多余序列
A 克隆位点
C
任意载体
线性化载体
B 目的DNA片段
不需要的碱基序列
PCR扩增
引物设计
与载体相同的 15 个碱基 序列
不附加任何多余序列 的重组载体
In-Fusion 连接反应15 min
无缝克隆： 不附加任何多余序列
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不受限制性内切酶酶切位点的限制
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8/16/2020
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引物设计及目的基因片段扩增
引物的5’末端必须包含与载体末端相同的15个碱基序列 引物的3’末端必须包含与目的基因片段相互补的特异碱基序列
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载体线性化
PCR扩增
酶切处理
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8/16/2020
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In-Fusion连接反应
线性化载体
目的基因片段
Cloning Enhancer处理，37 ℃ 15 min， 80 ℃ 15 min
In-Fusion
克隆技术介绍
• 宝日医生物技术（北京）有 限公司
8/16/2020
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基因克隆背景简介
TA克隆 限制性酶切克隆
平滑末端克隆
缺点：连接效率低 耗时较长 需要特定限制性酶切位点
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8/16/2020
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In-Fusion克隆产品
In-Fusion® HD Cloning System
任意载体 任意基因片段
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8/16/2020
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附带Cloning Enhancer的相关产品
In-Fusion® HD Cloning Kit w/ Cloning Enhancer (639633/34/35)
Cloning Enhancer的作用：
消除PCR反应液中的引物二聚体和dNTP等的影响 无需对PCR产物进行胶纯化 操作简单
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8/16/2020
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基础款相关产品
In-Fusion® HD Cloning Kit（ 639648/49/50)
组分
5X In-Fusion HD Enzyme Premix pUC19 Control Vector, linearized (50 ng / μl) 2 kb Control Insert (40 ng / μl)