图位克隆

植物基因分离的图位克隆技术
传统的基因功能克隆、表型克隆方法具有 基因表达产物不清楚，难以进行相关基因 分离等缺点。 目前，图位克隆技术日渐成熟，已成为分 离基因的有效方法，并在分离不同的植物 基因中得到了广泛的应 用。
目前，克隆基因的途径有2 种：正向遗传学(forward genctics)和反向遗传学(reverse genctics)途径。 前者是依据目的基因所表现的功能为基础，通过鉴 定其产物或某种表型突变而进行的；后者则着眼于 基因本身，通过特定的序列或在基因组中的位置进 行。传统的功能克隆(functional cloning)属于前者范 畴，它是根据已知基因的产物反推其核苷酸序列抗 体，从表达载体构建的cDNA 中筛选相应克 隆，进而分离目的基因。
表型克隆技术都普遍存在着依赖 于PCR 技术、重复性较差、假 阳性率高、对实验材料要求较高、 材料间不能存在过多的差异、结 果不便确证等缺点。
近年来，反向遗传学的建立， 为分离未知产物的基因提供 了越来越多的策略和思路。 如最常用的基因克隆技术有 图位克隆和转座子标签技术 就是基于反向遗传学原理发 展起来的。
析法(bulk segregant analysis, BSA)。
近等基因系是指只有目标性状基因有差异，其 它性状基因相同的2个群体，可以通过连续回交 的途径获得。由于近等基因系需要连续的回交， 所需的时间较长，Michelmore等(1991)提出了 群组分离分析法，将分离群体中研究的目标性 状根据其类型(如抗病、感病)分成2组，将每组 内一定数量的植株DNA 等量混合，形成 2个池，这2 个池仅在目标性状(如抗病性)上有 差异。
混合样品作图 是指在准确鉴定目的基因表型（单基因控制的隐性 突变）的基础上，把大群体中单株突变体分成若干 组（通常5 个单株一组），以组为单位提取DNA，形 成一个混合的DNA 池，用目的基因附近所有的分 子标记对混合的DNA 池进行分析，根据所有池中 的分子标记与目的基因发生的重组数来确定与目 的基因连锁最紧密的分子标记及目的基因附近所 有分子标记的顺序。混合样品作图可以很大程度地 提高分子标记分析效率，减小DNA 提取的工作量， 有利于扩大群体。
物理图谱是真正意义上的基因图谱，因为分子标
记与目的基因之间的实际距离是按碱基数(bp)来计算的，它会 因不同染色体区域基因重组值的不同而造成与遗传距离的差 别。因此，物理图谱的构建也是图位克隆技术一个至关重要 的环节。物理图谱的种类很多，从简单的染色体分带图到精 细的碱基全序列都是物理图谱。最为常用的物理图谱有限制 酶切图谱、跨叠克隆群和DNA 序列图谱等。目前利用 稀有切点内切酶结合PEGE 技术已成功用于植物基因组的大 规模物理作图，从而可以确定连锁标记与目的基因间的实际 物理距离的大小，为基因的克隆奠定了基础。
2.4 目的基因的筛选和鉴定
筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个 关键环节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分 子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后， 就可以利用该克隆为探针进行染色体步移，逐渐 靠近目的基因。
染色体步移是指利用已知的阳性克隆称为 “二次克隆”，如此反复即可取到所需要的克隆，获 得目的基因。染色体步移的主要局限在于当必须经过 一个无法克隆的片段时，步移的过程会被打断；当克 隆的一端是重复序列时，步移的方向会发生偏差。为 克服这些弊端，Tanksley 等(1995)又发展了染色体登 陆的方法。
染色体登方法可很快将土豆的pto基因分离出来。 另外还有染色体跳步和染色体连接等方法。在与 目的基针通过菌落杂交，蓝、白斑挑选的方式筛选基 因组而获得可能含有目的基因的阳性克隆。
SSLP 是基于PCR 的分子标记，检测比较直接，只
需要通过设计引物便可检测假定的SSLP 标记；对 SNPs 标记的检测也比较直接，它是不同生态型之间
基因组中的单个核苷ers et al., 2003)。最常见的 用于检测SNPs 标记的方法主要是剪切扩增多态性
在用覆盖目的基因区域的大片段基因组DNA 克隆筛选区域特异的cDNA 后，仍需对目的 基因编码的cDNA 作进一步证实。现有证实 目的基因编码的cDNA 克隆的方法有: 1) 精细 作图来证实某候选基因克隆与目标性状共分 离; 2) 证实某候选基因克隆的时空表达模式与 目标性状的表现相同; 3) 把候选基因序列与现 有已知功能基因序列数据库进行同源性比较， 推断其功能; 4) 比较候选基因序列在野生型与 突变型之间的差异，确定在二者之间变异的 cDNA 序列; 5) 转化候选基因，进行遗传互补 实验，这是最直接、最终鉴定基因的方法。
2 图位克隆的技术环节
2.1 筛选与目的基因紧密连锁的分子标记
实质上，分子标记是一个特异的DNA 片段或能够检出的等位 基 因，精确的分子标记能够极大地提高图位克隆的效 率。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的 筛选，包括有：RFLP 标记、RAPD 标记、AFLP 标记、 SSLP 标记、SSR 标记、SNP 标记等。其中最为常用 的是简单序列长度多态性(SSLPs) (Lukowitz et al., 2000; Choe et al., 2002; Gonzalez-Guzman et al., 2002) 和单核苷酸多态性(SNPs)
2.2 目的基因的定位
目的基因的定位分为初定位和精细定位。目的 基因的初定位(mapping the target gene)是利用分子
标记技术在一个目标性状的分离群体中把目的基
因定位于染色体的一定区域内。初定位通常使用近 等基因系法(near-isogenic lines, NILs)或群组分离分
2.粒是一种含有噬菌体的Cos 位点的质粒载 体， 大小在5~7Kb 左右， 可高效地克隆25~35Kb 的DNA 片段。人工染色体的插入片段最长可达 2Mb 左右，能够覆盖完整的真核基因，最早发展 的人工染色体是YAC。所以当要克隆大片段DNA 时，需要YAC 作载体。以YAC 为载体，可将 300~1 000Kb 的DNA 片段克隆。因此，以YAAC、PAC 等几 种以细菌为寄主的载体系统。
1 图位克隆技术的原理
功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座， 在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础 上，用id 等)，从 而构建基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱 通过染色体步移(chromosome walking) 逼近目的 基因或通过染色体登陆(chromosome landing) (Tanksley et al., 1995)方法最后找到包含有该目 的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基 因功能。
在初步定位的基础上，接下来就要利用高密度 的分子标记连锁图对目的基因区域进行区域高密 度分子标记连锁分析以便精细定位(fine mapping)目 的基因。精细定位目的基因是图位克隆策略中最艰 苦和最耗时的限速步骤。精细定位通常采用的方法 是侧翼分子标记或者混合样品作图。
侧翼分子标记 是指利用初步定位的目的基因两侧的分子标记，鉴 定更大群体的单株来确定与目的基因紧密连锁的 分子标记，Dixon 等(1995)利用该方法已成功的将 番茄的叶霉病基因精细定位到40Kb 的区间。由 于侧翼分子标记需要对单个植株进行分析，工作效 率比较低，因此Churchill 等(1993)提出混合样品作 图的方法进行目的基因的精细定位。
一旦把目标基因定位在某染色体的特定区域后，接下来 就要对其进行精细的作图。目前，作图的类型可分为2 类，分别是遗传图谱和物理图谱。
遗传图谱对图位克隆非常重要，尤其是精细的遗传图 谱。增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的 基础，可以通过整合已有的遗传图谱，或者是寻找 新的分子标记来实现。现在，业已建图的植物已多 达几十种，其中几乎包括了所有重要的农作物，如 玉米、番茄、水稻、小麦、大麦、燕麦、大豆、高粱、油 菜、马铃薯等。由于许多科学家的共同努力和连年 的工作积累，已有越来越多生物的遗传图谱趋于饱 和，如水稻已有2 275 个分子标记的图谱，覆盖基因 组的1 512.6cM，这就为其物理图谱的构建奠定了 基础。
谢谢
序列(CAPS)，它也是基于PCR 的。
另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS (dCAPS) (Michaels and Amasino,1998; Nam et al., 1989)可把任何已知的点突变 作为分子标记，只要在PCR 时引入不配对 的引物，使扩增的序列在一个生态型中具 有限制性酶切位点，而在另一生态型中没 有，以形成多态性。
利用分子标记技术寻找2 个池的扩增谱带的差 异，这种多态性极可能与目标基因连锁。再用所有 的分离后代单株，验证该多态性是否真正与目标基 因连锁及连锁距离的确定。如果分离群体不易获 得，可采取混合样品法。以抗病性为例，即尽可能 地把所有的抗病品种的DNA 等量混合，作为1 个基 因池；把所有的感病品种的DNA 等量混合，作为1 个基因池，对2 个基因池的DNA 多态性进行分析。