水稻基因的图位克隆技术
图位克隆的基本原理和方法常用资料
第五章第四节：植物数量性状QTL图位克隆方法剖析
The advantages of the sequential QTL fine-mapping strategy
To reduce experimental errors caused by both environmental factors and genetic background noise
K.Fengler et al., in press, Plant Genome
QTL精细定位—性状的准确鉴定
➢ 通过控制群体结构和后代测定等手段来消除遗 传背景的影响，同时增加重组机会。在目标 QTL区间建立高分辨率的分子标记图谱，分析 目标QTL与标记的连锁关系。
➢ 主要采用近等基因系(Near-isogenic lines, NILs) , 染色体片段代换系(chromosome segment substitution lines，CSSLs)或导 入系(introgression line, ILs), 及基于重组自 交系衍生的杂合自交家系(heterogeneous inbred family, HIF)或剩余杂合体(residual heterozygous line, RHL) 。
➢ 染色体不同区域重组频率的高低与着丝粒位置、 染色体结构、亲本在QTL区域的序列差异等均相 关。
玉米染色体的重组频率和基因密度分布
MZA Count Genetic Distance (cM)
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
0
0
300 250 200 150 100 50 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 Physical Distance (bands)
农业生物实用技术试题(参考答案)
农业生物实用技术试题1.请阐述细胞全能性与植物组织培养的关系。
（10分）答：植物细胞全能性（totipotency）：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。
在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。
植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。
植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。
器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
2.原生质体杂种细胞的筛选方法。
（10分）答：杂种细胞的筛选方法有：①细胞系互补的选择方法，包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补和抗性互补等；②利用物理特异性差异的选择方法：这是利用两个原生质体物理特异性差异的一种选择，包括原生质体的大小、颜色、浮密度等的不同来选择；③利用生长特异性差异的选择方法。
3. 简单说明DNA重组技术中的蓝白斑筛选原理。
（10分）答：蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。
现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA 的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。
在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。
因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。
这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。
水稻光壳基因gl-1的图位克隆和功能初探
目录摘要： (1)Abstract： (1)一、前言 (2)（一）研究意义 (2)（二）国内外研究现状 (2)1、水稻基因组的测序为基因的图位克隆提供了条件 (2)2、水稻光壳基因的研究进展 (2)二、实验内容及步骤 (4)（一）实验内容 (4)1、水稻光壳基因gl-1的7个候选基因测序 (4)（二）实验步骤 (4)1、取材 (4)2、PCR (4)3、电泳：扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳 (5)三、结果及分析 (5)（一）结果 (5)（二）分析 (6)摘要：光壳稻是世界稻种资源中的重要组成部分，本项目组从来源于美国光壳稻品种“Star bonnet 99”的以华粳籼74为背景的单片段代换系（SSSL）鉴定出1个控制稻谷光壳性状的基因gl-1, 并将其候选区域界定在35.9kb的物理区域内，共包含7个候选基因。
本项目拟在此工作的基础上，通过对7个候选基因进行测序分析，将候选基因范围缩小到2个，为进一步确定目标基因，进而为了解水稻稃毛发育的遗传基础、探明水稻稃毛发育的分子机理和有效利用光壳稻资源奠定基础。
关键词光壳稻图位克隆稃毛发育基因测序Fine mapping and candidate gene analysis of gl-1, a gene controlling trichomeformation in rice（Xiaoyu Zhao, Yu Dai, Yue Chen）（College of Agriculture, South China Agricultural University）Abstract：Glabrous rice is an important ingredient of world seed rice resources. In our study, we identified gl-1gene, which controls trichome formation in rice leaves and hulls, from a single segment substitution line (SSSL) derived from crosses by using HJX74 as the recurrent parent and Star bonnet 99 as the donor. Fine mapping and high-resolution linkage analysis were carried out, and the gene was localized to a 35.9 kb genomic region that contains seven annotated genes according to the genome sequence of japonica Nipponbare. By sequencing the seven candidate genes, we narrowed down the candidate genes from seven to two, greatly promoting the final successful cloning of this gene, elucidating the mechanisms of trichome formation in rice and facilitating its utilization in agriculture.Key words Glabrous rice; Fine mapping; Trichome development; Gene sequencing一、前言（一）研究意义光壳稻是世界稻种资源中的一个重要组成部分，我国的云贵高原、印尼爪哇和非洲都有原始品种（严宗卜，1998）。
文档图位克隆原理及应用
位克隆技术的原理及其在分离玉米基因中的应用刘朝显2010.11.3 2 内容摘要图位克隆技术的基本原理1 图位克隆的技术环节 2 图位克隆在分离玉米基因中的应用 3 一. 图位克隆技术的基本原理 1. 图位克隆（Map-based cloning）: 定位克隆（position cloning）,1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出。
正常遗传学 2. 基本原理：根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，通过染色体步移(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基因功能。
3 3. 图位克隆技术的优越性与局限性优点：不需要事先了解目的基因的表达产物，这为克隆许多有重要经济价值的农作物基因提供了有效的手段，因为这些基因的产物大多都是未知的。
缺点：基因组中的重复序列导致染色体步移困难，甚至将步移引入歧途。
4 一. 图位克隆技术的基本原理 4. 图位克隆示意图 5 一. 图位克隆技术的基本原理M1 M2 Gene 连锁标记的筛选M1 M2 Gene 初定位M3 M2 Gene 精细定位M3 M4 M5 M6 M7 M8 合成探针筛选基因组文库转基因功能验证BSA，NIL 300左右5000左右二. 图位克隆的技术环节 6 1.定位群体的构建⑴亲本选择原则:选择高度纯合，遗传差异大，DNA多态性丰富的亲本（实现基因精细定位的重要前提）可选用多个亲本进行多态性筛选⑵定位群体的组配：基因的定位是基于分离后代中交换单株出现的频率大小而实现的，因此组配一个遗传信息多群体大小适中的分离群体尤其重要。
BC1,F2 非永久性群体群体类型RIL,DH，NIL 永久性群体 2. 初定位(玉米：100-350株) 近等基因系（near-isogenic line,NIL ）法: 近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体, 这可通过连续回交的途径获得。
图位克隆的基本原理和方法
r/r
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P1 纯合突变体
×
P2 ZS97
F1
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F2
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R/r
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primary mapping method
Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分 离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、 感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个 体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗 病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间 理论上就应主要在目标基因区段存在差异。
精细定位
• 扩大群体，进行精细定位
Complementation test
找到候选基因后可对候选基因进行分析以排除非目标基因， 可以通过比较扩增，测序，表达量检测及目标性状相关的 生化和生理途径等方法来排除。当然最后要说明问题的话 就是构建互补载体做一个互补验证。
将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标 记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
HL15(M )
HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M ) HL15(W ) ZS97
ZH11
HL15(M) HL15(W) HY5(M) HY5(W) HY3(M) HY3(W) HY2(M) HY2(W) HY1(M) HY1(W) ZS97 ZH11
图位克隆的基本原 理和方法
何宗顺 2011.12.7
图位克隆的基本原理
其基本的原理是： 功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，通过找到 与目标性状紧密连锁的分子标记，在利用分子标记技术对 目的基因精细定位的基础上，由于水稻全基因组序列的发 布，我们可以得到已定位区段的候选基因，通过对候选基 因进行分析，确定目标基因，最后经遗传转化试验证实目 的基因功能。
自然变异基因GS5在调控水稻粒形和产量方面有重要作用
⾃然变异基因GS5在调控⽔稻粒形和产量⽅⾯有重要作⽤⾃然变异基因GS5在调控⽔稻粒形和产量⽅⾯有重要作⽤摘要：提⾼作物产量是植物科学研究的重要⽬标之⼀。
粒型是⽲本科作物产量的⼀个重要决定因素，同时也是驯化和⼈⼯育种的⽬标性状之⼀。
我们发现，⽔稻数量性状位点GS5，能够通过调控粒宽、灌浆和粒重，⽽控制粒型。
GS5编码⼀个推测存在的丝氨酸羧肽酶，并且对粒型产⽣正调控。
因此，GS5的⾼表达和粒型变⼤有密切关系。
对来⾃不同地域的51份⽔稻材料的启动⼦区域进⾏测序，我们鉴定出三个可能和粒宽有关系的单模标本。
结果表明，GS5的⾃然变异导致⽔稻粒型的多样化，这可能对提⾼⽔稻和其他作物的产量产⽣作⽤。
近年来，包括分蘖、穗粒数和粒重在内的许多⽔稻产量性状基因（或数量性状位点），已经通过图位克隆的⽅法得到分离。
这些基因通过不同时期表达、不同的⽣化途径和不同的作⽤来调控数量性状和发育进程。
基因的分⼦特征影响粒型（如GS3, GW2和qSW5/GW5），表明许多基因是对粒型进⾏负调控的。
因此，野⽣型等位基因和⼩粒相关联，⽽突变体和⼤粒相关联。
通过研究珍汕97和H94杂交构建的DH群体，我们在第5染⾊体短臂上RM593 和RM574标记之间，发现了⼀个数量性状位点GS5（见表1），其来⾃于珍汕97的等位基因可以增加产量性状。
这个区域和我们早期的结果⼀致。
为了精确定位GS5 ，我们⽤DH27和珍汕97回交三次（DH27是⼀个含有来⾃H94的RM593–RM574之间的染⾊体⽚段，并且55%的遗传背景来⾃珍汕97）。
⾃花授粉的BC3F1植株杂合⼦，产⽣两个BC3F2群体（群体1包含4373株个体，群体2包含5265株个体），并在2005年到2006年种植于中国海南。
在群体1中，我们鉴定出94个RM593 和RM574间的重组体，它们在GS5座位的基因型于2006年夏天在武汉，通过后代测验确定。
分析群体2，在C35和RM574间发现15个重组体。
图位克隆的基本原理和方法-PPT课件
将构建的BSA池分别用本室的255对在亲本ZH11/ZS97间存在多态性的SSR标 记进行PCR扩增，经过跑PAGE胶找到与目标性状紧密连锁的标记。
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HL15(M ) HL15(W ) ZS97
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HL15(M) HL15(W) HY5(M) HY5(W) HY3(M) HY3(W) HY2(M) HY2(W) HY1(M) HY1(W) ZS97 ZH11
找到紧密连锁的分子标记之后我们就要进行一个“阳性”检测： 即检测这个找到的分子标记是不是真正的与目标性状连锁。 我们对F2代群体中随机选取一个200左右的小群体，将找到的分 子标记分别扩增这些样，看表型与基因型是否对应。 同时我们可以用这个小群体进行一个初步的基因定位。
9
一. 表型观察
Fine mapping
4
作图群体
将纯合突变体与ZS97进行杂交，对杂交的种子进行基 因型鉴定，找到杂合型种子（即种子能够发生分离）， 将杂合F1代种子种下去后就能得到F2代群体。
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P1 纯合突变体
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primary mapping method
Bulked Segregment Analysis：群组分离分析法。原理是将分 离群体(F2、BC1等)中的个体依据研究的目标性状(如抗病、 感病)分成两组，每一组取样8-15份，在每一组群体中将各个 体DNA等量（等浓度等体积）混合，形成两个DNA池(如抗 病池和感病池)。同时需要构建两个亲本（ZH11/ZS97）的 BSA池。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池间 理论上就应主要在目标基因区段存在差异。
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水稻基因的图位克隆技术吴自明(江西农业大学,作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室,农业部双季稻生理生态与栽培重点实验室,江西省作物生理生态与遗传育种重点实验室,江西南昌330045)摘要 综述了水稻图位克隆技术的原理、技术环节及其在水稻基因克隆上的应用,分析了当前存在的主要问题,并对其应用前景作出了展望。
关键词 水稻;图位克隆;基因中图分类号 S 511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2008)34-14905-02Map based C lo ning T echnique of R ice Genes WU Zi m ing (Key Laboratory of C rop Ph ysiology,Ecol ogy and Genetic B reeding,Mi nistry of Ed ucation,Key Laboratory of Ph ysiology,Ecology and C ultivati on of Double C roppin g Rice,Mini stry of Agriculture,Key Lab oratory of Crop Physi ology,Ecology an d Genetic Breedin g of Jian gxi Province,Jiangxi Agricultural Uni versi ty,Nanchang,Jiangxi 330045)Abstract The p rinciple an d tech nical links of m ap based gene cloni ng techniq ue i n rice an d its applications in the gene cloni ng of rice were s um ma rized .And the mai n existing problems at present were analyzed .And its applicati on foregrou nd was p redicted.Key w ords Rice;Map based cloni ng;Gene基金项目 江西省教育厅项目(GJJ09477);江西农业大学博士启动基金;江西农业大学校自然科学基金。
作者简介 吴自明(1974-),男,江西鄱阳人,副教授,从事植物分子生物学研究。
收稿日期 2008 10 06近年来,水稻基因组研究进展非常迅速,高密度遗传图谱和物理图谱的构建,全基因组序列的公布,数以万计ES T 、全长c DN A 等序列及功能分析数据的释放以及新型水稻分子标记及其高效检测技术的发展等,为基因的图位克隆带来了新的思路和方法。
同时,这些新的进展也能够使基因的精细定位和物理图谱构建等相关工作大大简化,使基因的图位克隆朝着更加简便、快速的方向发展。
1 图位克隆技术原理图位克隆(Ma p based Cloning)又称定位克隆(Positional Cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan Co ulson 提出[1]。
用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行,无需预先知道基因的D N A 序列,也无需预先知道其表达产物的有关信息,而是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。
实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。
近几年来,水稻各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的日趋完善,在很大程度上得益于以粳稻日本晴和籼稻9311为代表的基因组测序的完成[2-3]。
目前已有几十种技术可用于分子标记筛选,其中最常用的是简单序列长度多态性(SSLPs)、单核苷酸多态性(SNPs)和插入缺失多态性(Inser tio n/Deletio n,InDel)[4-7]。
Shen 等利用日本晴和9311基因组序列构建了水稻基因组水平的D NA 多态性数据库,其中包括1703176个单核苷酸多态性(Single Nucleo tide Polymor phis m,SNP)和479406个插入缺失多态性(InDel)[8]。
Fe ltus 等通过对除去多重拷贝序列及低质量序列后的日本晴和9311基因组草图的比对分析,得到408898个D N A 多态性,包括SNP 和单碱基I nD el [9],这些差别的核苷酸通常位于非编码区[10]。
目前,常把SNP 多态性转化成基于P CR 的剪切扩增多态性(Cle ave d Amplified P olymorphic Se que nc es,CAPS)或CAPS 衍生的dCAPS 标记[11-12]。
CAPS 标记是PCR 反应和酶切相结合产生的一种分子标记。
如果不同材料间在PCR 扩增区域有S NP 位点,且该位点是限制性内切酶作用位点,那么不同材料的PCR 扩增产物经特定的酶切后,再进行琼脂糖凝胶电泳就会表现多态性。
当SNP 恰好位于限制性酶切位点比较少时,这种情况可以在CAPS 标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基,则可以结合SNP 位点引入新的限制性内切酶作用位点,产生和CAPS 标记类似的多态性,这就是dCAPS 的方法。
用CAPS 或dCAPS 的方法则可以将几乎所有的SNP 位点转化成以P CR 为基础的分子标记[12]。
2 图位克隆技术环节2.1 构建遗传作图群体 对于基因图位克隆而言,构建特殊的遗传作图群体是筛选与目标基因紧密连锁分子标记的关键环节。
常用的作图群体有F 2、近等基因系、重组自交系等群体,水稻常用F 2群体。
创建F 2群体应注意优先选择基因组已测序的日本晴、9311和培矮64S 等品种为亲本之一。
2.2 基因初定位 一般说来,当标记为显性遗传时,欲获得最大遗传信息量的F 2群体,需借助于进一步子代测验,以分辨F 2中的杂合体。
为此,Mic helmo re 等发明分离群体分组分析法(Bulke d Se gre ga nt Ana lysis,BS A)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记[13]。
其原理是将目标基因的F 2(或BC)代分离群体各个体仅以目标基因所控制的性状按双亲表型分为2群,每一群中各个体D N A 等量混合,形成2个D N A 混合池(如抗病和感病、不育和可育),并且用目的基因附近的所有分子标记对混合D NA 样品池进行分析,根据所有池中包含有交换的DN A 池的比例来确定与目的基因连锁最紧密的分子标记和目的基因附近所有分子标记的顺序。
混合样品作图可以极大提高分子标记分析效率,减小D NA 提取工作量。
2.3 基因精细定位 一旦把目标基因初步定位在2个标记之间后,就可以从国际水稻基因组测序计划(IRG SP)公布的序列中下载这2个标记区域的部分P AC/BAC 克隆序列。
利用软件SSRI T 搜索克隆序列中的微卫星序列,然后选择合适的微卫星序列进行特异PCR 引物的设计。
也可以直接借助于公共数据库的序列进行比较,如寻找R GP 基因组数据库(粳稻)与中国华大基因组数据库(籼稻)的单核苷酸多态性(SNP)序列差异,设计CAPS 或dCAPS 标记和插入/缺失多态安徽农业科学,J ou rn al of An hui Agri.Sci.2008,36(34):14905-14906 责任编辑 张彩丽 责任校对 张士敏性标记(I nDel)等。
利用这些标记对大群体进行分析,可以迅速地将目标基因范围缩小到一个很小的基因组区域。
2.4 功能互补验证 完成基因精细定位后,可以根据已有的与目标基因紧密连锁的分子标记,找到目标基因在已公布的R GP物理图谱上的位置,通过序列拼接,实现目标基因区域遗传图谱和物理图谱的电子整合,得到该区域的基因组序列,从而减少文库构建、筛选等繁重的工作,加速图位克隆进程。
从一系列侯选基因中鉴定目标基因是定位克隆技术的最后一个关键环节。
一种找到突变基因的有效方法是测序,通过设计PCR引物来扩增覆盖最小目标区域的多个重叠片段。
将这些片段测序后拼接起来以得到整个目标区域的序列,然后将它与野生型的序列进行比对,就可以找到这个区域中的目标基因。
现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆,如B AC克隆或Y AC克隆去筛选cD NA文库,并查询生物数据信息库,待找出侯选基因后,把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因: 精确定位法检查c DN A是否与目标基因共分离;检查cD NA时空表达特点是否与表型一致;!测定c D NA序列,查询数据库,以了解该基因的功能;∀筛选突变体文库,找出D NA序列上的变化及与功能的关系;#进行功能互补试验,通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。
功能互补试验是最直接的最终鉴定基因的方法。
利用新兴的R NA干扰技术(R NAi)也可有效地确定目的基因。
3 图位克隆技术的应用水稻高精密遗传图谱和物理图谱的相继构建成功[14],尤其是全基因组测序结果的公布[2-3],为水稻基因的精细定位以及后续的图位克隆创造了优越的条件。
截至2006年11月,Oryzabase网站(http://www.shi gen.ni g.ac.jp)公布了约2356个水稻突变体(含数量性状基因)。
自1995年应用图位克隆技术在水稻中成功分离出Xa21基因以来,已克隆了50多个水稻突变体基因,其中包括我国克隆的MOC1、BC1、ALK、GH2、GS3和ygl1等基因。
4 问题与展望图位克隆过程中常会遇到许多问题,使工作难以进行。
首先,在分析自然发生的变异时,最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状由不止一个基因位点控制,这样很难或者不能通过图位克隆技术来克隆基因。
对这些基因中的任何一个位点精细定位都要求降低作图群体的遗传复杂性,通过高代回交创造只有一个位点保持多态性的重组近交系;其次,表观遗传是图位克隆工作中又一个可能遇到的复杂情况。
表观遗传是描述一个基因在表达和功能上的可遗传改变,而不涉及D NA序列的改变[15]。
已有文献证明花发育基因SU PER M AN衍生的clar k kant等位基因是可遗传的,在SU PERM A N基因的D NA序列中都具有相似的胞嘧啶甲基化现象,能减少SU PERM A N基因转录子的表达,但能被带有SU PERM A N基因的转基因所恢复[16]。
目前,对于这种表观遗传突变产生的原因以及出现的频率研究较少;最后,位于或接近着丝粒区域限制了图位克隆进程。
通常染色体上位点的物理和遗传距离的比值变化较小,对作图影响较小[17]。
然而着丝粒附近较小的重组率严格限制了精细定位。
在这个区域中重复D N A单元的广泛分布使研究者很难辨认出散布的单拷贝序列,这些单拷贝序列能产生有疑问的遗传标记。