第五章第四节：植物数量性状QTL图位克隆方法分析
图位克隆的基本原理和方法常用资料
第五章第四节：植物数量性状QTL图位克隆方法剖析
The advantages of the sequential QTL fine-mapping strategy
To reduce experimental errors caused by both environmental factors and genetic background noise
K.Fengler et al., in press, Plant Genome
QTL精细定位—性状的准确鉴定
➢ 通过控制群体结构和后代测定等手段来消除遗 传背景的影响，同时增加重组机会。在目标 QTL区间建立高分辨率的分子标记图谱，分析 目标QTL与标记的连锁关系。
➢ 主要采用近等基因系(Near-isogenic lines, NILs) , 染色体片段代换系(chromosome segment substitution lines，CSSLs)或导 入系(introgression line, ILs), 及基于重组自 交系衍生的杂合自交家系(heterogeneous inbred family, HIF)或剩余杂合体(residual heterozygous line, RHL) 。
➢ 染色体不同区域重组频率的高低与着丝粒位置、 染色体结构、亲本在QTL区域的序列差异等均相 关。
玉米染色体的重组频率和基因密度分布
MZA Count Genetic Distance (cM)
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100
0
0
300 250 200 150 100 50 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 Physical Distance (bands)
数量性状的分子标记(QTL定位的原理和方法讲义)
数量性状的分子标记(定位的原理和方法讲义)作物中大多数重要的农艺性状和经济性状如产量、品质、生育期、抗逆性等都是数量性状。
与质量性状不同，数量性状受多基因控制，遗传基础复杂，且易受环境影响，表现为连续变异，表现型与基因型之间没有明确的对应关系。
因此，对数量性状的遗传研究十分困难。
长期以来，只能借助于数理统计的手段，将控制数量性状的多基因系统作为一个整体来研究，用平均值和方差来反映数量性状的遗传特征，无法了解单个基因的位置和效应。
这种状况制约了人们在育种中对数量性状的遗传操纵能力。
分子标记技术的出现，为深入研究数量性状的遗传基础提供了可能。
控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座（）。
利用分子标记进行遗传连锁分析，可以检测出，即定位（）。
借助与连锁的分子标记，就能够在育种中对有关的的遗传动态进行跟踪，从而大大增强人们对数量性状的遗传操纵能力，提高育种中对数量性状优良基因型选择的准确性和预见性。
因此，定位是一项十分重要的基础研究工作。
年，等发表了第一篇应用连锁图在番茄中定位的论文。
之后，随着分子标记技术的不断发展以及许多物种中分子连锁图谱的相继建成，全世界出现了研究的热潮，每年发表有关研究的论文数量几乎呈指数增长（图），显示了该研究领域的勃勃生机。
目前，定位研究已在许多重要作物中展开，并且进展迅速。
本章主要介绍定位的原理和方法。
图年期间国际上每年发表有关研究的论文的数量. 数据从英国信息系统检索得到第一节数量性状基因的初级定位定位就是检测分子标记（下面将简称为标记）与间的连锁关系，同时还可估计的效应。
定位研究常用的群体有、、和。
这些群体可称为初级群体（）。
用初级群体进行的定位的精度通常不会很高，因此只是初级定位。
由于数量性状是连续变异的，无法明确分组，因此定位不能完全套用孟德尔遗传学的连锁分析方法，而必须发展特殊的统计分析方法。
年代末以来，这方面的研究十分活跃，已经发展了不少定位方法。
一、定位的基本原理和方法孟德尔遗传学分析非等位基因间连锁关系的基本方法是，首先根据个体表现型进行分组，然后根据各组间的比例，检验非等位基因间是否存在连锁，并估计重组率。
植物基因的图位克隆
植物基因的图位克隆关键词：植物基因、图位克隆、基因功能、实验流程、挑战与解决方案引言随着生物技术的不断发展，对植物基因功能的研究已成为农业、生态学等领域的重要课题。
图位克隆技术作为一种前沿的基因克隆方法，已在许多植物基因的研究中发挥重要作用。
本文将详细介绍植物基因图位克隆的技术原理、应用及面临的挑战和解决方案。
主体部分一、植物基因图位克隆的技术原理和应用植物基因图位克隆是一种基于基因组图谱的基因克隆技术，其基本原理是在基因组图谱中找到与目标基因相关的DNA片段，然后通过分子生物学方法克隆出该基因。
该技术在植物基因功能研究中的应用主要体现在以下几个方面：1、揭示基因与表型特征之间的关系：通过图位克隆技术，科学家们可以克隆出与特定表型特征相关的基因，进而研究其功能和作用机制。
2、发掘抗逆基因资源：植物在逆境条件下常常表现出独特的适应性，图位克隆技术可以帮助我们克隆这些抗逆基因，为作物改良提供宝贵资源。
3、解析植物发育过程中的关键基因：通过图位克隆技术，可以克隆出植物发育过程中发挥关键作用的基因，深入研究其调控网络和作用机制。
二、植物基因图位克隆的实验流程和操作植物基因图位克隆的实验流程包括以下几个主要步骤：1、样本采集：根据研究目标和实验需求，采集不同类型和不同发育阶段的植物组织样本。
2、基因的筛选：利用生物信息学方法和基因组图谱，筛选出与目标表型特征或生理特性相关的候选基因。
3、定位分析：对候选基因进行定位，可以通过比较基因组序列、染色体构象信息等手段，确定目标基因在染色体上的位置。
4、基因克隆：根据定位结果，设计特异性引物，采用PCR等分子生物学方法，克隆出目标基因的完整序列。
5、功能验证：通过转录组分析、蛋白表达及互作等实验手段，验证目标基因的功能及其在植物生长发育和抗逆过程中的作用。
三、植物基因图位克隆的挑战和解决方案尽管植物基因图位克隆技术已取得许多突破性成果，但在实际应用中仍面临一些挑战，如基因表达水平低、基因组规模大等。
QTL精细定位和克隆的策略
QTL精细定位和克隆的策略QTL（Quantitative Trait Loci）精细定位和克隆是一种用于研究复杂性状遗传基础的策略。
QTL是指影响数量性状的基因或染色体区域，通过精细定位和克隆这些QTL，可以了解底层的基因机制以及其对数量性状的调控方式。
本文将介绍QTL精细定位和克隆的策略及其主要步骤。
1.QTL的初步定位：初步定位是通过建立遗传图谱或关联分析等方法，确定QTL所在的染色体区域。
常用的方法包括构建遗传连锁图和联合鉴定法。
遗传连锁图通过建立基因座之间的连锁关系，得到QTL大致所在的染色体区域。
联合鉴定法是基于多个遗传座的遗传效应与表型表达之间的关系，通过统计模型来确定QTL的位置。
2.QTL的精细定位：精细定位是在初步定位的基础上，进一步缩小QTL的定位区域。
常用的方法包括细分群体和QTL-候选基因关联分析。
细分群体是通过构建更多的染色体互换系或染色体片段替代系，并进行连锁鉴定，缩小QTL区域。
QTL-候选基因关联分析则是通过挖掘精密的关联信号，确定QTL所在的基因区域。
这些关联信号可以来自候选基因的DNA多态性标记或RNA表达水平等。
总之，QTL精细定位和克隆是一种通过缩小QTL区域，最终确定突变基因，揭示底层的基因机制的策略。
通过建立遗传图谱和进行关联分析等初步定位方法，缩小QTL的定位区域。
随后，通过细分群体和QTL-候选基因关联分析等精细定位方法，最终确定QTL所在的基因区域。
最后，通过基因克隆和功能验证，揭示QTL对数量性状的调控方式。
这些研究有助于深入理解数量性状的遗传基础，提高作物和动物的育种效率。
作物QTL分析的原理与方法
作物QTL定位方法与技术作物QTL定位的方法主要有传统连锁分析、基因芯片 技术和深度学习等。连锁分析通过群体遗传学手段，鉴定两个或多个基因位点 间的连锁关系，进而确定控制性状的QTL。基因芯片技术利用基因组wide的标 记分布，对大量基因位点进行同时检测，高效地定位QTL。深度学习则利用神 经网络等算法，自动化学习和识别数据中的特征，实现对QTL的精准定位。
四、自然群体
自然群体是指在没有人为干预下自然形成的群体，如野生种、地方品种、自然 变异群体等。这些群体通常具有丰富的遗传变异和复杂的遗传结构，对于研究 作物的适应性、抗逆性和产量等性状的遗传基础非常有用。此外，自然群体还 可以用于发现和克隆稀有或特殊的QTL。
五、基于基因组的作图群体
随着基因组学技术的发展，基于基因组的作图群体越来越受到重视。这种群体 可以通过重测序技术获得大量的SNP（单核苷酸多态性）标记，并利用这些标 记构建高密度的遗传图谱。这种图谱可以用于精细定位和克隆QTL，以及研究 基因组中的结构变异和非编码区基因组。
2、QTL分析的具体步骤
（1）数据采集：收集作物的基因型和表型数据。基因型数据可以通过高通量 测序技术获得，而表型数据则可以通过田间试验和室内分析等方法获得。
（2）作图：利用作图软件将基因型和表型数据组装成图，以展示它们之间的 关系。常用的作图软件包括QTL Cartographer、QTL IciMapping等。
原理
1、QTL的概念及定义
QTL是指作物基因组中控制数量性状的基因座位，它们可以通过影响表型变异 来影响作物的农艺性状。QTL通常分为两类：主效QTL和微效QTL。主效QTL是 指对表型变异起主要作用的QTL，而微效QTL则是指对表型变异起较小作用的 QTL。
图位克隆
序列(CAPS)，它也是基于PCR 的。
另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS (dCAPS) (Michaels and Amasino,1998; Nam et al., 1989)可把任何已知的点突变 作为分子标记，只要在PCR 时引入不配对 的引物，使扩增的序列在一个生态型中具 有限制性酶切位点，而在另一生态型中没 有，以形成多态性。
2.4 目的基因的筛选和鉴定
筛选和鉴定目的基因是图位克隆技术的最后一个 关键环节。当一旦找到与目的基因紧密连锁的分 子标记并鉴定出分子标记所在的大片段克隆后， 就可以利用该克隆为探针进行染色体步移，逐渐 靠近目的基因。
染色体步移是指利用已知的阳性克隆称为 “二次克隆”，如此反复即可取到所需要的克隆，获 得目的基因。染色体步移的主要局限在于当必须经过 一个无法克隆的片段时，步移的过程会被打断；当克 隆的一端是重复序列时，步移的方向会发生偏差。为 克服这些弊端，Tanksley 等(1995)又发展了染色体登 陆的方法。
2.粒是一种含有噬菌体的Cos 位点的质粒载 体， 大小在5~7Kb 左右， 可高效地克隆25~35Kb 的DNA 片段。人工染色体的插入片段最长可达 2Mb 左右，能够覆盖完整的真核基因，最早发展 的人工染色体是YAC。所以当要克隆大片段DNA 时，需要YAC 作载体。以YAC 为载体，可将 300~1 000Kb 的DNA 片段克隆。因此，以YAAC、PAC 等几 种以细菌为寄主的载体系统。
1 图位克隆技术的原理
功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座， 在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础 上，用id 等)，从 而构建基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱 通过染色体步移(chromosome walking) 逼近目的 基因或通过染色体登陆(chromosome landing) (Tanksley et al., 1995)方法最后找到包含有该目 的基因的克隆，最后经遗传转化试验证实目的基 因功能。
植物数量性状基因座(QTL)的作图与克隆
植物数量性状基因座(QTL)的作图与克隆
李宏;邱芬奇;李友莲
【期刊名称】《科技情报开发与经济》
【年(卷),期】2008(018)002
【摘要】从QTL定位方法以及QTL精细定位和克隆等方面对植物数量性状遗传进行了综述.
【总页数】3页(P145-147)
【作者】李宏;邱芬奇;李友莲
【作者单位】山西农业大学生命科学学院,山两太谷,030801;山西农业大学生命科学学院,山两太谷,030801;山西农业大学生命科学学院,山两太谷,030801
【正文语种】中文
【中图分类】Q343.1
【相关文献】
1.油菜N13和N18上含油量QTL作图区间相关候选基因克隆 [J], 邵珏;汪义龙;邵玉锁;曹明富;赵坚义
2.猪10号染色体上影响血常规指标的数量性状基因座(QTL)定位 [J], 张陈华;蔡绍倩;巩元芳;卢昕;殷宗俊;张勤
3.肉牛数量性状基因座作图进展 [J], 刘武艺;陈宏权
4.从数量性状基因座作图到标记辅助选择 [J], 唐辉
5.QTL作图在植物数量抗病性遗传研究中的应用 [J], 陈万权
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RIL
后代稳定，不发生分离，鉴定性状 以纯合株系为基础，准确性高。群 体准备周期长，只能估计加性效应。 早代多次互交，增加重组。
0/2:homozygous genotypes 1: heterozygous genotype
QTL精细定位的可行性
QTL是通过统计分析得到的，定位在染色体某 一置信区间内。增加分子标记和完善统计分析 软件，对置信区间的缩小并不是很有效。 精细定位，即在QTL初定位基础上，针对目标 区间构建遗传背景一致的次级遗传分离群体， 把复杂性状QTL界定于更小的基因组区域内。 将QTL作为一个主Mendelian因子来进行精细 定位。
300
Genetic Distance (cM)
250 200 150 100 50 0
MZA Count
QTL精细定位—性状的准确鉴定
通过控制群体结构和后代测定等手段来消除遗 传背景的影响，同时增加重组机会。在目标 QTL区间建立高分辨率的分子标记图谱，分析 目标QTL与标记的连锁关系。 主要采用近等基因系(Near-isogenic lines, NILs) , 染色体片段代换系(chromosome segment substitution lines，CSSLs)或导 入系(introgression line, ILs), 及基于重组自 交系衍生的杂合自交家系(heterogeneous inbred family, HIF)或剩余杂合体(residual heterozygous line, RHL) 。
公共亲本B73自交系 和25个核心自交系 的小斑病抗性
用NAM群体鉴定出了 29个QTL，抗性等位 基因用红色，感病等 位基因用绿色。
Poland J A et al. PNAS 2011;108:6893-6898
QTL精细定位
-确定QTL在基因组上的准确位置
在禾谷类作物中，许多影响重要农艺性状的QTL 已被定位，相比较而言，克隆到基因却非常少。 一般来讲，初定位的QTL置信区间在10-30cM， 包含几百个基因。不清楚QTL是对应一个基因？ 还是多个紧密连锁的基因? 如果对应有多个基因 ，基因的效应相同? 还是相反？是否累加? 等等 必需精细定位QTL，克隆对应的基因。
数量性状位点 (QTL)
Trait Locus (QTL)是生 物基因组上的某个区段，它含有一个 或多个基因，影响数量性状的变异。 QTL可以通过多态性分子标记与性状 的连锁关系而确定下来，即QTL定位 。
Quantitative
QTL初定位
-查找QTL在基因组上的大概位置
初定位的群体：连锁群体和关联群体： 连锁群体：人工群体，利用杂交过程中产生的重 组，通过分子标记多态性与性状变异的连锁关系 定位QTL。 关联群体：自然群体，利用进化或育种过程中所 积累的重组和变异，通过基因组中的连锁不平衡 （LD）来确定遗传多态性与性状变异的关系。缺 点：定位结果很大程度上依赖于群体结构和等位 基因频率。
QTL精细定位—关键重组个体
成功的QTL精细定位依赖于关键重组个体，也即 在目标QTL区域有高频率的染色体交换发生。 重组频率在染色体的不同区域变异很大，产生所 谓的重组热点和重组冷点区域。如QTL位于重组 热点，就易获得关键重组个体；不然就需要很大 的分离群体，或连续多代，或组配多个组合等方 法筛选。 染色体不同区域重组频率的高低与着丝粒位置、 染色体结构、亲本在QTL区域的序列差异等均相 关。
连锁群体的基因组结构和QTL初定位
连锁群体： 临时性分离群体：自交群体（如F2、F3） 和回交群体（BC1、BC2）等。 永久性分离群体：重组自交系群体(RIL)和 加倍单倍体群体(DH)等。 在分离群体基础上筛选的极端个体群体。
表型鉴定以单株或其后代家系为基 础，准确性不高，不能重复试验。 简单，遗传变异丰富，可以同时估 计加性和显性效应。
第五章第四节
植物数量性状位点 （QTL）图位克隆
数量性状变异的遗传基础
生物自然群体在形态、生理、行为和抗性 等性状上存在极大的变异，表现为数量性 状遗传。 数量性状涉及多个位点，每一位点的效应 微小，存在等位基因的变异，等位基因的 效应通过每个个体所处的环境表现出来。 P=G+E+G×E 当前生物学的一个重大挑战是明确数量性 状变异的遗传基础
QTL精细定位三要素
QTL精细定位决定于三个基本要素： 1) 高密度标记； 2) 关键重组个体； 3) 重组个体性状的准确鉴定。 目标：QTL--QTG--QTN Locus-Gene-Nucleotide
QTL精细定位—标记密度
基因组大规模重测序、SNP芯片、比较基因组学 等保证在目标基因区域获得高密度的分子标记。 禾谷类作物的基因组重测序产生了海量的SNP信 息，用于开发目标基因区域的高密度分子标记。 玉米的 HapMap 计划 (Gore et al. 2009)有160万 SNP。水稻中，Huang et al. (2010) 检测到360 万非冗余的SNP位点，平均 9.32 SNPs/kb。
玉米染色体的重组频率和基因密度分布
1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 Physical Distance (bands)
K.Fengler et al., in press, Plant Genome
F2群体QTL初定位
关联群体的基因组结构和QTL初定位
关联群体QTL初定位
连锁-关联群体的基因组结tics 2008;178:539-551
Diagram of genome reshuffling between 25 diverse founders and the common parent and the resulting 5000 immortal genotypes.