优选第四节植物数量性状图位克隆方法
植物基因克隆方法
RT-PCR实验中的常见问题与对策
问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑制剂，不要
加热超过45℃或pH超过8.0。
2）RNA中包含逆转录抑制剂 建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（白质具有抗原性及 生物活性，所以除核酸探针外，还可以用核酸类探针筛选的 目的基因的分离。
第22页，共46页。
1、差异杂交筛选（differential hybridization screening） 2、mRNA 差异显示( differential display)
（4）复制时两条模板链是在解旋酶的作用下局部打开双链，而PCR两 条模板链通过变性完全打开双链
（5）复制时两条链的合成是同步进行的，而PCR两条链的合成可能不 同步
（6）PCR的DNA聚合酶为耐热的DNA聚合酶，而复制的聚合酶一般不 耐热
（7）复制一般为双向复制，而PCR反应中DNA合成是单向的
（8）复制时由多种蛋白因子参与，而PCR只有DNA聚合酶参与
淀进行清洗。 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。
第10页，共46页。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法： 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）起始RNA量不够
建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链
cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 5）RNA模板二级结构太多
• 目前认为真核生物的转录起始需要转录因子的参与。这些转录因子 通常由一个DNA结合域（BD)和一个或多个与其他调控蛋白相互作 用的转录激活域（AD）组成。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋 白即是一种典型的转录因子。
高三生物(浙江选考)复习选考加试部分克隆技术
第35讲克隆技术浙江［学考＋选考]考纲确认考点知识内容加试二、克隆技术5.植物的克隆b 6。
动物的克隆a考点一| 植物的克隆技术1．植物细胞的全能性和组织培养方法（1)植物组织培养的原理：植物细胞具有全能性，即植物体的每个生活细胞都具有发育成完整植株的潜能。
（2)植物组织培养程序：配制培养基：配制含有适当营养物质和植物生长调节剂↓的半固体培养基.↓切取外植体：从消毒的根、茎、叶上切取一些小组织块。
↓获得愈伤组织：将组织块置于半固体培养基中培养，切口处细胞在创伤的刺激下发生脱分化,在创口表面形成一种由相对未分化的薄壁细胞团组成的新组织。
↓再生新植株:以适当配比的营养物质和植物生长调节剂诱导愈伤组织,直到再生出新植株.将含有愈伤组织的试管放在摇床上，通过液体悬浮培养,可以分散成单细胞（胚性细胞：细胞质丰富、液泡小、核大),这种单细胞可发育成胚状体，再继续发育可以形成植株。
2．植物细胞的全能性体现(1）相对于动物细胞，植物细胞的全能性更容易（填“难”或“容易"）体现。
（2）不同种类的植物或同种植物的不同基因型个体的细胞全能性表达程度不同。
（3）在长期培养中，培养物的胚胎发生和器官形成能力下降的可能原因：染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生；细胞或组织中的激素平衡被打破;细胞对外源生长物质的敏感性发生改变等.3．细胞培养和器官培养器官发生和形态建成主要是通过平衡植物激素配比进行调控:适量的生长素和细胞分裂素配比,可诱导芽的分化;适量的吲哚乙酸及适当减除某些其他激素，可诱导生根。
4．原生质体培养和植物细胞工程（1）原生质体的培养①制备原生质体的原因：植物细胞壁的存在，使植物组织培养与克隆有一定难度。
②制备原生质体的方法：在0。
5~0。
6 mol/L的甘露醇溶液环境下，用纤维素酶和果胶酶混合液处理。
（2）植物细胞工程：1．植物组织培养关键过程总结名称过程形成体特点培养基光脱分由外植体脱分排列疏松、高生长素与细胞避光（1)取材：含形成层（分生组织)的部分易于诱导形成愈伤组织。
植物基因克隆的策略规划与方法
植物基因克隆的策略与方法基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。
基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。
通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。
我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,1997),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。
1 功能克隆(functional Cloning)功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。
其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中筛选相应克隆。
功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。
Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对灰质葡萄孢(Botrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hain 等,1985)。
Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。
周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。
拟南芥基因的图位克隆技术
图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆 （positional cloning），1986年首先由剑桥大学的 Alan Coulson提出，用该方法分离基因是根据目的 基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因 的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关 信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连 锁关系来确定突变表型的遗传基础。
拟南芥基因的图位克隆技术
拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物， 具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点， 而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。
从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为 正向遗传学和反向遗传学两种。 正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或 表现型突变去进行 反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色 体上的位置来实现
在3个maker中，重组率最小者目标基因距该maker最近
一般情况下能在突变两侧找到相距小于40 Kb的两个分子标记。 找到之后，就可以通过测序来找到突变基因。一种有效的方法 是设计PCR引物来扩增覆盖这40 Kb的多个重叠的500 bp的片段。 将这些片段测序后拼接起来以得到整个40 Kb的序列，然后将它 与野生型植物（Col-0或者Ler）的序列进行比对，这就可以找到 这个区域中的多个基因。 从一系列侯选基因中鉴定基因是定位克隆技术的最后一个关键 环节。现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆后，把这些侯选基因进行下列分析以确定目标 基因：（1）精确定位法检查cDNA是否与目标基因共分离；（2） 检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；（3）测定cDNA序列， 查询数据；（5）进行功能互补实验， 通过转化突变体 观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表 型变化。
基因图位克隆的策略与途径(拟南芥)
拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥〔Arabidopsis thaliana〕是一种模式植物，具有基因组小〔125 Mbp〕、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成〔The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000〕。
同时，拟南芥属十字花科〔Cruciferae〕，具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。
基因(gene)是遗传物质的最根本单位,也是所有生命活动的根底。
不管要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。
特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。
本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。
1、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning,firstproposedby Alan Coulson of theUniversity of Cambridge in 1986,Geneisolatedby this methodis based onfunctional genesin the genomehas arelativelystableloci,in the use ofgenetic linkageanalysisor chromosomalabnormalities of separategroupswillqueueinto the chromosomeofaspecific location,By constructinghigh-densitymolecularlinkage map, to findmolecular markerstightly linked with the aimed gene, continued to narrow thecandidate regionand thenclonethe geneand to clarifyits functionandbiochemical mechanisms.图位克隆〔map-based clonig〕又称定位克隆〔positoinal cloning〕，1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。
植物新基因克隆的策略与方法共63页文档
61、辍学如磨刀之石，不见其损，日 有所亏 。 62、奇文共欣赞，疑义相与析。
63、暧暧远人村，依依墟里烟，狗吠 深巷中 ，鸡鸣 桑树颠 。 64、一生复能几，倏如流电惊。 65、少无适俗韵，性本爱Байду номын сангаас山。
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
63