喉癌组织中LCRG1基因启动子的克隆、突变和甲基化检测
人LCRG1基因启动子的鉴定与初步分析
ＰＩ１３跹豢藏第毛…如ｗｗｗ．ｐｉｂｂ．ａｃ．ｃｎＲｅＳｅａｒＣｈＰａｐｅｒＳ研究快报人￡ＣＲＧｊ基因启动子的鉴定与初步分析木谢海龙，）”陈主初２）李金花・’（１）南华大学肿瘤研究所，衡阳４２１００ｌ：２）中南大学肿瘤研究所，长沙４１００７８）摘要却ｇｅａｌｃａｒｃｉｎｏ眦ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ１（Ｌｃ尺ＧＪ）是一个喉癌候选抑瘤基因，为进一步深入研究其转录调控机制，应用５’ＲＡｃＥ技术确定了该基凼的转录起始位点，然后在对人￡ｃＲＧＪ基因进行生物信息学分析的基础上，通过ＰｃＲ定向克隆和酶切业克隆策略，构建了１１种含不同长度ＬｃＲＧＪ启动子荧光素酶报告基凶重组体．启动子活性分析表明，一１６９～＋１２７区域的启动子活性最高．研究提示，ＬｃＲＧＪ基因转录所必需的基因启动子序列在一１６９～＋１２７范围内．关键词￡ｃ尺ＧＪ，喉癌，启动子，转录调控学科分类号Ｑ７４喉癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤，是由遗传和环境等诸多因素相互作用所致，涉及到大量相关基因结构和表达调控的改变，尤其是瘤基因的活化和抑瘤基因的失活起到关键性作用，但喉癌发病的分子机制至今仍不清楚【Ｉ，２Ｊ．因而分离和鉴定与喉癌发病相关的基因将是阐明其癌变机制与易感性的关键，对其临床诊断和治疗也有较重要的意义．我们在２０００年采用ｍＲＮＡ差异显示和ｃＤＮＡ文库筛选技术，克隆了在喉癌组织中表达下调新基因￡ＣＲＧＪｆ（ＧｅｌｌＢａｌｌｋ登录号为Ａｆ２６８３８７）【３卅．将￡ｃＲＧＪ基因转染到喉癌细胞Ｈｅｐ．２中，发现￡Ｃ兄ＧＪ能显著抑制移植瘤的生长同．研究发现，Ｌ积ＧＪ表达水平的改变是喉癌发病的重要因素，而￡ＣＲＧＪ『转录调控的机制目前尚不清楚．因此，本研究利用５，ＲＡＣＥ确定￡衄Ｇ，转录起始位点，克隆人己ｃ尺ＧＪ『基因５７调控区并对其功能进行了初步分析．１材料与方法１．１材料ＣＯＳ７细胞株购自美国ＡＴＣＣ公司；人肝癌细胞７７２ｌ为本实验室保存；ＤＭＥＭ、胎牛血清购自Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；Ｔａ勋ＲａＬＡＴａｑ。
人类新干线SLC1A5基因启动子区DNA甲基化与恶性肿瘤关系的研究
人类新干线SLC1A5基因启动子区DNA甲基化与恶性肿瘤关系的研究高速公路上有时会出现车流密集的情况，车辆快速驶过，但也会因为拥堵而缓慢前行。
而人体细胞内的基因调控也如同车流，有时会快速进行，有时则受到外部环境的影响而缓慢进行。
近来，关于基因启动子区DNA甲基化与恶性肿瘤的关系，引起了不少科学家们的兴趣和研究。
其中，人类新干线SLC1A5基因启动子区就是研究的热点之一。
1. 基因启动子区简介基因启动子区是基因调控中的一个重要部分，它位于基因上游区域，是基因表达的关键。
一般来说，基因表达的过程中，先由启动子区调节基因表达的开关，再由转录因子等蛋白质介导的基因核糖体的结合以及翻译而得出蛋白质。
因此，基因启动子区的调控对于基因表达和细胞功能的正常发挥起到至关重要的作用。
2. DNA甲基化过程DNA甲基化是DNA分子上甲基基团（-CH3）与胸腺嘧啶（Cytosine）的5 位碳上形成共价结合的化学修饰。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传学机制，可影响基因表达以及染色体稳定性。
甲基化作为一种关键的表观修饰，因为影响基因表达而具有重要的生物学意义。
3. SLC1A5基因简介SLC1A5基因位于人类染色体19号，是一种编码为神经递质上清运体的膜蛋白。
它在胶质细胞、肺组织和胃黏膜等多个组织中表达，它的功能是调控细胞内谷氨酸水平，以满足细胞的生长和增殖需要。
4. SLC1A5基因启动子区DNA甲基化与恶性肿瘤的关系近年来的研究表明，SLC1A5基因启动子区的DNA甲基化与恶性肿瘤的发生密切相关。
在肺癌、结肠癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤组织中，SLC1A5基因启动子区甲基化水平显著增加。
而通过DNA甲基化抑制剂的作用，可以减少基因启动子区的甲基化水平，从而起到抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用。
此外，SLC1A5基因启动子区DNA甲基化水平的变化也与癌细胞的侵袭和转移有关，因此可以作为肿瘤早期诊断和治疗的重要指标。
5. DNA甲基化在恶性肿瘤治疗中的应用现今的治疗手段中，越来越多的专家将目光放在了DNA甲基化的治疗上。
痰液CNRIP1基因甲基化检测对于肺癌诊断的意义
痰液CNRIP1基因甲基化检测对于肺癌诊断的意义GUO Qi;HU Jiao;SONG Yongchun;ZHANG Yi;HU Mingjun【摘要】目的研究肺癌患者的肿瘤组织及痰液标本麻素受体相互作用蛋白-1(cannabinoid receptor interacting protein 1,CNRIP1)基因及其甲基化,分析讨论痰液基因甲基化对于肺癌早期诊断的意义. 方法通过甲基化特异性PCR(MSP)法对于80例肺癌患者的肺癌组织、癌旁组织及痰液标本和30例健康对照者的痰液标本进行基因甲基化检测.并且分析痰液CNRIP1基因甲基化发生与患者的性别、吸烟状况、病理分型、病理分期之间的相关性. 结果肺癌组织CNRIP1基因甲基化发生率为85％,而癌旁组织其甲基化发生率为8.75％,差异具有统计学意义(P＜0.01);痰液标本中肺癌患者痰液CNRIP1基因甲基化发生率为78.75％,健康对照组痰液基因甲基化发生率仅为3.33％,差异具有统计学意义(P＜0.01).痰液CNRIP1基因甲基化状态与性别、吸烟状况、病理分期等无相关性,但是,在鳞癌患者外周血标本中,其甲基化发生率(91.1％)较其他类型肺癌患者明显增高,差异具有统计学意义(P =0.009). 结论痰液CNRIP1基因甲基化检测对于肺癌的早期诊断具有较高的敏感度和特异度,并且对于肺鳞癌的诊断具有更高的敏感度,对于肺癌的病理分型具有一定的理论指导意义.【期刊名称】《山西医科大学学报》【年(卷),期】2019(050)001【总页数】4页(P50-53)【关键词】肺癌;肺鳞癌;CNRIP1甲基化;早期诊断【作者】GUO Qi;HU Jiao;SONG Yongchun;ZHANG Yi;HU Mingjun【作者单位】;;;;【正文语种】中文【中图分类】R734.2肺癌是目前威胁人类健康最常见的恶性肿瘤,其发病率在所有恶性肿瘤居于首位[1]。
喉鳞状细胞癌ESRRG基因启动子甲基化及临床意义研究
筛选喉癌相关基因LCRG1的有效沉寂序列
筛选喉癌相关基因LCRG1的有效沉寂序列段朝军;蒋铁斌;李萃;章晓鹏;李茂玉;肖志强;汤参娥;易红;陈主初【期刊名称】《中南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2008(33)6【摘要】目的:拟采用RNA干扰技术筛选有效的针对LCRG1基因的打靶序列.方法:首先采用PCR定点突变技术改造pSuper载体,而后利用该改造后的载体构建针对LCRG1基因的5对打靶序列的真核表达载体.将构建的重组pSuper362,398,432,789,903表达载体和pSuper空白载体分别转染Hela细胞,经抗性药物筛选获得抗性细胞克隆和池克隆;通过RT-PCR及荧光定量PCR鉴定阳性克隆,进行平板克隆集落形成试验,以检测打靶序列沉寂LCRG1基因mRNA表达水平的效果.结果:应用PCR定点突变技术改造的pSuper载体,可被BglⅡ酶切;利用RT-PCR和荧光定量PCR检测各重组载体转染细胞池克隆LCRG1 mRNA的表达发现,362组,398组,432组的基因均能封闭内源性LCRG1基因表达,尤以362组为显著;鉴定362组筛选的各个抗性克隆,发现A2和A5克隆的LCRG1 mRNA表达水平明显降低.平板克隆实验结果提示362组的A2,A5和池克隆的细胞增殖能力明显强于载体和空白对照组(P<0.05).结论:成功改建了pSuper真核表达载体;362 siRNA相对其他siRNA具有较好的打靶效果,这对于应用RNAi方法研究LCRG1基因的功能和其作用分子机制具有重要的指导意义.【总页数】8页(P468-475)【作者】段朝军;蒋铁斌;李萃;章晓鹏;李茂玉;肖志强;汤参娥;易红;陈主初【作者单位】中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅三医院血液科,长沙,410013;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008;中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室,长沙,410008【正文语种】中文【中图分类】R739.6【相关文献】1.喉癌相关基因 LCRG1蛋白的细胞亚定位及生物学特性研究 [J], 李友军;关勇军;谢海龙;陈主初;何春梅;段朝军2.常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及ADAMs相关基因的免疫筛选与序列分析 [J], 林俊堂;李玉昌;张会勇;徐存拴3.大菱鲆脾脏cDNA文库构建、EST序列分析与免疫抗病相关基因的筛选 [J], 孟亮;陈松林;刘洋4.92. 喉癌相关基因LCRG1的鉴定和功能初步研究 [J], 陈主初; 李友军; 谢海龙;何春梅5.一个新的家兔高脂血症相关基因的筛选、克隆和序列分析 [J], 李晓宇;白小明;郭冬平;潘超;孙屏;何龙;范乐明;陈琪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
GLI1基因调控及其在喉癌发生发展中作用机制研究
GLI1基因调控及其在喉癌发生发展中作用机制研究喉癌是指发生在喉部的恶性肿瘤，常见于声带局部，是一种常见的头颈部恶性肿瘤。
GLI1基因是GLI家族（GLI1、GLI2和GLI3）中的一员，该家族在胚胎发育中起着关键的调控作用。
研究发现，GLI1基因在肿瘤发生和发展中也发挥着重要的作用。
本文将就GLI1基因在喉癌发生发展中的作用机制进行研究。
首先，在喉癌组织中，GLI1基因的表达水平明显上调。
GLI1基因是GLI转录因子家族中的主要成员，可以通过调控多个生长因子以及Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog和TGF-β等信号通路，参与肿瘤细胞的增殖、转移和耐药等过程。
研究发现，在喉癌组织中，GLI1基因的高表达与肿瘤的分级和预后密切相关。
因此，GLI1基因可能作为一个潜在的治疗靶点，对于喉癌的治疗具有重要意义。
其次，在喉癌组织中，GLI1基因的上调与Hedgehog信号通路的激活密切相关。
Hedgehog信号通路是一条重要的细胞增殖和发育调控通路，在胚胎发育中起着重要作用。
研究发现，喉癌组织中Hedgehog信号通路成员的表达水平也明显上调。
GLI1基因作为Hedgehog信号通路的底层效应器，在喉癌中起着至关重要的作用。
研究显示，抑制Hedgehog信号通路或降低GLI1基因的表达可以抑制喉癌细胞的增殖和侵袭能力。
因此，Hedgehog-GLI1信号通路可能成为喉癌治疗的新靶点。
此外，GLI1基因在喉癌的放化疗抵抗中也发挥着重要的作用。
放化疗是喉癌的主要治疗手段，然而患者对放化疗的耐药性往往导致治疗失败。
研究发现，GLI1基因的上调可以增加喉癌细胞对放化疗的耐受性。
此外，GLI1基因还可以通过调节DNA损伤修复和细胞凋亡逃逸等途径，参与喉癌对放化疗的抵抗。
因此，针对GLI1基因的干预可能有助于克服喉癌对放化疗的耐药性。
综上所述，GLI1基因在喉癌发生发展中扮演着重要的角色。
通过调控多个生长因子和信号通路，GLI1基因促进了喉癌细胞的增殖、转移和耐药性。
喉癌组织中LCRG1基因启动子的克隆、突变和甲基化检测
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｐ ｕ ｒ ｐ ｏ ｓ ｅ Ｔ ｏ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｍｏ ｔ ｅ ｒ ｆ ｕ ｎ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｌ ａ ｒ ｙ ｎ ｇ ｅ ａ ｌ ｃ ａ ｒ ｃ ｉ ｎ ｏ ｍ ａ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｇ ｅ ｎ ｅ １（ Ｌ Ｃ Ｒ Ｇ １ ）ｉ ｎ ｌ ａ ｙｎ ｒ ｇ ｅ ａ ｌ ｃ ａ ｒ ｃ ｉ ｎ ｏ ｍ ａ ．
《肿瘤DNA甲基化标志物检测及临床应用专家共识(2024版)》要点
《肿瘤DNA甲基化标志物检测及临床应用专家共识（2024版）》要点1 DNA甲基化标志物概述DNA甲基化是一种DNA的共价修饰，具体是指DNA甲基转移酶（DNMTs）将甲基加到DNA CpG序列中胞嘧啶的5'碳位，形成5-甲基胞嘧啶的过程。
与传统的肿瘤标志物相比，DNA甲基化标志物具有更早期、更无创、更精准等优点。
因此，可以通过非侵入性方式获得的痰液、血浆、血清或尿液等样本进行DNA甲基化标志物检测。
一些DNA甲基化异常发生在肿瘤形成的初始阶段，通过检测与肿瘤发展相关的甲基化标志物，可以辅助癌症早期诊断、评估进展风险。
DNA甲基化标志物甲基化水平的增加或降低与肿瘤预后密切相关，可用于治疗或根治性手术后评估肿瘤微小残留病灶（MRD）和监测复发。
此外，DNA甲基化标志物还可作为化疗敏感性的标志，某些特定基因的甲基化可能预示着癌症对治疗的反应，可用于判断化疗药物的疗效，以更好地指导治疗方案。
2 DNA甲基化标志物的临床检测2.1 临床样本前处理注意事项细胞基因组与游离DNA（cfDNA）均可用于肿瘤DNA甲基化检测，常采用组织、血液样本，也可采用尿液、浆膜腔积液、灌洗液、粪便、拭子等样本。
专家共识：各类样本经采集后，应尽可能减少转运环节与耗时，及早分离检测组分。
血液样本应避免溶血，不可使用肝素抗凝。
检测游离DNA时，采集量应充足，及早采用两步离心法分离无细胞血浆，分离前不可对含红细胞血样进行冻存。
新鲜体液及灌洗液样本如含较多血液成分可进行抗凝处理。
粪便样本推荐采用含防腐剂保存液。
（推荐等级：强推荐）2.2 DNA甲基化标志物检测技术方法2.2.1 DNA提取与纯化2.2.2 DNA转化2.2.3 DNA甲基化检测平台专家共识：抽提纯化所得DNA应根据样本类型制定质量合格标准并进行评价，包括浓度、纯度和DNA完整性。
cfDNA还应评估片段分布，以排除基因组DNA污染。
DNA甲基化检测需要针对不同的标本类型与检测应用选择适宜的转化方法，并关注转化技术的最新进展。
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喉癌组织中LCRG1基因启动子的克隆、突变和甲基化检测李金花;曾龙武;谢海龙【摘要】目的观察喉癌候选抑瘤基因(laryngeal carcinoma related gene1,LCRG1)启动子的功能.方法 (1)通过5′-缺失突变、瞬时转染与荧光素酶报告基因活性检测,进一步分析与LCRG1基因表达调控有关的最小启动子区域;(2)通过PCR-单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)技术检测40例喉癌组织中LCRG1基因启动子突变;(3)应用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)技术检测40例喉癌组织中LCRG1基因启动子甲基化状态;(4)采用RT-PCR技术检测40例喉癌组织中LCRG1基因的表达.结果(1)LCRG1基因最小启动子片段位于转录起始位点上游-169~-57位点;(2)喉癌组织中LCRG1基因启动子无突变;(3)40例喉癌组织中有5.00% LCRG1基因启动子甲基化改变;(4)RT-PCR检测显示40%(16/40)喉癌组织中LCRG1基因表达下调.结论 LCRG1基因最小启动子位于转录起始位点上游-169~-57位点的DNA片段;LCRG1基因启动子甲基化部分改变可能参与该基因的表达调控.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2013(029)008【总页数】6页(P819-824)【关键词】转录调控;最小启动子;瞬时转染;甲基化【作者】李金花;曾龙武;谢海龙【作者单位】杭州师范大学附属医院病理科,杭州310015;南华大学肿瘤研究所,衡阳421000;南华大学肿瘤研究所,衡阳421000;南华大学肿瘤研究所,衡阳421000【正文语种】中文【中图分类】R739.65喉癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，其发生、发展过程复杂，涉及大量相关基因结构和表达调控的改变，瘤基因的激活和抑瘤基因的失活起到关键性作用，喉癌的发病分子机制至今仍未清楚[1]。
因此，分离和鉴定与喉癌发病相关的基因是阐明其癌变机制与易感性的关键，对临床诊断与治疗也有较为重要的意义。
喉癌的杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)研究显示，在染色体 3p、8p、9p、13q、17p、17q上均有较高频率的 LOH[2，3]。
喉癌候选抑瘤基因(laryngeal carcinoma related gene 1，LCRG1)是喉癌中表达下调的新基因，定位于17q12～21.1上，位于D17S800～D17S930之间，正好位于17q21.1上的LOH的高频区域[4]。
研究显示，LCRG1在54.5%(6/11)的其它肿瘤细胞系中不表达[4]，当将野生型LCRG1 cDNA编码区导入到不表达该基因的喉癌细胞系Hep-2中，见其明显抑制细胞生长、Hep-2细胞的停泊非依赖性生长及抑制裸鼠成瘤[5]，这表明LCRG1具有一定的抑瘤功能。
然而，LCRG1在肿瘤尤其是在喉癌中的缺失或低表达的转录调控机制至今尚未清楚[6]。
课题组在既往的研究中已初步确定LCRG1基因的启动子片段及启动子区域内部分关键顺式调节元件[7－9]。
本研究从转录调控机制入手，应用多种实验方法对LCRG1基因启动子的表达调控机制进行研究，进一步提高该基因的认识和促进其功能研究的开展，了解该基因在喉癌中表达下调的分子机制。
1 材料与方法1.1 材料收集2005年1月～2008年6月南华大学附属第二医院和南华大学郴州市第一人民医院教学医院手术切除的喉癌根治术标本(所有标本均经患者及院方许可)40例，其中男性29例，女性11例，年龄52～72岁，中位年龄61岁。
40例喉癌组织中高分化18例，中分化9例，低分化13例。
早期喉癌(TNM分类0～Ⅰ期)6例，进展期喉癌(TNM分类Ⅱ～Ⅳ期)34例，有淋巴结转移者29例，无淋巴结转移者11例。
所有患者术前均未接受放、化疗。
COS7细胞株购自美国ATCC公司、人肝癌细胞7721来自南华大学肿瘤研究;DMEM、胎牛血清购自Hyclone公司;用于启动子活性分析的PGL3系列质粒及荧光素酶内参照质粒PRL-TK购自Promega公司。
DNA转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;双荧光素酶检测试剂购自Promega公司;质粒提取试剂盒购自Qiagen公司;各种限制性内切酶、DNA连接酶、胶纯化回收试剂盒均购自Takara公司;实验中所用引物均用Primer Premier 3.0软件设计，由上海英骏公司合成。
EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒购自美国Zymo Research公司。
1.2 方法1.2.1 重组质粒的构建载体质粒pGL3-basic不含启动子和增强子，含萤火虫荧光素酶报告基因，重组体中所含启动子即是所要研究的LCRG1的5'端启动子片段。
6个构建的重组体分别命名为pGL3-E177(－169～ +8 bp)、pGL3-E112(－169～－57 bp)、pGL3-E89(－169～－78 bp)、pGL3-E88(－78～ +8 bp)、pGL3-E96(－57～ +39 bp)、pGL3-E180(－53～+127 bp)。
PCR扩增以pGL3-E296质粒为模板[6]，利用PCR技术将不同长度的启动子片段扩增出来，上、下游引物的5'端分别引入MluⅠ和XhoⅠ酶切位点。
扩增片段用MluⅠ和XhoⅠ双酶切后，连接到同样被这两种酶酶切的pGL3-basic载体中的多克隆位点内，构建含LCRG1 5'调控序列和萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒。
重组质粒经酶切和测序进一步鉴定。
构建的重组质粒和相对应的引物见表1。
另外重组体pGL3-E180(－53～+127 bp)的构建是将pGL3-E296用MluⅠ和NarⅠ双酶切消化后，加Klenow酶、dNTPs补平，电泳回收纯化载体大片段，用T4 DNA连接酶自连载体大片段，转化TOP10感受态菌，挑取转化子，抽质粒后用KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，产物中有约210 bp片段的为正确转化子，测序结果正确;重组体pGL3-E89(－169～－78 bp)是将全长pGL3-E177质粒分别用NruⅠ和XhoⅠ酶切消化后，Klenow酶补平，电泳回收并纯化含载体的大片段(约5 K)。
自连转化DH10B感受态菌，挑取转化子，抽质粒ScaⅠ酶切鉴定，测序结果正确;重组体pGL3-E88(－78～+8 bp)是将全长pGL3-E177质粒分别用NruⅠ和MluⅠ酶切消化后，Klenow酶补平，电泳回收并纯化含载体的大片段(约5 K)。
自连转化DH10B感受态菌，挑取转化子，抽质粒ScaⅠ酶切鉴定，测序结果正确。
表1 相关引物序列引物序列(5'-3') 产物长度(bp)E112 LCGACGCGTGGGCCCACGGGCGG 112 R CCGCTCGAGGGCGGGACCCACG E96 LCGACGCGTCGGCGCCCGACCCC 96 R CCGCTCGAGTTTCCTCTACGGGCAGTC E177 LACGCGTCGGGCCCACGGGCGGGACGG 177 RCTCGAGGCGGGGAGTGGAAGAAGGAG1.2.2 瞬时转染质粒转染按Lipofectamine 2000使用说明进行。
转染前一天，将COS7、7721细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔组织培养板，当细胞生长至80% ～90%融合时，加入0.4 μg重组质粒、20 ng 的 PRL-CMV 及0.75 μl Lipofectamine 2000。
同时设立转染 pGL3-basic阴性对照组和pGL3-control 阳性对照组。
1.2.3 荧光素酶报告基因活性检测根据Promega公司Dual-Luciferase ReporterAssay Kit提供的操作步骤检测报告基因活性。
具体操作如下:每孔加入100 μl× PassiveLysis Buffer，室温裂解 10 min，用枪头刮下细胞后收集到1.5 ml Eppendorf管中，13 200 r/min×2，取20 μl上清加入测量管中，先加入Fire-fly Luciferase 底物30 μl，用 MiniLumat LB 9506(EG＆G ERTHOLD)仪器测量并记录读数，然后在该反应混合物中加入30 μl Renilla Luciferase底物，测量并记录读数。
以Firefly Luciferase读数与Renilla Luciferase读数比值(Ratio)作为相对Luciferase活性，即Relative Luciferase Activity，各缺失插入片段启动子活性均通过与阳性对照质粒pGL3-control比较(以pGL3-control启动子活性为100%)获得。
为减少误差，各实验至少重复3次，每次实验均设2个平行组，Mean表示两组的Ratio平均值。
标准偏差计算公式为1.2.4 组织DNA与RNA提取按《分子克隆实验指南》操作步骤提取细胞和组织标本的基因组DNA与RNA。
1.2.5 PCR-单链构象多态性(PCR-single-strand conformation polymorphism，PCR-SSCP) 利用Primer 3.0软件设计引物扩增LCRG1启动子区域，LCRG1-SSCP-F:5'-CCCTCCTACCAGTCCTAGTTCG-3'和LCRG1-SSCP-R:5'-CGTTTCCTCTACGGGCAGTC-3'。
以基因组DNA 0.5 μg为模板进行PCR反应，取PCR产物处理后电泳，回收电泳缓冲液，银染后的凝胶经凝胶成像系统成像、拍摄，电脑保存。
1.2.6 甲基化特异性 PCR(methylation specific PCR，MSP)DNA甲基化处理采用美国Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit试剂盒。
LCRG1启动子区域包括一个CpG岛，即从转录起始位点上游－169 bp到－58 bp。
利用Methyl Primer Express Software v1.0和Primer 3.0软件设计两对引物，(1)LCRG1-BSP1-F:5'-GGTTGGGGTTTGAGG TTG-3'，LCRG1-BSP1-R:5'-AACTCCCACCTCTACTC CCTATTACTA-3';(2)LCRG1-BSP2-F:5'-TTTTTTTA TTAGTTTTAGTTTGGGTTTAG-3'，LCRG1-BSP2-R:5'-TTTCCTCTACAAACAATCAACCAC-3'。