2.高效液相色谱仪和固定相、流动相

光电二极管阵列检测器
3. 差示折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；
可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；
特点：
通用型检测器 ; 灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分 析; 对温度敏感，要求使用温度恒定; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。
六、液相色谱法流动相
1. 流动相特性 2. （1）流动相的种类、配比可显著改变组
分分离状况； 3. （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
， 称为正相液液色谱法; 4. （3）流动相的极性大于固定液的极性，
则称为反相液液色谱 。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗
外梯度: 两台高压泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
高压泵按其性质可分为恒压泵、恒流泵两类
1）往复式柱塞泵： 恒流 泵； 易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。
2）气动放大泵： 恒压泵 液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱， 无脉冲、稳定流量的输出, 现多用于装柱。
二、进样装置
a. 停留进样装置：
b. 缺点：不能承受高压，须停流进样； 无法取得精确的保留时间
a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
化学键合固定相的特点 （1）传质快，表面无深凹陷; （2）寿命长， 无固定液流失，耐流动相冲 击； （3）选择性好，可键合不同官能团 ； （4）有利于梯度洗脱；
装柱方法：有干法和湿法，按粒度20μm 划分。
柱温控制
下列几种情况需要控制柱温： 法定标准分析方法中，要求保留时间具
有再现性； 必须通过改变柱温来提高分离效率； 对高分子化合物或黏度大的样品； 对一些具有生物活性的生物分子； 对一些组成复杂的样品，使用二维色谱
技术。
四、液相色谱检测器
1.紫外检测器: 应用最广，对大部分有机化合 物有响应。
滤膜过滤。
2．脱气装置
作用：脱去流动相中的溶解气体。
(1)吹氮脱气法 (2)加热回流法 (3)抽真空脱气法 (4)超声波脱气法 (5)在线真空脱气法(on—1ine degasser)
3、 高压输液泵
输送流动相
压力：150～350×105 P 输液泵的稳定性直接关系到分析结果 的重复性和准确性。
讨论2
在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相， 增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与 保留时间tR如何变化？
作业
1.在ODS柱上，以甲醇为流动相，某组分的分配 容量k=1.2,如以乙腈为流动相，其k值是增加 还是减少，为什么？
2.在硅胶柱上，用甲苯为流动相，某组分的保留 时间是30min，如果改用四氯化碳或乙醚为流 动相，试分析该组分的保留时间如何变化？
骂 道 ： “ 这 小子， 今天疯 了，哈 怂货！ ”
李 金 柱 是 这个 村子———李 平 台村 里的人 。在李 平台最 有名的 东西有 两件： 第 一 是 利 平 台的金 菊花。 李平台 的后山 坡上常 年长着 一片金 黄色的 野菊花 。每逢 秋 天 ， 金 黄 金黄的 花朵在 阳光下 能折射 太阳的 亮；漫 山遍野 的香能 遮挡住 秋风的 寒 。 第 二 就 是这“ 名人” 李金柱 了。李 金柱的 名气大 到成为 了家家 户户教 育孩子 的 典 范 。 谁 家的小 孩子不 成材， 不好学 ，就会 被家长 狠狠的 教育： “再不 好好学 习 ， 以 后 长 大了也 想李金 柱一样 没有出 息！” 谁家的 小孩子 办了个 蠢事， 那就成 了 典 型 的 “ 李金柱 第二” 了。李 金柱的 名气来 头还得 从他的 经历说 起。李 平台村 本 来 是 个 用 当地人 来说， 是个鸟 不拉屎 的穷村 子。在 当地有 个歌谣 ：“夏 天光着 腚 ， 冬 天 打 补丁， 问谁一 穷二白 ，那是 李平台 ”。孩 子们到 了成家 的年龄 ，李平
3. 流动相的选择
常用溶剂的极性顺序：水、酰胺、腈、醇、酮、 酯、醚、烃类, etc. 流动相可分为：底剂及洗脱剂 底剂：决定基本的色谱分离情况； 洗脱剂：调节试样组分的滞留并对几个组分具 有选择性的分离作用。
采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
4. 荧光检测器（fluorescence detector）
许多有机化合物，特别是芳 香族化合物、受紫外光激发 后能够辐射出荧光。
高灵敏度(比紫外检测器高两个数量级，达 10-11g.ml-1)
高选择性; 线性范围窄； 测量中不能使用抑制、吸收荧光的溶剂；
对不产生荧光的物质，可使其转变成荧光 物质；
作用原理：被分析试样组分对特定波长紫外 光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关 系遵守比尔定律。
特点：
灵敏度高，可达10-9g.mL-1； 线性范围高； 可用梯度洗脱； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 不适用于对紫外不吸收的试样； 紫外光不透过的溶剂不能用（苯等）。
2. 光电二极管阵列检测器
紫外可见光度检测 器的重要进展； 1021个二极管阵列， 各检测某一特定波 长，无需停流扫描 而观察色谱柱流出 物的各个瞬间的动 态光谱吸收图
3. 在液相色谱法中，梯度淋洗适用于分离何种 试样？
2）离子交换色谱流动相 组分保留值可通过流动相中盐浓度及pH来调节
人干扰素-γ等电点8.5 底剂：50mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.0 洗脱剂： 50mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.5，1mol/L NaCl
七、高效液相色谱的应用
1. 环境中有机氯农药残留量分析
b. 高压定量进样阀：（六 通阀进样装置）
c. 优点：进样准确，重 现性好，适于定量分析
d. c.自动进样器：计算机 控制，适合大量进样。
三、高效分离柱 色谱柱是实现分离的核心部件。发展趋 势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
常规液相色谱柱 1～6 mm，10～50 cm。 微孔填充柱 0.5-1mm 毛细管柱 30-50µm
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50 m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残留量进 行分析。
2. 稠环芳烃的分析
稠环芳烃多为致癌物质 反相液-液色谱法 固定相：十八烷基硅烷化键合相 流动相：20%甲醇-水 ～100%甲醇
仪器分析课程讲义
第四节 高效液相色谱仪
目录
高效液相色谱仪 高效液相色谱的固定相和流动相
太 阳 还 有 一竿 子高的 时候， 李金柱 就骑着 他那辆 除了铃 不响， 什么都 响的 “ 二 八 ” 破 驴吱吱 扭扭地 从夕阳 的方向 飞奔过 来了。 路边闲 坐着下 棋的老 头们也 被 这 车 子 刺 耳的嚎 叫从楚 河汉界 的厮杀 中回过 神来。 看到夕 阳下热 的湿透 了整个 后 背 ， 白 色 的的良 布衬衫 紧紧的 粘在后 背上的 ，阳光 下反光 的背影 ，老头 们齐声
线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 ºC 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器
正相和反相色谱的区别
比较项目
正相色谱
反相色谱
固定相
极性
非（弱）极性
流动相
非（弱）极性 极性
流出次序
极性组分k大 极性组分k 小
流动相极性的影 极性增加，k减 极性增加，k增
响
小
大
广泛应用于生物化工、制药、食品和环境 监测中.
5. 电导检测器（electrical conductivity detector）
属电化学检测器，是离子色谱法中应用最 为广泛的检测器
作用原理：根据物质在某些介质中电离后 所产生的电导变化来测定电离物质的含 量。
五、液相色谱法固定相
1. 固定相的形状 （1）全多孔型
最初由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多 孔球体 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液。 传质速度慢，柱效低。 现采用10μm以下的小颗粒 。
（2）表面多孔型(薄壳型微珠)
30～40μm的玻璃微球，表面附着一 层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，传质速度快，但柱容量低；
2.液-固吸附固定相 极性：硅胶、氧化镁、分子筛 等； 非极型：高聚物微球、石墨化碳黑、聚合
台 的 男 孩 都 想娶个 外村的 媳妇， 李平台 的女孩 都想嫁 到别
6.2 高效液相色谱仪
输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统
一、输液系统
1．贮液器 贮液罐的材料应耐腐蚀，对溶剂呈惰性，
容积约为0．5—2．0L； 贮液罐放置要高于泵体； 使用过程贮液罐应密闭； 溶剂在放入贮液罐之前必须经过0．45um
正相液-液分配分离（液固色谱极性固定相）： 底剂：低极性的溶剂，如正己烷、苯、氯仿等， 洗脱剂：根据试样的性质选取中等极性溶剂如醚、 酮、醇等。 反相色谱（液固色谱非极性固定相）： 底剂： 水。 洗脱剂： 有机溶剂作为极性调节剂。
4 梯度洗脱
梯度洗脱，与气相色谱中的程序升温一样， 可极大地改善分离效果