细胞色素b_5突变体_E44A_E48A_E56A_D60A_的溶液结构研究

V o l.21高等学校化学学报N o.11　2000年11月 CH E M I CAL JOU RNAL O F CH I N ESE UN I V ER S IT IES 1631～1632　[研究快报]细胞色素b5突变体(E44A E48A E56A D60A)的溶液结构研究吴义兵1,3　陆　军1,3　钱程明1　李二成2　王金凤2　唐雯霞1　朱德熙3(1.南京大学配位化学国家重点实验室,南京210093;2.中国科学院生物大分子国家重点实验室,北京100101;3.南京大学生化药物国家重点实验室,南京210093)王韵华　王文虎　陆军霞　谢　毅　黄仲贤(复旦大学化学系,上海200433)关键词　细胞色素b5;突变体;NM R;溶液结构中图分类号　Q518.2 文献标识码　A 文章编号　025120790(2000)1121631202电子传递反应是光合作用和生物氧化等一系列重要生物过程的基本反应[1].为阐明细胞色素b5和细胞色素c间的电子传递机理,根据晶体结构数据,1976年Salemm e[2]首次提出细胞色素b5和c的静电结合模型,1993年N o rth rup等[3]用B row n ian动态模拟预言的这两个蛋白结合模型有两种几何形态.根据以上模型设计了许多实验,但对两种模型都至关重要的细胞色素b5血红素暴露棱周围的4个残基E44,48,56和D60对蛋白质复合物的稳定性以及在蛋白质识别中的作用仍然不清楚.为了阐明这4个带负电的残基对细胞色素b5结构的影响,正确地揭示蛋白质相互作用的本质和机理,本文对牛肝微粒体细胞色素b5胰蛋白酶切割后水溶性部分的突变体(E44A E48A E56A D60A)溶液结构进行了研究.本文在303K下于B ruker DM X600核磁仪上记录所有NM R谱图,基本完成了突变体的全归属.实验共得1994个距离约束,其中1617个约束在结构计算中有意义.用GLOM SA程序[4]得到28对质子的空间立体归属.溶液结构计算用D YANA程序[5].随机选择200个初始结构,进行15000步退火计算,得到了目标函数最低的35个结构.所得突变体35个结构簇用SAND ER模块进行能量优化(R E M)[6],最后所得平均能量最优化结构即为突变体溶液结构.用PROCH ECK2NM R程序[7]检测蛋白二级结构,和野生型蛋白晶体结构(pdb en try1cyo)[8]的二级结构相比几乎不变.表1的质量参数表明所得结构是高精度的.图1显示了突变体35结构簇.Table1　The param eters of the f i nal RE M fam ily of35structuresRM SD fo r backbone atom s a(nm)0.056±0.009RM SD fo r all heavy atom s a(nm)0.105±0.010NO E s average target functi on b(nm2)0.0040±0.0004R esidues in mo st favo red R am achandran p lo t regi ons(%)81.0±3.3R esidues in allow ed R am achandran p lo t regi ons(%)16.0±3.0R esidues in generously allow ed R am achandran p lo t regi ons(%)1.6±1.8R esidues in disallow ed R am achandran p lo t regi ons(%)1.4±1.3a.RM SD values are calculated fo r residues5—82;b.Co rresponding to a R E M penalty functi on of(53.8±5.9)kJ mo l.RM SD: roo t m ean square deviati on;NO E s:nuclear overhauser effects.本文测得的突变体溶液结构比文献[9]报道的野生型溶液结构(1w db)的精度高(骨架RM SD收稿日期:2000205216.基金项目:国家自然科学基金(批准号:29731030,39870166)资助.联系人简介:唐雯霞(1934年出生),女,教授,博士生导师,从事配位化学研究.黄仲贤(1940年出生),男,教授,博士生导师,从事生物无机化学研究.F ig .1　Stereo drawi ng of 35converged structuresof cytochro m e b 5m ut an t 0.057nm vs 0.073nm ,残基范围:10～83),因为本文得到的NO E 约束多(1994vs 1130).叠加突变体溶液结构和野生型晶体结构(残基范围:5～82),骨架和所有重原子的RM SD 分别为0.058nm和0.136nm ,表明突变体和野生型三维结构是相似的.研究发现,这4个酸性残基的突变所带来的结构变化仅限于局部,并且不显著影响两个轴向配体(H is 39和H is 63)的咪唑环平面相对于卟啉环平面的取向.比较突变体与野生型酰胺质子的化学位移,发现显著的化学位移变化基本发生在突变点及相邻个别残基上,也暗示突变的影响限于局部构象.突变体溶液结构的获得为将来正确解释突变体和细胞色素c 相互作用和电子转移反应,进一步理解电子传递机理奠定了基础.参　考　文　献　1　M arcus R .A .,Sutin N ..B i och i m .B i ophys.A cta [J ],1985,811:265—322　2　Salemm e F .R ..J .M o l .B i o l .[J ],1976,102:563—568　3　N o rth rup S .H .,T hom asson K .A .,M auk A .G .et a l ..B i ochem sitry [J ],1993,32:6613—6623　4　G üntert P .,B raun W .,W üth rich K ..J .M o l.B i o l .[J ],217:517—530　5　G üntert P .,M um enthaler C .,W üth rich K ..J .M o l.B i o l .[J ],1997,273:283—298　6　Pearl m an D .A .,Case D .A .,Caldw ell J .W .et a l ..AM BER 5.0[CP ].U niversity of Califo rnia ,San F rancisco ,CA .,1997　7　L askow sk i R .A .,R ull m ann J .A .C .,M ac A rthur M .W .et a l ..J .B i omo l .NM R [J ],1996,8:477—486　8　D urley R. C. E.,M athew s F.S ..A cta C rystallog .Sect .D [J ],1996,52:65—72　9　M uskett F.W.,Kelly G .P.,W h itfo rd D..J.M o l.B i o l .[J ],1996,258:172—189The Solution Structure of Cytochrom e b 5M utan t (E 44A E 48A E 56A D 60A )W U Y i 2B ing 1,3,LU Jun 1,3,Q I AN Cheng 2M ing1L I E r 2Cheng 2,W AN G J in 2Feng 2,TAN G W en 2X ia 13,ZHU D e 2X i3(1.S tate K ey L aboratory of Coord ination Che m istry ,N anj ing U niversity ,N anj ing 210093,Ch ina ;2.N ational L aboratory of B io m acro m olecu les ,A cad e m ic S inica ,B eij ing 100101,Ch ina ;3.S tate K ey L aboratory of P har m aceu tical B iotechnology ,N anj ing U niversity ,N anj ing 210093,Ch ina )W AN G Yun 2H ua ,W AN G W en 2H u ,LU Jun 2X ia ,X IE Y i ,HUAN G Zhong 2X ian3(D ep art m ent of Che m istry ,F ud an U niversity ,S hang hai 200433,Ch ina )Abstract T he so lu ti on structu re of bovine cytoch rom e b 5m u tan t (E 44A E 48A E 56A D 60A )has been ob tained from 1H NM R sp ectra m easu red at 600M H z .T he final RM SD values w ith respect to the average structu re are (0.056±0.009)nm and (0.105±0.010)nm fo r backbone and all heavy atom s ,resp ectively .T he so lu ti on structu re ,w hen com p ared w ith the X 2ray structu re of w ild typ e ,has no sign ifican t changes in the w ho le fo lding and secondary structu re .Sm all changes are restricted to local confo r m ati on near m u tated sites .Keywords Cytoch rom e b 5;M u tan t ;NM R ;So lu ti on structu re(Ed .:M ,X )2361 高等学校化学学报V o l .21。