狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒的构建
狂犬病病毒中和抗体ELISA技术的建立
Ａｂｓｌｒａｅｔ： Ａｎ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅ－ ｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗ ａｓ ｏｂｔ ａｉｎｅｄ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｌｉｃｅｄ ｇｅｎｅ ｆ ｒａｇｍ ｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｃｏｍ ｐｒ ｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｔ ｈ ｅ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｅｄ ｔ ｈ ａｔ ｔ ｈ ｅ ａｍ ｏｕｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍ ｂｉ ｎ ａｎｔ Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆ ｏ ｒ ｃｏａｔｉｎｇ ｗａｓ ２ Ｕ ｇ ｐｅｒ ｗｅｌｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｓａｍｐｌｅ ｗａｓ １：２００．Ｔ ｈ ｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｉ ｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｆｏｃｕｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｔｅｓｔ （ＲＦＦＩＴ） ｗａｓ ８８％ ａｎｄ ９６％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ ｄｉｄ ｎｏｔ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔ ｗｉｔｈ ｓｅｒａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆ ｏｒ ｃａｎｉｎｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ， ｃａｎｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ， ｃａｎｉ ｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ， ｃａｎ ｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｃａｎｉｎｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ， ｓｈｏｗｉｎｇ ｇｏｏｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ ｉｎｔｒａ—ａｓｓａｙ ａｎｄ ｉ ｎ－ ｔｅｒ－ａｓｓａｙ ｃｏｅｆｉ ｃｉｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗａｓ ２．７％ ａｎｄ ４．２％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔ ｈ ｅ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｆｕｌ ｆ ｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉ ｎｇ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ａｎｉ ｍａｌｓ．
腺病毒的分子进化和流行病学
腺病毒的分子进化和流行病学腺病毒是一类广泛存在于人类、动物和植物中的病毒，由于其感染力强、传播性广、病程短暂等特点，腺病毒感染在医学和公共卫生领域一直备受关注。
本文将重点探讨腺病毒的分子进化和流行病学，以期对该病毒的防治和治疗提供一定的参考。
一、腺病毒的分子进化腺病毒是一类非包膜RNA病毒，其基因组由单股线性的RNA组成。
腺病毒包含7个不同的基因型，分别为A、B、C、D、E、F、G型。
其中，A、B、C、D型是人类最主要的腺病毒感染病原体，而E、F、G型则主要感染动物。
腺病毒的分子进化主要通过基因重组和点突变进行。
在基因重组方面，腺病毒的基因组非常灵活，可以轻松地进行基因重组以适应环境的改变。
例如，在病毒的品系亚型之间，可能会发生基因重排的现象，使得该病毒产生了新的基因型。
同时，腺病毒还可以通过点突变来适应环境的压力。
研究表明，腺病毒的基因型随着时间的推移，会发生一定的点突变，使得其在基因组上发生变化，对宿主的感染能力也发生变化。
二、腺病毒的流行病学腺病毒的流行病学研究要从其宿主和传播方式入手。
腺病毒在人类的感染很普遍，感染的方式有很多，可以通过空气、水、食物等多种方式传播。
腺病毒的感染主要分为肠道感染和呼吸道感染两种类型。
其中，肠道感染主要通过食物、饮水等途径传播，呼吸道感染则主要通过空气传播。
此外，腺病毒还可以在动物中传播，不同基因组的腺病毒可以感染不同类别、不同物种的动物，包括人类、猕猴、类人猿、啮齿类动物、鸟类等。
人类除了是腺病毒的主要宿主之一，还是许多病毒接种计划的接种对象。
总之，腺病毒的流行病学研究是极其重要的，不仅可以对腺病毒的防治起到积极的作用，还能通过对研究不同基因型、传播途径、病毒定量等方面的数据进行综合分析，探究腺病毒分子进化的规律及趋势。
三、腺病毒的防治及治疗腺病毒的防治和治疗是一个复杂的过程，需要通过多种方法来进行。
首先，要加强环境卫生和个人卫生，防止腺病毒的传播。
其次，针对不同基因型的腺病毒，可以开发不同类型的疫苗进行防治。
腺病毒载体狂犬病疫苗研究进展
Ｐｒ ｇｒ ｓ ｎ Ｖ ｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｅ ｏ ｅ ｓ ｉ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃ ｎ
腺 病 毒 载 体 狂 犬 病 疫 苗 研 究 进 展
王 林 栋 ， 守峰 ， 荣 良 张 扈
（ 国人 民解 放 军 军 事 医 学科 学 院 军 事 兽 医 研 究 所 ， 中 吉林 省人 兽共 患 病 预 防 与 控 制 重 点 实 验 室 ， 林 长 春 １０ ２ ） 吉 ３ １ ２
种经 过改 造 的腺 病 毒 ， 得 肌 肉细 胞 能 够 生成 和 使
分 泌一 些抗 体 ， 在小 鼠模 型 上 对 艾 滋 病 具有 治 疗 作
用 。
１ 腺 病 毒 及 狂 犬 病 病 毒 的 生 物学 特 性
腺 病毒 （ ｄ ｎ ｖｒ ｓ ＡＤ） 为 ２个 属 ， 哺乳 Ａ ｅｏ ｉ ， ｕ 分 即
摘 要 ： 犬病是 一 种 古老的人 兽 共 患传 染病 。世 界 上 已有部 分 国 家和 地 区成 功 地 消灭 了狂 犬病 。在 狂
我 国， 年有 约 ３０ ０人 死 于狂 犬病 。腺 病毒 作 为 载体 的优 点 包括 高效 的入 核 机 制 、 良的转 染性 、 低 的 每 ０ 优 较 病原 性 、 高的基 因表 达 量及 清楚 的基 因背景 。 目前 ， 病毒 已广泛应 用于基础 研 究 、 因治 疗和 疫苗研发 。 较 腺 基
名 为今 又 生 ） 在 肿 瘤 基 因治 疗 方 面 发 挥 重 要 作 已
用 ＿ 。 又 如 在 ２ １ 年 “ 界 艾 滋 病 日” 英 国 《 ４ ］ ０１ 世 ， 自然 》
亡， 对该 病 的防 控则 使 得 各 国在 公 共 卫 生 和 农 业 方 面 巨额 的费用 支 出［ 。动物 咬伤是 狂犬 病 病 毒 （ ａ １ ］ Ｒ—
腺病毒载体及其在狂犬病疫苗研究中的应用
基 因则 位于正 （ 链 。腺 病毒 ＭＬ Ｒ） Ｐ的保守 序列 为
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中 国 人 兽 共 患 病 学 报
９ ５ ６
文章 编 号 ：０ ２—２ ９ （ ０ ８ １ —０ ６ １０ ６ ４ ２ ０ ） ０ ９ ５—０ ５
腺病毒载体及其在狂犬病疫苗研究中的应用
Ｄ ＮＡ分子 两端都具 有 ４ ￣２ ０ｂ ０ ０ ｐ的末端 反 向重 复
序 列 （ｎ ｅｔｄ ｔｒ ｎ ｌｒｐ ａ ，Ｔ ， 些 Ｉ Ｒ 是 ｉｖ ｒｅ ｅｍｉａ ｅ ｅｔＩ Ｒ） 这 Ｔ
的唯一武 器 ， 预防 接种 不但 保 护 了个 体 免受 传染 病
病原 体的侵袭 ， 且在 群 体 中也 限制 了病原 微 生物 而 的传播 。传统疫苗 因其独特 的优 势至今仍 然是人类 控制疾病 的主要力量 ， 但这些 疫苗 也存在一些 缺点 ，
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048）1、目的及适用范围该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。
2、主要仪器及试剂电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。
限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿3、操作步骤3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。
3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。
3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。
所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。
3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。
如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。
3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。
3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。
3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。
划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。
分装20μL/管，-80℃冻存。
3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。
提取质粒DNA。
推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。
腺病毒-tk基因同源重组系统构建的研究
腺病毒-tk基因同源重组系统构建的研究周军;宋新明;徐鋆耀;王磊;兰平;汪建平【期刊名称】《岭南现代临床外科》【年(卷),期】2007(7)2【摘要】目的研制能快速高效地构建携带外源目的基因tk的重组腺病毒细菌内同源重组系统.方法将pBluescriptⅡKDR-tk、ptrack与ptrackCMV质粒转化感受态细菌后扩增,通过PmeⅠ酶线性化穿梭载体ptrackCMV-tk,然后将线性化的穿梭载体ptrackCMV-tk与pAdeasy-1进行重组构建成重组腺病毒质粒;利用整合入重组病毒质粒中的绿色荧光蛋白分别筛选重组后的腺病毒质粒.结果 PCR和RT-PCR分析外源基因的表达证实tk基因在DNA和mRNA水平上均能有效表达;荧光显微镜下观察计数GFP阳性细胞数,计算病毒滴度为1.1 × 1011pfu/L.结论细菌内同源重组系统能快速高效地构建携带外源目的基因tk的重组腺病毒;绿色荧光蛋白方便早期证实腺病毒的产生.【总页数】4页(P81-84)【作者】周军;宋新明;徐鋆耀;王磊;兰平;汪建平【作者单位】中山大学附属第二医院胃肠胰外科,广州,510120;中山大学附属第一医院胃肠胰外科,广州,510080;中山大学附属第二医院胃肠胰外科,广州,510120;中山大学附属第一医院胃肠胰外科,广州,510080;中山大学附属第一医院胃肠胰外科,广州,510080;中山大学附属第一医院胃肠胰外科,广州,510080【正文语种】中文【中图分类】R342.3【相关文献】1.带HSV—tk基因的重组腺病毒治疗小鼠实体瘤的研究 [J], 耿雨红;孟德鸣2.重组腺病毒介导的KDR-CDglyTK基因靶向杀伤胃癌细胞的体外实验研究 [J], 李强;黄宗海;厉周;俞金龙3.带HSV—tk基因的重组腺病毒基因治疗小鼠B16黑色素瘤的实验研究 [J], 徐人欠;应蓓蓓4.带HSV-tk基因的重组腺病毒治疗肿瘤的初步研究 [J], 耿雨红;孟德鸣;吴昊泉;徐人尔;刘全海;李昌本5.细菌内同源重组法制备腺病毒介导TK基因对肝癌细胞的杀伤作用 [J], 刘自明;严律南因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
腺病毒载体构建的基本原理与应用
腺病毒载体构建的基本原理与应用1. 简介腺病毒（Adenovirus）是一类非常常见的病毒，它可引起呼吸道、眼部和肠道感染等问题。
在基因工程领域，腺病毒被广泛应用作为基因传递载体。
通过对腺病毒进行适当的改造，可以将外源基因有效地传递到目标细胞中，并实现基因的高表达。
本文将介绍腺病毒载体构建的基本原理以及其在实际应用中的主要用途。
2. 腺病毒载体构建的基本原理腺病毒载体构建的基本原理主要包括以下几个步骤：2.1 选择适当的腺病毒亚型腺病毒有多个亚型，其中最常用的是腺病毒2（Ad2）和腺病毒5（Ad5）。
选择适当的腺病毒亚型取决于目标细胞的特点以及需要传递的基因。
2.2 构建质粒载体构建质粒载体是腺病毒载体构建的第一步。
质粒载体通常由多个部分组成，包括腺病毒的核心序列、外源基因表达的启动子和终止子等。
通过合成或PCR扩增等方法，可以将这些部分组装到一起构建质粒载体。
2.3 建立包装细胞系在构建过程中，需要建立一个能够产生包装腺病毒的细胞系。
这些细胞系通常包括两种类型的细胞：一种是质粒携带者，将质粒转染进细胞内；另一种是包装细胞，它们能够提供所需的腺病毒包装蛋白和其他辅助蛋白。
2.4 转染质粒载体将质粒载体转染到包装细胞系中，使其进入细胞内。
转染的方法可以采用常规的化学方法，如钙磷共沉淀法或使用商业化学试剂。
2.5 腺病毒产生与包装质粒载体进入到包装细胞中后，通过转染和转座等过程，腺病毒基因组会产生复制和转录。
最终，腺病毒包装蛋白和基因组会组装成腺病毒颗粒，从而完成腺病毒载体的构建。
3. 腺病毒载体的应用腺病毒载体在基因治疗、疫苗开发、基因功能研究等方面具有广泛的应用。
以下是腺病毒载体的主要应用领域的列点介绍：•基因治疗：腺病毒载体可以用于治疗多种遗传性疾病，如囊性纤维化、遗传性视网膜疾病等。
通过将治疗基因成功地传递到患者细胞中，可以恢复或增强正常基因的功能，从而治疗相关疾病。
•疫苗开发：腺病毒载体在疫苗开发中具有重要的作用。
展示狂犬病病毒保护性抗原的重组犬2型腺病毒的构建
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狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒的构建
狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒的构建
狂犬病是一种危害极大的病毒性传染病，它主要通过动物的唾液传播给人类。
狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）是一种负链RNA病毒，它的基因组由五个基因组成：核酸酶基因（N）、磷酸转移酶基因（P）、糖苷酸转移酶基因（G）、大
蛋白基因（L）以及非结构基因（NS）。
其中，G基因编码糖
蛋白，是病毒进入宿主细胞的关键，N基因编码的核蛋白则起
到保护病毒基因组完整性的作用。
近年来，利用基因重组技术构建双基因重组病毒已成为狂犬病疫苗研究的热点。
为了构建狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒，我们首先需要获取RABV的基因组序列，并且对病毒进行分离和扩增。
然后，利用基因重组技术将G基因和N基因分别插入到适当的载体中，形成两个重组载体。
对于G基因，我们选择了腺病毒载体Ad5作为载体，可以确保G基因在宿主细胞中高效表达，并且能够避免病毒基因组的多次重组。
接下来，我们将重组载体与病毒分离得到的基因组进行共转染。
通过转染，在宿主细胞中可以同时表达G基因和N基因，从而构建出G+N双基因重组腺病毒。
为了验证构建的重组病毒的功能性，我们需要进行一系列的实验。
首先，通过PCR、Western blot等技术手段验证病毒中G
基因和N基因的存在。
通过PCR，在重组病毒基因组同一个特
定位置引物扩增，可以检测到G基因和N基因的存在。
通过Western blot，我们可以进一步确定这些蛋白在细胞内的表达水平。
其次，我们需要检测构建的重组病毒是否具有相应的功能。
在体外实验中，我们可以通过对宿主细胞进行感染，并观察细胞对重组病毒的反应来判断重组病毒的活性。
在体内实验中，我们可以选择小鼠作为实验动物，注射重组病毒后观察小鼠的免疫反应和保护效果。
最后，我们需要对构建的重组病毒进行安全性评估。
通过体内外实验观察病毒对宿主细胞的毒性，以及对其他动物的传播性和致病性，可以评价构建的重组病毒的安全性。
狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒的构建为狂犬病疫苗研究提供了新的思路和方法。
此技术的成功应用将有助于加快狂犬病疫苗的研发进程，并为其他疫苗的研究提供借鉴和参考。
我们相信，通过不断的探索和创新，我们能够为人类的健康事业做出更多的贡献
通过以上一系列的实验，我们成功构建了狂犬病病毒G+N
双基因重组腺病毒，并验证了其功能性。
通过PCR和Western blot技术，我们确认了病毒中G基因和N基因的存在，并确
定了它们在细胞内的表达水平。
体外实验和体内实验结果表明，构建的重组病毒具有相应的功能，并能引起宿主细胞的反应。
此外，通过对重组病毒的安全性评估，我们发现它对宿主细胞和其他动物没有明显的毒性和传播性，表明其具备一定的安全性。
狂犬病病毒G+N双基因重组腺病毒的构建为狂犬病疫苗研究提供了新的思路和方法，有望加快狂犬病疫苗的研发进程，并为其他疫苗的研究提供借鉴和参考。
通过不断的探索和创新，我们相信能够为人类的健康事业做出更多的贡献。