CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定
CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定文兆海;周海滢;翟少华;陈凯云;胡远;简子健【摘要】为了探究CDV-N重组狂犬病病毒的毒力及对小鼠的免疫效果,将CDV-N 重组狂犬病病毒于BSR细胞上扩毒培养、浓缩后测定其FFD50及LD50;将浓缩后的重组病毒液与复合佐剂按一定比例混匀,按不同免疫剂量、不同免疫方式分组免疫接种小鼠,利用ELISA试剂盒对狂犬病、犬瘟热的特异性抗体进行定性/定量检测.结果显示,重组病毒浓缩后的FFD50值为7.85 logFFD50/0.1 mL,LD50值为7.67 logLD50/0.03 mL;免疫接种后第14天抗体阳性率达100％,小鼠血清中的特异性抗体IgG水平随着免疫剂量的递增而递增.试验结果可为CDV-N重组狂犬病病毒制备口服弱毒疫苗的进一步研究提供试验数据.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】7页(P21-27)【关键词】重组狂犬病病毒;半数荧光灶形成量;半数致死量;免疫;抗体【作者】文兆海;周海滢;翟少华;陈凯云;胡远;简子健【作者单位】新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052;新疆农业大学动物医学学院 ,新疆乌鲁木齐 830052【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的以侵犯中枢神经系统为特征的一种高度致死性人兽共患传染病[1-2]。
患病动物的唾液中含有大量的RV，一般通过咬伤的方式，RV经唾液进入伤口沿着外周神经向中枢神经系统进犯，一旦到达大脑神经中枢，则引发狂犬病[3-4]。
而犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的病死率高达80%以上的一种急性高度接触性传染病，具有极强传染性[5]。
目前，预防狂犬病、犬瘟热最为有效的方法就是疫苗接种，在全球范围内应用最广的就是灭活苗。
DNA疫苗、弱毒活疫苗、活病毒载体苗大多还处于研发或临床试验中，灭活疫苗虽然安全性好，但对大多数发展国家及广大农村地区来说免疫成本较高，不利于广泛推广应用[6-7]。
弱毒活疫苗相对灭活疫苗来说，其免疫原性好、生产成本低廉，但由于弱毒疫苗在动物体内存在反毒现象，所以世界卫生组织对于弱毒疫苗主要推荐口服免疫方式，使得基因重组弱毒口服疫苗成为了众多科研工作者的研究热点。
Faber M 等[8-9]构建额外增加1个或2个G基因的重组RV弱毒株，并对G基因333位进行了点突变，显著提高了G蛋白的表达量。
2012年王喜军[10]构建了表达狂犬病G蛋白的重组犬瘟热病毒，免疫试验表明该重组病毒具有良好的免疫原性。
2016年刘澜等[11]成功构建了表达3个G基因的重组狂犬病病毒RV-r3G株，使得G蛋白的表达量显著提高，且外周感染对小鼠的致病力降低。
本研究旨在对犬瘟热病毒N基因(Canine distemper virus N gene，CDV-N)重组狂犬病病毒的半数荧光灶形成量(fluorescence focus dose，FFD50)及半数致死量(median lethal dose，LD50)进行测定，通过不同免疫方式、不同免疫剂量免疫小鼠，摸索其最佳免疫方式及最佳免疫剂量，初步探究CDV-N重组狂犬病病毒作为犬瘟热-狂犬病二联口服弱毒疫苗株的潜力。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 3日龄乳鼠、20 g±3 g昆明小鼠，购于新疆医科大学实验动物中心。
1.1.2 细胞、毒株及其他主要材料 BSR细胞，新疆天康生物股份有限公司惠赠；CDV-N重组狂犬病病毒，由本研究团队构建、拯救并于新疆农业大学动物病理实验室保存；狂犬病阳性血清，长春兽医研究所产品；FITC标志的兔抗犬IgG，北京博奥森公司产品；MRC血清，江苏恩莫阿赛生物技术有限公司产品；DMEM培养基、胰酶替代物、双抗，美国Gibco公司产品；Amicon Ultra超滤管，Merck公司产品；小鼠狂犬病抗体IgG定量检测试剂盒购，美国4adi公司产品；小鼠犬瘟热抗体IgG定量检测试剂盒，上海酶免公司产品；小鼠狂犬病抗体IgG定性检测试剂盒、小鼠犬瘟热抗体IgG定性检测试剂盒，上海酶联生物公司产品；灌胃针、无菌注射器，新疆子奇生物公司产品。
1.1.3 主要仪器 LSM800激光共聚焦显微镜，德国ZEISS公司产品；Galaxy170R CO2培养箱，德国Eppendorf公司产品；酶标仪，美国Bio-Rad公司产品。
1.2 方法1.2.1 重组狂犬病病毒的扩毒、浓缩及滴度测定将拯救成功的重组病毒按同步接毒的方法进行扩毒培养：①待BSR细胞长满时，弃液，PBS清洗3遍后加入胰酶替代物消化细胞。
②将重组病毒液按1∶3的量添加至BSR细胞悬液中(即将2 mL的重组病毒液加入含6 mL细胞悬液的75 cm2的细胞培养瓶中)，于37℃、体积分数为5% CO2培养箱中放置1 h，每10 min感作一次。
③向感作后的病毒细胞混合液中添加适量的含30 mL/L血清的完全培养液均分到2个培养瓶中，于37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养48 h后，于-20℃冰箱中反复冻融4次后收毒，以待后续浓缩。
重组狂犬病病毒的浓缩：①将回收的病毒液分装到50 mL的离心管中，4℃、2 000 r/min离心15 min沉淀细胞碎片;②用一次性无菌注射器吸取上清，经0.22μm的细菌滤器过滤;③转移滤液至超滤管中，4℃、6 000 r/min离心20 min～60 min，收集浓缩病毒液。
浓缩重组病毒的滴度测定：将浓缩后的重组病毒液倍比稀释至10-10(即100～10-10)，取10-4～10-10进行试验，消化细胞，铺板，同步接毒；40 mL/L多聚甲醛溶液固定细胞，PBS洗板3次；50 g/L脱脂奶粉封闭细胞，PBS洗板3次；加入1∶1 000配比的一抗感作，PBST洗板3次，再加二抗结合，PBST洗板3次；最后滴加适量80%甘油保护荧光；倒置荧光显微镜观察、计数。
利用Reed & Muench法计算FFD50，公式如下：感染起始稀释度对数与50%感染终点稀释度对数之差，(50%-低于50%感染的百分数)/(高于50%感染的百分数-低于50%感染的百分数)×倍比稀释的对数1.2.2 浓缩重组病毒的半数致死量测定试验①将浓缩后的病毒液按100～10-10作倍比稀释，将3日龄乳鼠按10-1 ～10-10滴度分成10组，每组10只进行试验，取10只乳鼠接种DMEM培养基作对照组;②碘酊、酒精涂抹消毒后，用微量注射器吸取病毒液0.03 mL/只乳鼠脑内注射;③连续21 d观察各组乳鼠的死亡情况并统计，按Reed-Muench法计算LD50。
公式如下：LogLD50=高于50%病毒稀释倍数+距离比×稀释系数的对数。
距离比=(高于50%死亡的百分数-50%)/(高于50%死亡的百分数-低于50%死亡的百分数)1.2.3 小鼠按不同免疫剂量、不同免疫方式进行分组免疫分组情况如下：第1组为复合佐剂50 μL+病毒液50 μL，第2组为复合佐剂150 μL+病毒液150 μL，第3组为复合佐剂300 μL+病毒液300 μL，第4组为复合佐剂50 μL+病毒液50μL，第5组为复合佐剂150 μL+病毒液150 μL，第6组为复合佐剂300 μL+病毒液300 μL，第7组为亲本毒株SRV9口服600 μL作为对照。
具体情况如表1所示。
表1 实验动物分组、免疫和检测时间表Table 1 Grouping,immunization and testing schedules of laboratory animals组别Groups免疫方式Immune mode免疫次数/次Immunization times试验动物数量Number of experimental animals免疫剂量/μLImmunizing dose免疫时间/dImmunetime检测时间/dDetection time第1组 First group口服 Oral administration341000,7,147,14,21,35,49第2组 Second group口服 Oral administration343000,7,147,14,21,35,49第3组 Third group口服 Oral administration346000,7,147,14,21,35,49第4组 Fourth group注射Injection341000,7,147,14,21,35,49第5组 Fifth group注射Injection343000,7,147,14,21,35,49第6祖 Sixth group注射Injection346000,7,147,14,21,35,49第7组 Seventh group口服 Oral administration346000,7,147,14,21,35,49复合免疫佐剂(分别将氢氧化锌0.8 mg、细菌脂多糖100 μg、甘露低聚糖10 mg、枸杞多糖50 mg加入1 mL蒸馏水中溶解混匀)与浓缩病毒液按1∶1混匀，通过灌喂和腿部肌肉注射的方式免疫小鼠。
分别于免疫接种后第7天、第14天、第21天、第35天、第49天进行断尾采血，静置离心，吸取血清，严格按照ELISA 试剂盒的说明进行操作，对免疫后小鼠血清中特异性抗体IgG水平进行检测。
免疫期间每天观察各组小鼠有无狂犬病的临床表现，有无死亡情况，如有小鼠死亡则对其进行病理剖检及病理组织学检查，查找死亡原因。
2 结果2.1 浓缩重组病毒的滴度测定结果如表2所示，根据不同视野下细胞的感染数，代入Reed & Muench公式计算FFD50的值等于10-7.85，即50%感染终点稀释度(FFD50)=10-7.85。
表2 重组狂犬病病毒感染细胞的百分比Table 2 Percentage of cells infected with recombinant rabies virus病毒稀释倍数Virus dilution 含感染细胞的视野数Visual field number of infected cells含感染细胞的视野Visual field number of infected cells不含感染细胞的视野Field of vision without infected cells含感染细胞视野的百分比Percentage of visual field with infectedcells10-410/1059059/59=100%10-510/1049049/49=100%10-610/1039039/39=100%10-710/1029029/29=100%10-89/1019119/20=95%10-96/10949/13=69%10-103/10373/10=30%2.2 浓缩重组病毒液的半数致死量(LD50)测定结果经21 d观察乳鼠的死亡情况如表3所示，按Reed-Muench计算重组病毒的LD50。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
狂犬病病毒实验室检测方法
狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。
一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。
现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。
关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。
RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。
脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。
据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。
尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。
中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。
检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。
下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。
1、狂犬病病毒形态特征RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。
电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。
病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。
重组伪狂犬病毒(rPRV-GP5)对伪狂犬病最小免疫剂量的测定
（ ＰＲＶ— ｒ ＧＰ５ ｇ ｉ ｓ ｓ ｕ ｏ ａ ｉｓ ｉ ｈ ｅ ）ａ ａｎ ｔｐ ｅ ｄ ｒ ｂ ｅ ｎ ｓ ｅ ｐ
ＴＩ ＡＮ ｈ — ｕ Ｊ Ｎ ＤｉＩＩＧｕ ｘｎ， ＨＯＵ ｎ— ｕ ＱＩ Ｈｕ Ｚ ｉ ｊｎ，Ｉ ，． ｏ— ｉ Ｚ Ｙａ ｊｎ， Ｕ ａ—ｊ。 ｉ
Ｒｅ ｅ ｒｈ Ｉ ｓｉｕ ｅ Ｃｈｎ ｓ ａ ｅ ｆＡｇ ｉｕｔ ｒ ｌＳ ｉｎ ｅ， ｒ ｉ ５ ０ １ Ｃ ｎ ） ｓ ａ ｃ ｎ ｔｔ ｔ ， ｉｅ ｅＡｃ ｄ ｍｙｏ ｒｃ ｌｕ ａ ｃｅ ｃ Ｈａ ｂｎ １ ０ ０ ， ｈｉａ
物 以发 热 、奇痒 （ 除外 ）及脑 髓 炎 为主要 症状 的急 性传 染 病 。猪是 该病 毒 的 中 间宿 主和传 染 源 ，感 猪 染后可 引起 妊娠 母 猪发生 严重 的繁 殖 障碍 造成 死胎 、流 产和 木乃 伊 胎 ，患 病仔猪 表现 为神 经症 状 和 呼 吸道 病 ，多 以死 亡告 终 。在 规模 化 、集 约化 、现 代 化高密 度 养猪 地 区 ，Ｐ Ｖ 可 在猪 群 问不 断传 播 ，是 Ｒ 危害 我 国养猪业 的一个重 要传 染病 。用疫 苗进 行免疫 接种 是 预 防 、甚至 消 灭伪 狂 犬病 的根 本措 施 。 目 前伪 狂 犬病疫 苗 在我 国应用 最 多的 是 Ｂ ｒｈ — １株 ， 疫苗 是 ２ ａｔ ａＫ６ 该 Ｏ世 纪 ６ Ｏ年代 匈 牙利 Ｂ ｒｈ ａｔａ等人 将野 毒株用 鸡胚 成纤 维 细胞反 复传 代而 获 得 的一个 人工致 弱 疫苗 株 ， 该毒 株 呈现 ｇ 一 因缺 失表 型 ， 毒 力 Ｅ基 其 大大 减弱 ，免疫 原性 很好 ，是世界 上公认 的优 良疫 苗株 。 我们 以 Ｂ ｒｈ — １株 为载体 构 建 了表达 猪繁殖 与 呼吸综 合 征病 毒 （ ＲＲ Ｖ） Ｈ—ａ株 Ｇ ５基 因的 ａｔ ａＫ６ Ｐ Ｓ Ｃ ｌ Ｐ 重组 伪 狂犬 病病 毒 （Ｐ Ｖ— ５ ， ＧＰ 基 因 的插入 是 否 会改 变伪 狂 犬病 病 毒 Ｂ ｒ ａＫ６ ｒ Ｒ ＧＰ ） 但 ５ ａｔ — １株对 伪 狂 犬 ｈ 病 的免疫 保 护效 力 ？ 此本 研究 通过 测定 重 组伪狂 犬病 毒 （Ｐ Ｖ— ５ 对 伪狂 犬 病 的最小 免疫 剂 量 ， 为 ｒ Ｒ ＧＰ ） 评 价 ｒ ＲＶ— ５对伪 狂犬 病 的保护 效力 。２ Ｐ ＧＰ ４只 ５ ６月龄 Ｐ Ｖ 阴性健 康 绵羊 随机 分成 ６ ， ～ Ｒ 组 每组 ４只 ， 其 中 １ 为 生 理盐 水 对 照 组 ， 组 其余 ５ 分 别后 腿 肌 注 重组 伪 狂 犬 病 毒 （Ｐ 组 ｒ ＲＶ— ５ 冻 干疫 苗 （ 毒 含量 为 ＧＰ ） 病
狂犬病病毒检测方法的研究进展
狂犬病病毒检测方法的研究进展
蔡翼虎;王玉芳;严雪仙
【期刊名称】《浙江畜牧兽医》
【年(卷),期】2009(34)2
【摘要】狂犬病病毒（RV）属弹状病毒科、狂犬病病毒属，病毒呈杆状，一端扁平，另一端钝圆，长180～250nm，宽75nm，基因组为12kb的单股负链RNA，从3’端至5’端依次为N、Ns、M、G、L五个结构基因，分别编码五种结构蛋白，即核蛋白（N）、磷酸化蛋白（NS）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和转录酶蛋白（L）。
狂犬病是由狂犬病病毒引起的急性自然疫源性传染病，主要侵害中
枢神经系统，动物表现极度兴奋，狂燥不安和意识障碍，最后麻痹死亡，所有温血动物均可感染，为人畜共患的急性传染病，一旦发病，病死率高达100％。
【总页数】2页(P12-13)
【作者】蔡翼虎;王玉芳;严雪仙
【作者单位】桐乡市畜牧兽医局,浙江桐乡,314500;衢州市衢江区畜牧兽医局;衢州
市衢江区畜牧兽医局
【正文语种】中文
【中图分类】S852.63
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1.猪伪狂犬病毒分子生物学检测方法研究进展 [J], 于新友;李天芝;高鹏;王金良
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犬瘟热病毒CDV-1株的分离鉴定、毒力及免疫原性的研究的开题报告
犬瘟热病毒CDV-1株的分离鉴定、毒力及免疫原性的研究的开题报告一、研究背景与意义：犬瘟热（Canine distemper，CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）引起的一种病毒性传染病。
其病原体CDV属于Paramyxoviridae科Morbillivirus 属，具有强传染性和高致病性，可引起犬及其他野生动物家畜的多系统感染，导致生命危险或重度残疾。
CDV的基因组结构比较稳定，但在世界范围内存在着多种毒株，因而其流行情况具有地域性和谷地性。
近年来，随着经济全球化和人类活动的加强，CDV也呈现出快速扩散的趋势，尤其是在我国野生动物保护区、宠物犬散养等地方，成为了重大威胁犬类健康的病害之一。
基于此，开展CDV的分离鉴定、毒力和免疫原性的研究，对于制定科学的预防和控制策略具有重要意义。
二、研究目的和内容：本研究的目的是从患病犬类呼吸、消化、神经等相关组织中分离CD病毒，并通过病毒特异性PCR和序列比较等技术手段鉴定其毒株属种，确认其致病力和免疫原性，并探讨其相关的流行病学学问题。
具体内容：1. 收集犬瘟热确诊病例相关标本，包括血液、粪便、分泌物等；2. 采用细胞培养技术，分离病毒（CDV-1）；3. 进行病毒特异性PCR和序列比较，鉴定CDV-1毒株属种；4. 利用实验动物评价CDV-1毒株的毒力和免疫原性；5. 探讨CDV-1流行病学问题。
三、研究方法：1. 采样：从确诊的犬瘟热病例中采集患犬的血液、粪便、分泌物等样本；2. 病毒分离：利用细胞培养技术，从样本中分离出病毒（CDV-1）；3. PCR检测：运用病毒特异性PCR技术对CDV-1病毒进行检测；4. 序列比较：对PCR产物通过DNA序列比较，得到CDV-1的序列，并与NCBI数据库中已有的序列进行比对和鉴定；5. 毒力和免疫原性的研究：采用实验动物评价CDV-1毒株的毒力和免疫原性；6. 流行病学调查：通过问卷调查等方法，了解CDV-1在当地的流行病学特征。
狂犬病病毒CTN株不同代次在Vero细胞培养的病毒滴度和免疫原性的比较
狂犬病病毒CTN株不同代次在Vero细胞培养的病毒滴度和
免疫原性的比较
张玉慧;高春润;潘广彧;赵钢;张东阳;秦贤;俞永新
【期刊名称】《中国生物制品学杂志》
【年(卷),期】1998(11)2
【摘要】狂犬病病毒CTN株在Vero细胞上连续传代，并对其病毒滴度、效力和抗原量分别进行检测，结果发现在10～15代病毒滴度、效力和抗原量均高于其它代次，差异具有显著性意义。
因此，可以确定CTN株10～15代为疫苗生产用最佳代次毒种。
【总页数】3页(P90-92)
【关键词】狂犬病病毒;毒种代次;细胞培养;病毒滴度;免疫
【作者】张玉慧;高春润;潘广彧;赵钢;张东阳;秦贤;俞永新
【作者单位】沈阳生物工程公司;沈阳生物工程公司;中国药品生物制品检定所【正文语种】中文
【中图分类】R512.990.1;R392.33
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1.不同狂犬病毒毒株在Vero细胞上培养的病毒滴度与免疫原性比较 [J], 蒋茨蕾;梁名践;鲁宏;潘丽静
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CDVN重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定
动物医学进展,2019,40(4):21-27Progress in Veterinary MedicineCDV-N 重组狂犬病病毒的毒力及其免疫原性测定文兆海，周海產，翟少华，陈凯云，胡远，简子健*(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐830052)摘 要：为了探究CDV-N 重组狂犬病病毒的毒力及对小鼠的免疫效果，将CDV-N 重组狂犬病病毒于BSR 细胞上扩毒培养、浓缩后测定其FFDg 及LD 5o ；将浓缩后的重组病毒液与复合佐剂按一定比例混匀.按不同免疫剂量、不同免疫方式分组免疫接种小鼠，利用ELISA 试剂盒对狂犬病、犬瘟热的特异性抗体进行定 性/定量检测。
结果显示，重组病毒浓缩后的FFD 50值为7.85 logFFD 5o/0.1 mL,LD 5。
值为7.67 logLD 50/0.03 mL ；免疫接种后第14天抗体阳性率达100%,小鼠血清中的特异性抗体IgG 水平随着免疫剂量的递增而递增。
试验结果可为CDV-N 重组狂犬病病毒制备口服弱毒疫苗的进一步研究提供试验数据。
关键词：重组狂犬病病毒；半数荧光灶形成量；半数致死量；免疫；抗体中图分类号：S852.659.5狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus, RV)引 起的以侵犯中枢神经系统为特征的一种高度致死性 人兽共患传染病⑴幻。
患病动物的唾液中含有大量的RV, —般通过咬伤的方式，RV 经唾液进入伤口 沿着外周神经向中枢神经系统进犯，一旦到达大脑神经中枢,则引发狂犬病°4〕。
而犬瘟热是由犬瘟热文献标识码：A 文章编号：1007-5038(2019)04-0021-07病毒(Canine distemper virus, CDV )引起的病死率高达80%以上的一种急性高度接触性传染病，具有 极强传染性⑸。
目前，预防狂犬病、犬瘟热最为有效的方法就是疫苗接种，在全球范围内应用最广的就是灭活苗。
DNA 疫苗、弱毒活疫苗、活病毒载体 苗大多还处于研发或临床试验中，灭活疫苗虽然安收稿日期:2018-03-12基金项目：国家自然科学基金项目(31360623)作者简介：文兆海(1990-),男，广西北海人，硕士研究生，主要从事兽医分子病理与免疫病理学研究。
狂犬病病毒CVS株N基因的原核表达、纯化及鉴定
狂犬病病毒CVS株N基因的原核表达、纯化及鉴定狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的急性传染病，对人和动物的健康造成严重威胁。
狂犬病病毒属于负链RNA病毒，具有高度的遗传变异性，目前世界上已发现了多个不同的血清型。
其中，狂犬病病毒CVS株是一种常用的实验模式病毒，其研究对于狂犬病的防控和治疗具有重要意义。
本文主要介绍狂犬病病毒CVS株N基因的原核表达、纯化及鉴定方法。
首先，进行狂犬病病毒CVS株N基因的原核表达，需构建相应的表达载体。
常用的载体有pET系列载体，该系列载体具有强大的原核表达能力。
一般选用pET28a(+)载体，该载体具有His标签，方便后续蛋白的纯化。
将CVS株N基因克隆至pET28a(+)载体重限制性内切酶切位点，得到重组的表达载体。
然后将该载体转化至大肠杆菌宿主菌中，如BL21(DE3)菌株，通过添加异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达N基因蛋白。
接下来，对原核表达的CVS株N基因蛋白进行纯化。
首先，通过离心将菌体沉淀，裂解细菌细胞，释放出包含目标蛋白的细胞裂解液。
接着，可以利用His标签进行蛋白的亲和层析纯化。
令牛津呼叫抗原为例，将菌液加载至Nickel柱中，重组蛋白与Ni2+离子的亲和性较强，能够结合在柱中，而其他蛋白则流出柱外。
然后，通过洗脱的方法将结合在柱中的目标蛋白洗脱下来，得到纯化的N基因蛋白。
纯化后，需要对CVS株N基因蛋白进行鉴定。
常用的方法有SDS-PAGE和Western blotting。
首先，通过SDS-PAGE可以对蛋白进行大小的初步判断。
将纯化后的蛋白样品进行电泳分离，然后通过染色或银染对蛋白进行可视化。
其次，通过Western blotting可以对蛋白进行进一步确认。
将分离电泳后的蛋白转移到聚丙烯酸酯薄膜上，然后使用特异性的抗体进行检测。
例如，可以利用抗狂犬病病毒N蛋白的抗体进行反应。
通过观察蛋白与抗体的特异性结合，确定纯化后的CVS株N基因蛋白。
总之，对于狂犬病病毒CVS株N基因的原核表达、纯化及鉴定，本文介绍了一种常用的方法。
狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗免疫效果评价
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病是当前危害养犬业的三种重要传染病。
为探讨狂犬病毒（RABV ）、犬瘟热病毒（CDV ）和犬细小病毒（CPV ）灭活制备三联灭活疫苗的可行性，将该3种病毒HEP-Flury 株、LN （10）1株和JL （18）1-Beagle 株分别在BHK-21、Vero/DogSLAM （VDS ）和F81细胞培养，经β-丙内酯灭活剂灭活后，分别与三种不同类型免疫佐剂（MONTANIDE GEL 02、ADJ-801(W)、Al(OH)3）配制成三联灭活疫苗。
疫苗经三次免疫比格犬后，通过测定动物血清抗体水平和攻毒保护情况评价其免疫效果。
实验结果显示，不同佐剂的三联灭活疫苗对增强比格犬RABV 、CDV 和CPV 血清抗体应答反应效果不同。
其中ADJ-801（W ）佐剂能显著提高针对RABV 、CDV 和CPV 三种病毒的抗体水平，疫苗三次免疫比格犬后血清抗体效价分别为7.4 EU/mL 、1∶50和1∶1024；而Al(OH)3佐剂效果较差，三免后抗体效价分别为4.01 EU/mL 、1∶6和1∶256。
疫苗三次免疫后，分别应用强毒CDV SD （14）7株和CPVJL （18）1-Beagle 株对比格犬进行攻毒实验，实验结果显示，ADJ-801（W ）组对SD （14）7和JL （18）1-Beagle 攻毒保护率均为100%，MONTANIDE GEL 02组攻毒保护率均为60%，而Al(OH)3组攻毒保护率均为0，表明ADJ-801（W ）佐剂制备的狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗对比格犬提供较好的免疫保护作用。
本研究为犬狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗的研制奠定了基础。
关键词：狂犬病病毒；犬瘟热病毒；犬细小病毒；灭活疫苗；佐剂中图分类号：S858.292文献标志码： A文章编号：1674-6422（2023）03-0082-09Evaluation of the Effi cacy of Inactivated Triplex Vaccine of Rabies-CanineDistemper-Canine ParvovirusGONG Chengyan 1,2, CHEN Jie 3, PAN Hongjun 1,4, LUO Guoliang 1, LIU Mengjia 5,HU Bo 1, ZHAO Jianjun 2(1. Key Laboratory of Special Animal Epidemic Disease of Ministry of Agricultural rural affairs, Institute of Special Economic Animal and Plant Sciences, CAAS, Changchun 130112, China; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 3. College of Veterinary Medicine, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 4. College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 5. Jinan Customs District, Jinan 250200, China)收稿日期：2020-12-27基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFD0501600）；黑龙江八一农垦大学引进人才科研启动计划（XYB201912）；国家自然科学基金（31972714）作者简介：龚成燕，女，硕士，主要从事动物病原学研究；陈杰，男，博士，主要从事动物病原学与免疫机制研究通信作者：赵建军，E-mail：********************.cn;胡博，E-mail：****************狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗免疫效果评价龚成燕1,2，陈 杰3，潘虹军1,4，罗国良1，刘梦佳5，胡 博1，赵建军2（1.中国农业科学院特产研究所 农业农村部经济动物疫病重点实验室，长春130112；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆163319；3.西北农林科技大学，杨凌712100；4.吉林农业大学中药材学院，长春130112；5.济南海关，济南250200）2023,31(3):82-90Abstract: Rabies, canine distemper and canine parvovirus disease are three important contagious diseases, threatening the dog-raising industry. To evaluate the immunogenicity of inactivated triplex Rabies virus (RABV), Canine distemper virus (CDV), Canine parvovirus· 83 ·龚成燕等：狂犬病、犬瘟热和犬细小病毒病三联灭活疫苗免疫效果评价第31卷第3期狂犬病是由弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus ）的狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）引起的急性中枢神经系统症状的人兽共患传染病[1]。
狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I_型干扰素作用的差异分析
华南农业大学学报 Journal of South China Agricultural University 2024, 45(2): 190-198DOI: 10.7671/j.issn.1001-411X.202211015肖宇, 吴凡, 张宝石, 等. 狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析[J]. 华南农业大学学报, 2024, 45(2): 190-198.XIAO Yu, WU Fan, ZHANG Baoshi, et al. The different regulatory effect of glycoproteins from virulent and attenuated strain of rabies virus on type I interferon signaling pathway[J]. Journal of South China Agricultural University, 2024, 45(2): 190-198.狂犬病病毒强、弱毒株糖蛋白调节I型干扰素作用的差异分析肖 宇，吴 凡，张宝石，徐孟磊，龙家慧，罗 均，郭霄峰，罗永文(华南农业大学 兽医学院/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室, 广东 广州 510642)摘要: 【目的】狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus，RABV)引起的一种高致死性人兽共患传染病。
I型干扰素(IFN-I)通路在抵抗RABV感染中发挥重要作用。
RABV可通过磷蛋白及核蛋白的功能逃逸IFN-I的抗病毒作用，本研究旨在探讨对RABV的致病性有重要影响的糖蛋白(Glycoprotein，G)在调节IFN-I通路方面扮演怎样的角色。
【方法】将RABV弱毒株Hep-Flury的G基因替换成致病株CVS-11的G基因，拯救得到重组病毒HepG，分析Hep-Flury、CVS-11和HepG这3种毒株在体内和体外感染对IFN-I通路激活和调控的差别，比较它们在神经细胞中对抗IFN-I抗病毒作用的差异性。