技能训练2 细菌标本片的制备和染色法
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法
一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法
二、设备材料
病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。
三、操作方法
细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。
(一)细菌涂片的制备
1．液体培养物及液体病料
(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。
(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。
(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。
2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。
(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。
(三)细菌的染色法
1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。
(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。
(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓
冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
(3)姬姆萨氏染色法先将姬姆萨染色液原液稀释成常用的姬姆萨染色液(取5—10滴原液于5ml新煮过的中性蒸馏水中，混合均匀)，在经甲醇固定好的涂片上滴加足量的染色液，或将涂片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30min或浸染数小时至24h后取出，水洗，吸干或烘干后镜检。
2．复染色法应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。
(1)革兰氏染色法在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染色1～2min后→水洗→再加革兰氏碘液，作用1～2min后→水洗→加95％酒精脱色0.5～lmin后→水洗→加稀释石炭酸复红(或沙黄、番红)染色液复染0．5min后→水洗→干燥→镜检。
(2)抗酸染色法常用的有萋一尼氏染色法和沙黄一美蓝染色法(因此法主要用于布氏杆菌的染色，故又称为布氏杆菌染色法)。
①萋一尼氏染色法在已于燥、固定好的涂片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，酒精灯
火焰上方微微加热至冒出蒸气并维持3～5min，水洗；再用3％盐酸酒精脱色至无染液流出，充分水洗；然后用碱性美蓝染液复染约lmin，水洗，吸干，镜检。
②沙黄一美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的沙黄染色液，酒精灯火焰上方微微加热使冒蒸气3—5次，维持1～2rain，水洗；再用3％盐酸酒精脱色至无染液脱出，充分水洗；然后用碱性
图实6 细菌涂片的制备和单染色法
1.接种环灭菌2．滴生理盐水3．钩菌4．涂布5．干燥6．固定7．滴加染色液8．染色9．水洗10．干燥
美蓝染液复染约lmin，水洗，吸干，镜检。
注意事项：
1．作细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。
2．固定必须确实，火焰固定时不宜温度过高，以免造成菌体结构破坏。
3．每种染液染色的过程中应保持染色液不干，尤其加热染色的染液，在染色过程中应随时添加，以免蒸发干，影响染色效果。
4．每种染液染色后，应用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。
四、技能考核评分标准
优能熟练进行细菌培养物涂片制备和染色
良能比较熟练地进行细菌培养物涂片的制备和染色
及格操作技术一般
不及格操作技术较差
常见细菌染色方法汇总
常见细菌染色方法汇总 常见的染色方法包括简单染色、负染色、革兰氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、荚膜染色、死活染色。制备细菌染色片一般要经过涂片、固定、染色、水洗、干燥等步骤，然后用显微镜甚至油镜观察。 简单染色： 不同细菌或者由于观察者所侧重观察的内容不同，所以使用的染料也有差异，但是简单染色的方法是一样的。先按照上述的制片方法制片，制成需要观察的玻片后，使用相对应的染料滴加到玻片上的菌膜区域，以覆盖菌膜为准。按照不同染料的要求，结合所观察的内容确定染色时间，染色时间到达时，进行水洗，干燥等步骤。最后得到的玻片加盖盖玻片即可进行镜检。如有需要可以后续再进行油封、蜡封等封片过程。简单染色过程如下图： 负染色： 制备观察图片是非常容易的，但是对初学者来说想要在玻片中找到目标菌还是有一定难度的，因为细菌常常无色透明且比较小，所以对初学者来说除非对光圈等进行很精细的调节，否则很难观察到目标菌，因此进行负染色就十分重要。该方法是将微生物与苯胺黑或者india墨水混合，再将混合物覆盖于载玻片表面，由于这两种天然黑色染料不能渗入微生物细胞，所以使得透明的微生物个体在黑色的背景下很容易观察。负染色法常见有两种操作方法。 第一种发个方法比较常见，在一个载玻片上将微生物与异地苯胺黑混合，用另外的载玻片将混合物均匀的覆盖于原来的载玻片上。该方法的目的是使混合物在在玻片上一边厚一边薄，在厚与薄中间的额区域就是最佳观察区域。如图所示：
第二种方法是用一接种环苯胺黑与微生物混合，用接种针在载玻片的中央将混合物延伸很小的区域。具体操作如图所示： 革兰氏染色： 革兰氏染色是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。细菌先经碱性染料结晶紫染色，而后经碘液进行媒染，之后用酒精脱色，在一定条件下有的细菌媒
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法 一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法 二、设备材料 病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。 三、操作方法 细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。 (一)细菌涂片的制备 1．液体培养物及液体病料 (1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 (2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。 (3)固定分为火焰固定和化学固定两种。火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。 (4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。 2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。 (二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。 (三)细菌的染色法 1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。 (1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。 (2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓 冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。 (3)姬姆萨氏染色法先将姬姆萨染色液原液稀释成常用的姬姆萨染色液(取5—10滴原液于5ml新煮过的中性蒸馏水中，混合均匀)，在经甲醇固定好的涂片上滴加足量的染色液，或将涂片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30min或浸染数小时至24h后取出，水洗，吸干或烘干后镜检。 2．复染色法应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。 (1)革兰氏染色法在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染色1～2min后→水洗→再加革兰氏碘液，作用1～2min后→水洗→加95％酒精脱色0.5～lmin后→水洗→加稀释石炭酸复红(或沙黄、番红)染色液复染0．5min后→水洗→干燥→镜检。 (2)抗酸染色法常用的有萋一尼氏染色法和沙黄一美蓝染色法(因此法主要用于布氏杆菌的染色，故又称为布氏杆菌染色法)。 ①萋一尼氏染色法在已于燥、固定好的涂片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，酒精灯
细菌的抹片制做及染色
实验三细菌的抹片制做及染色 【目的要求】 (1)了解细菌简单染色法和革氏染色法的原理 (2)掌握细菌抹片标本的制备及几种常用染色法的操作步骤 【器材】 (1)大肠杆菌、葡萄球菌、巴氏杆菌等18．24小时液体培养物和斜面培养物。 (2)美蓝染色液、革兰氏染色液和瑞特氏染色液。 (3)载玻片、接种环、酒精灯、染色架、蜡笔、吸水纸等。 【原理】 细菌个体微小，无色而半透明，折光性弱，在普通光学显微镜下观察活细胞时，只能见其大致轮廓。必须制成抹片标本，应用适当染料染色后，才能较清楚地观察到细菌的形态及某些构造。此外，还可根据细菌呈现出的不同颜色反应而对其进行鉴别。 【内容和方法】 (一)细菌抹片标本的制备 1.抹片根据所用材料不同，抹片的方法亦有差异 (1)固体培养物用经酒精灯火焰烧灼灭菌后的接种环，蘸取无菌蒸馏水(无菌肉汤、生理盐水均可)一环于清洁无油脂的载玻片中央，再钩取细菌的固体接着物少许混于蒸镏水中，涂抹成直径为1—1．5cm大小的均匀菲薄的抹片。 (2)液体培养物可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1．2环，涂抹于玻片上即可。但应注意净管底Iili物摇匀，以免影响涂片效果。 (3)组织涂片用灭菌的剪刀镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为肝脾组织，脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹于玻片上。无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于染色和观察。 2.干燥将抹片置于空气中让其自然干燥 3固定固定的方法因材料不同而异： (1)火焰固定细菌培养物抹片，常采用火焰固定法，即将已干 燥的抹片菌膜面向上，以钟摆速度在酒精灯火焰上通过数次 (用手背触及抹片反面，以不烫手为宜)。 (2)化学固定血液、组织等抹片常用此法固定，即以数滴甲 醇滴加在玻片上，固定3．5min。 抹片经固定后便粘附于玻片上而不易被水冲掉，并能改变细菌对染料的通透性，增加与染料的亲和力而更容易着色，同时多数细菌能被杀死。 (二)细菌的常用染色方法 1.简单染色法只用一种染料进行染色的方法。染色后一般只能显示出细菌的外形、大小及排列。 美蓝染色法在已固定的细菌抹片上，滴加美蓝染色液染i．2min，水洗，干后镜检。结果细菌呈蓝色。 2、复杂染色法用两种或两种以上的染料进行染色的方法。结果使不同的细菌或不同的构造呈现出不同颜色，从而显示出细菌的特殊结构及染色特性。 (1)瑞特氏染色法细菌抹片自然干燥后，滴加瑞特氏染液约1ml以固定标本， l-3min~，再滴加与染液等量的磷酸缓冲液或中性蒸镏水，轻轻晃动玻片或用口
细菌染色技术总结
细菌染色技术 （2010—11-22 22：29:46） 目的要求 初步掌握细菌涂片制作,单染色法及革兰染色法等染色技术。 实验内容 1．细菌染色一般程序 涂片干燥固定初染 (媒染）脱色复染(1）涂片临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上，固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水，然后取菌少许在盐水中磨匀，呈轻度混浊.涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。 （2）干燥涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧干。 （3)固定细菌的固定常用火焰加热法，即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3~5次，温度以手能摸时热而不烫为度.目的在于杀死细菌，凝固细胞质,改变细菌对染料的通透性。 (4) 初染不同的染色方法，所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。 (5) 媒染通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。媒染剂还可用于固定之后，亦可含在固定液或染液中。 (6) 脱色此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度,作为鉴别染色之用. (7）复染细菌初染色被脱色后常以复染液复染，便于观察。复染液的颜色与初染液有明显不同。 2．常用染料原液配制 一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量：美兰2g～5g；结晶紫7g~14g；碱性复红3g~7g. 3．常用的染色方法 （1）单染色法即用一种染料染色的方法。常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。 1) 染液 ①吕氏美兰液美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成。 ②稀释石炭酸复红液碱性复红酒精饱和液10ml+5％石炭酸溶液90ml，然后用蒸馏水作10倍稀释即成。 2) 菌种大肠埃希菌普通斜面培养物. 3) 染色方法于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液，染色1min，以水冲洗至无颜色流下为止，自然干燥或以远火烘干后镜检。 4）结果以美兰染色者菌体呈现兰色；以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。 （2）革兰染色法 1) 原理细菌被结晶紫着色后,再经媒染剂处理，染成深紫色或紫黑色.如被酒精脱去颜色,经复红复染成红色，称为革兰阴性菌；如不被酒精脱色，则仍为紫黑色，称为革兰阳性菌。 革兰染色的原理尚未完全明了，主要有三种学说：①等电点学说革兰阳性菌的等电点低（pH2~3），革兰阴性菌等电点较高(pH4~5)，一般染色液pH值为
微生物的制片染色技术
微生物的制片染色技术 微生物的细胞含水量大（一般可达80～90％或更高），菌体薄而透明，折光性强，因此，除观察活细胞外，绝大多数情况下，都必须经过染色才能在显微镜下观察。至于细菌的特殊结构——鞭毛、芽孢、荚膜，以及真菌的有性或无性孢子等，均 需经特殊方法染色后，才能进行观察。 细菌的制片染色 细菌涂片的制作与简单染色 涂片制作：在干净载片上加清水1滴，用接种环（或牙签）取纯培养菌种（或牙垢等含菌标本）少许，与水混匀，涂布成薄层，在酒精灯火焰上方微热烘干，杀死菌体并使其固定在载片上。注意：载片一定要清洁无油，即水滴可均匀散开，不收缩；取样要适当，不可过多；涂片要薄而均匀，干后呈淡乳白色、半透明状；烘干过程载片背面保持温热。 简单染色：在涂片上滴1滴复红或其他染色液，染色1分钟，倾去染料，用水沿玻片一侧轻轻冲去多余染料，擦干载片背面及周围水渍，风干，镜检。此方法用于观察细菌外形及大小。 革兰氏染色细菌学中广泛使用的一种染色方法。用于鉴别细菌，可将细菌分为革兰氏染色阳性及革兰氏染色阴性两大类。 染色步骤：用上述方法制备细菌涂片，干燥后，加结晶紫1滴，初染1分钟，用水冲去多余的染料；稍干后，加媒染剂卢戈氏碘液2～3滴，固定1～2分钟，用水冲去碘液；稍干后，加95％酒精1～2滴，脱色20～30秒，迅速用水冲洗（此时革兰氏阳性菌紫色，阴性菌无色）；滴加0.5％番红1滴复染1分钟，使被脱色的阴性菌着色。镜检时，阳性菌紫色，阴性菌红色。 革兰氏染色的关键为酒精脱色，脱色过轻，阴性菌脱不掉紫色；若脱色过重，阳性菌的紫色也会脱掉。因此，染色时首先应制好薄而均匀的涂片，并掌握好脱色时间。此外还应注意菌龄，某些革兰氏染色阳性菌，其老龄菌常呈阴性反应，因此，染色用菌种应是24小时内的培养物。 特殊结构染色细菌的鞭毛、芽孢、荚膜等特殊结构，必须用特殊方法才能使其着色。 芽孢染色：芽孢壁较厚，染料不易透过，但着色后亦不易脱色。芽孢染色一般需用培养24～48小时的菌种，涂片风干后，加5％孔雀绿染液3～5滴，用酒精灯微火加热至出现蒸气（不断补充染液，使其保持不干，也不沸腾），染色5～10分钟，冷却后，用水冲洗，再用0.5％番红液复染1分钟，水洗，风干后镜检。菌体红色，芽孢绿色。
微生物染色液配制及染色法
微生物染色液配制及染色法 2.1 美蓝染色法2.1.1 吕氏碱性美蓝染色液美蓝0.3g95%乙醇30mL0.01%氢氧化钾溶液100mL 将美蓝溶解于乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。2.1.2 染色法将涂片在火焰上固定，待冷。滴加染液，染1～3min，水洗，待干，镜检。2.1.3 结果菌体呈蓝色。 2.2 革兰氏染色法2.2.1 结晶紫染色液结晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸铵水溶液80mL将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。2.2.2 革兰氏碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。2.2.3 沙黄复染液沙黄0.25g95%乙醇10mL蒸馏水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。2.2.4 染色法2.2.4.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。2.2.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。2.2.4.3 滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。2.2.4.4 水洗，滴加复染液，复染1min。水洗，待干，镜检。2.2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注：亦可用1：10稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。 2.3 耐酸性染色法(萎－倪二氏法)2. 3.1 石炭酸品红染色液碱性品红0.3g95%乙醇10mL5%酚水溶液90mL将品红溶解于乙醇中，然后与酚溶液混合。2.3.2 3%盐酸－乙醇浓盐酸3mL95%乙醇97mL2.3.3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。2.3.4 染色法2.3. 4.1 将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸品红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗。 2.3.4.2 滴加盐酸－乙醇脱色，直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定，一般为1～3min)，水洗。 2.3.4.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液，复染30s～1min，水洗，待干，镜检。2.3.5 结果：耐酸性细菌呈红色， 其他细菌、细胞等物质呈蓝色。 2.4 柯氏染色法2.4.1 染色液2.4.1.1 0.5%沙黄液。2.4.1.2 0.5%孔雀绿液。2.4.2 染色法2.4.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加0.5%沙黄液，并加热至出现气泡，约2～3min，水洗。2.4.2.2 滴加0.5%孔雀绿液，复染40～50s。水洗，待干，镜检。2.4.3 结果布氏杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈绿色。 2.5 奥尔特氏荚膜染色法2.5.1 染色液沙黄3g蒸馏水100mL用乳钵研磨溶解。2.5.2 染色法将涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加热至产生蒸气后，继续染3min。水洗，待干，镜检。2.5.3 结果炭疽 芽胞杆菌菌体呈赤褐色，荚膜呈黄色。 2.6 瑞氏染色法2.6.1 染色液瑞氏色素0.1g甲醇60mL用乳钵研磨溶解。2.6.2 染色法2.6.2.1 涂片待自然干燥后，滴加染色液，固定1min。2.6.2.2 加入等量蒸馏水(pH6.5)，染色3～5min。2.6.2.3 用 蒸馏水冲洗，待干，镜检。 2.7 鞭毛染色法2.7.1 染色液的配制2.7.1.1 甲液：称丹宁酸5g、氯化高铁(FeCl3)1.5g，溶于100mL 蒸馏水中，待溶解后加入1%的氢氧化钠溶液1mL和15%的甲醛溶液2mL。2.7.1.2 乙液：称2g硝酸银溶于100mL蒸馏水中。在90mL乙液中滴加浓氢氧化铵溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余10mL乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止(此为关键性操作，应特别小心)。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用，2～3d基本无效。2.7.2 染色法在风干的载玻片上滴加甲液，4～6min后，用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至冒汽，维持约半分钟(加热时注意勿使出现干燥面)。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，干后镜检，菌体及鞭毛为深褐色到黑色。2.8 碱性复红染色法将0.5g碱性复红染料溶解于20mL95%乙醇中，然后用蒸馏水稀释至100mL。如有不溶物时，可用滤纸过滤，或静置后取上清液备用。注：本染色液系用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色，藉以与蜡样芽胞杆菌相区别 实验用染色液及试剂的配制 1．黑色素液水溶性黑素10g，蒸馏水100mL, 甲醛（福尔马林）0.5mL。可用作荚膜的背景染色。
环境微生物学-实验二 微生物的染色
实验二微生物染色 一、实验目的 1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法； 2、学习用压滴法制作标本片； 3、学习微生物染色的原理； 4、学习微生物涂片、染色的基本技术。 二、实验仪器和材料 显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯； 美蓝染液，草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液； 酵母菌、大肠杆菌、枯草杆菌。 三、染色原理 微生物（尤其是细菌）的机体小且是无色透明的，在活体细菌内又含有大量的水分。因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有明显的明暗差，难以看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，在显微镜下观察。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其它化合物组成的，所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性，带正电；在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性，带负电。经测定，细菌的等电点pI在pH=2~5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH > 7）或偏酸性（pH=6~7）溶液中，细菌等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的居多。碱性染料并不是碱而是一种盐，电解时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合，而使细菌着色。 碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红（沙黄）等。 微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。 四、染色方法 1、简单染色法
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。常用的简单染色染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红（沙黄）等。 2、革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阴性细菌（G－）和革兰氏阳性细菌（G+）。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起的网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫和碘的复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈紫色；革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫和碘的复合物易被乙醇抽出而脱色，经复染后呈现红色。 3、芽孢染色法 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性差，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料如孔雀绿在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可以经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则芽孢和菌体易于区分。 加热时要补加染色剂，切勿让图片干涸。 4、荚膜染色法 荚膜是包裹在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易被染色，故常用背景染色法（衬托染色法），即将菌体与背景着色，而将不着色且透明的荚膜衬托出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。 5、鞭毛染色法 鞭毛是细菌的运动器官，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0.01~0.02μm，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法才能看到。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，在普通光学显微镜下能够看到。 在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以判别。
实验二 细菌抹片的制备及染色
实验二细菌抹片的制备及染色 一、提前十分钟进入实验室，抄写板述。上课，点名入座。 板述内容： 一）、目的要求 1、掌握细菌抹片的制备方法 2、掌握细菌的革兰氏染色法 二）、实验内容 1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。 2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。 3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌） 4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教） 三）作业 1、叙述细菌抹片的制备方法 2、叙述革兰氏染色的方法 3、绘出细菌形态图并注明染色方法 二、总结上次实验作业，有两个突出问题。 1、多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。 2、有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。 三、实验第一部分：抹片的制备 1、实验的目的和意义 细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。 2、细菌抹片的制备 进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下： （1）玻片准备 载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如
有油渍，可按下列方法处理： A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。 B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。 （2）抹片 所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。 A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。 C、组织脏器材料，先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压积或涂抹成一薄片。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一张玻片上有秩序地排好，作多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品，需要保留标本片，应贴标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。 （3）干燥：上述涂片，应让其自然干燥。 （4）固定：有两类固定方法。 A、火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为度）进行固定。 B、化学固定：血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色，不用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2-3分钟，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2~3分钟后，自然挥发干燥。抹片如作瑞特氏染色，则必先须作特别固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。 目的：将抹片固定的目的有如下几种： ①除去抹片的水分，涂抹材料能很好地贴附玻片，以免水洗时易被冲掉 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死的蛋白质比活的蛋白质着色力较强。
微生物显微镜的使用细菌形态的观察和细菌的革兰氏染色教案资料
微生物显微镜的使用细菌形态的观察和细菌的革兰氏染色
细菌的染色 一、实验目的 1、掌握细菌涂片标本的制备方法 2、掌握细菌革兰染色发和抗酸染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰 氏染色结果 3、巩固显微镜油镜的使用和保护法 4、学习无菌操作技术 二、实验仪器和试剂 仪器：显微镜、镜油、擦镜纸、载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯 试剂：结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌液体培养液、牙垢、石炭酸复红、3％盐酸 酒精、碱性美蓝染液、枯草芽孢杆菌、擦镜液 三、实验原理： 革兰染色法：
萋－纳氏抗酸染色法： 枯草芽孢杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，它包围在肽聚糖的外面，所以枯草芽孢杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来 促使其着色。 萋－纳氏抗酸染色法是在加热条件下使枯草芽孢杆菌与石炭酸复 红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美蓝复 染后，枯草芽孢杆菌芽孢仍然为红色，而细菌为蓝色。 四、实验步骤： 革兰染色： 1、涂片 左手持菌液试管,右手持接种环在火焰中灼烧，冷却后从试管中取菌液一滴,在洁净载玻片一端做一涂膜； 取一牙签在牙齿上轻轻划动取少量牙垢，在该洁净载玻片的另一端做一涂膜。 2、干燥
在空气中自然干燥。 3、固定 用镊子夹住涂片一端，将两涂膜出分别在火焰上连续通过三次; 以载玻片在手背上试感觉不烫为宜。 4、染色 ?结紫初染：滴加数滴结晶紫染液于细菌涂片上，染色1分钟，水洗； ?卢戈氏碘液媒染：用卢戈氏碘液覆盖涂片1分钟，水洗； ?95%的乙醇脱色：滴加95%的乙醇，轻轻摇动玻片进行脱色，直至流出的乙醇无紫色时，水洗； ?蕃红复染：滴加蕃红染液复染2分钟以上，水洗，吸干镜检。 5、镜检 载玻片上滴加一滴香柏油，放油镜下镜检;注意标本中细菌的形态、大小，排列和颜色。 萋－纳氏抗酸染色法： 1、涂片、固定 用接种环挑取一环枯草芽孢杆菌菌液，涂于玻片上做成薄膜，自然干燥后经火焰固定。 2、染色 ?滴加石炭酸复红液于涂片上，用玻片夹住涂片微火加热，保持染液冒蒸汽约5分钟，切勿蒸发至干或使染液沸腾； ?冷后，水冲洗； ?以3％盐酸酒精脱色，至片上红色全部脱去为止； ?水冲洗后，以碱性美蓝液复染1分钟，水洗，待干，镜检。 五、注意事项：
细菌与真菌学实验
细菌与真菌学实验 实验一细菌形态结构观察 【目的】 1、了解细菌的基本形态和特殊结构观察法 2、明确细菌特殊结构在医疗实践中的意义 3、细菌不染色标本的观察方法 4、观察活细菌的形态及运动情况 【材料】革兰染色标本片： 1、球菌：葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。 2、杆菌：伤寒沙门菌、大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌。 3、螺形菌：霍乱弧菌或水弧菌。 细菌特殊结构标本片： 1、鞭毛:变形杆菌、霍乱弧菌 2、荚膜:肺炎链球菌、产气荚膜杆菌 3、芽孢：破伤风杆菌、炭疽杆菌 细菌动力观察材料： 1、菌种：普通变形杆菌、表皮葡萄球菌。 2、变形杆菌和表皮葡萄球菌8～12min肉汤培养物。 3、其他：凹玻片、盖玻片、凡士林、牙签、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸 一细菌形态结果观察 1、使用油镜观察上述革兰染色标本片：认识细菌的三种基本形态。
注意观察各菌的形态、大小、排列方式及染色性等特点。 2、使用油镜观察细菌的特殊结构标本片： （1）荚膜：肺炎链球菌经革兰染色后，呈矛头状成双排列，菌体四周有不着色的透明圈（既荚膜）；肺炎链球菌与产气荚膜杆菌的荚膜（荚膜染色法），注意观察菌体及荚膜的颜色及两者的形态特点。 （2）鞭毛：变形杆菌与霍乱弧菌的鞭毛（鞭毛染色法），注意观察菌体和鞭毛的颜色、鞭毛的长短、数目及在菌体上的位置。 （3）芽胞：破伤风梭菌及炭疽杆菌芽胞（芽胞染色法），注意观察菌体、芽孢的形态、颜色及芽孢在菌体中的位置。 二、细菌不染色标本观察法（动力观察法） 1、悬滴法 图2－1－1 （1）取一张洁净盖玻片，用牙签涂少许凡士林于盖玻片的四个角处。 （2）用接种环取3～4环普通变形杆菌或表皮葡萄球菌液体培养物于盖玻片中央。 （3）把凹玻片凹面朝下盖在盖玻片上，使凹窝中央正对菌液（见图2－1－1）。 （4）迅速翻转凹玻片，使粘附在凹玻片上的盖玻片朝上。 （5）先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。图2－1－1悬滴法普通变形杆菌有鞭毛，运动活泼，可向不同方向迅速运动。表皮葡萄球菌无鞭毛，不能作真正运动，只能在一定范围内作移位不大的颤动，这是受水分子撞击而呈分子运动（即布朗运动）。 2、压滴法 （1）用接种环取3～4环菌液于洁净载玻片中央。 （2）用小镊子挟一块盖玻片轻轻覆盖在载玻片的菌液上，放置盖玻片时，应将盖玻片的一端接触载玻片，然后缓慢放下，以免菌液中产生气泡。 （3）先用低倍镜对光找到细菌的位置，再换高倍镜观察细菌的运动。 【思考题】
细菌标本片的制备及染色
细菌标本片的制备及染色 同学们，大家好！今天我们要学习的内容是--《细菌标本片的制备及染色》。我们这节课要用到的仪器和材料有酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、革兰氏染色液、洗瓶、显微镜、香柏油、擦镜纸、细菌培养物、细菌病料、无菌镊子和剪刀、铅笔等。（实物照片或网上图片） 本次实验的基本流程是：制片—干燥—固定—染色 好，我们开始今天的实验: （一）玻片准备：选择干净、清晰、透明、无油渍的载玻片，滴上水后能均匀展开。（学生演示） （二）细菌标本片的制作过程，根据所用材料不同，制片的方法有差异，这节课我们以制作葡萄球菌标本片为例，给大家做个示范。1. 先用灭菌接种环取1~2环无菌生理盐水，置于玻片中央，再将接种环灭菌，冷却后挑取少量葡萄球菌，与水混合，涂布成适当大小的薄层。接种环用后需再次灭菌。（学生演示）在涂布时切忌涂抹过厚，否则不利于染色和观察。2.干燥：将涂面向上置火焰高处微烤加热干燥（学生演示）3.固定：将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（一般4~6次），以手背触及玻片微烫手为宜。（学生演示）固定的目的是使菌体蛋白质凝固，形态固定，易于着色，并且经固定的菌体牢固黏附在玻片上，水洗时不易冲掉。 （三）革兰氏染色法：1.初染：在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1~2min，水洗。2.媒染：加革兰氏碘液媒染，作用1~3min，水洗。3.脱色：加95%酒精脱色0.5~1min，水洗。4.复染：加稀释石碳酸复红复染30s左右，水洗，吸干后镜检。 （动画展示或学生演示）结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 因葡萄球菌为革兰氏阳性菌，所以称蓝紫色。 （四）镜检观察 应用拓展：革兰氏染色液的配制 课后练习：同学们根据今天所学的细菌标本片的制备及染色方法，练习大肠杆菌的标本制片及染色。
细菌的常用染色技术
细菌的常用染色技术 简单染色法：利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。例如番红。 1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。 2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。 3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。 4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。 6．干燥 7．镜检 复染色：利用用两种以上染料对细菌进行染色。例如革兰氏染色法。 革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，需要碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。 碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine ）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液为番红。 1.载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。 2.草酸铵结晶紫染1分钟。 3.自来水冲洗，去掉浮色。 4.用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。 5.用中性脱色剂如乙醇（95%）或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。 6.用番红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。
细菌染色方法及原理
细菌染色方法及原理 革兰氏染色法(Gram'sstain)是最常用的细菌染色法，本实验要求同学能正确掌握此染色方法的操作技术，理解其在鉴别细菌上的重要意义。 【原理】 细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。 【方法】 按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。准备载物玻片：用镊子从载物片缸中取出经3％盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。 1．涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下： 用肉汤培养物涂片： ①右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。 ②将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧红，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。 ③用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。 ④用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料，此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。 ⑤将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。
⑥将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。 用斜面培养物涂片： 用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。 2．干燥：放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。 3．固定：用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。 4．染色：①将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1min。②水洗后加芦戈氏碘液处理(媒染)1min。③水洗后用95％酒精脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体无色为止(约需0.5min)。④水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5min。 ⑤水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。染色过程中，水洗要用自来水的细流徐徐冲洗，冲洗涂膜的背面，勿使强水流直接冲到涂膜上。 【结果观察】 使用油镜观察，注意标本中两种细菌的形态、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪种细菌是革兰氏阳性菌(染成紫色)，哪种细菌是革兰氏阴性菌(染成红色)。将在标本中观察到的细菌形态和染色性，用有色铅笔画出模式图，并附以文字说明。 注意事项：①酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄
细菌标本片的制备及染色方法
细菌标本片的制备及染色方法 1.材料准备 -细菌培养物：选择代表性的细菌培养物，如液体培养物、固体培养物、接种物等。 -玻片：选择无痕的玻片，经高温消毒或与有机溶剂清洗后晾干备用。 -液体固定剂：如95%乙醇、甲醛等。 -染色剂：如碘酒、靛蓝溶液、絮状靛蓝等。 -水：经蒸馏水或高纯水处理。 2.细菌标本片制备 (1)涂薄法：采取适量的培养物，滴于玻片上，使用无菌铁环将培养 物涂匀于玻片表面，待溶液蒸发，自然晾干。 (2)刮刀法：将细菌培养物取下适量，用棉签或刮刀将菌落刮到玻片上，制成薄层。 (3)叠片法：将细菌培养物滴于玻片上，然后使用另一片玻片压在上面，使培养物均匀分布在两片玻片之间。然后慢慢滑动两片玻片，使液体 薄层均匀分布。 3.细菌标本片固定 (1)液体固定法：加入同等体积的液体固定剂于细菌标本片上，浸泡 5-10分钟。固定剂能使细菌细胞变硬，保持细胞原态形态。
(2)干燥法：将细菌标本片放置在室温下，自然晾干，使细菌固定在 玻片上。此方法适用于脆性细菌。 4.细菌标本片染色 (1)碘酒染色：取适量碘酒滴于细菌标本片上，置于室温下静置10- 20秒。然后用水冲洗，使过多的碘酒洗掉。 (2)靛蓝溶液染色：取适量靛蓝溶液滴于细菌标本片上，置于室温下 静置10-20秒。然后用水冲洗，使过多的靛蓝洗掉。 5.透明化处理 (1)絮状靛蓝法：将细菌标本片在300倍以下的低倍率镜下观察，确 定细菌形态无误后，将玻片倾斜，滴入絮状靛蓝液。待颜色由淡到重，停 在合适的颜色时，用水冲洗玻片上多余的靛蓝。 (2)水透明化法：可使用蒸馏水或高纯水将细菌标本片浸泡5-10分钟，然后取出晾干。透明化后，细菌会变得透明，观察细胞内部结构会更清晰。 6.滴水封片 在制备完成的细菌标本片上滴一滴蒸馏水或高纯水，将盖片平放在上面。用纸巾或吸水纸轻轻按压玻片两侧，使水均匀分布。然后将封片剂滴 于玻片四周，使玻片与盖片紧密结合，定期晾干即可。
2021整理 《微生物检验技术》实训指导
医学检验技术专业教学资源库 实训指导 微生物检验技术
实训一：临床标本采集 【实训目的】 1学会无菌操作采集静脉血液标本。 2掌握血液标本采集的皮肤消毒程序。 【材料准备】 1试剂 75%酒精、2%碘酊。 2培养基增菌肉汤培养基、需氧及厌氧血培养瓶、血琼脂平板、麦康凯平板、不含万古霉素的巧克力平板。 3其它材料 5ml一次性无菌注射器、消毒棉签、止血带等。 【实训内容】 1确定采血部位大多由肘静脉采集，对亚急性心内膜炎的患者一般采集股动脉血，多部位采集血液标本可以增加阳性率。 2消毒皮肤的准备①%碘伏作用30秒，以穿刺点为中心向外画圈消毒，消毒区域直径应达3cm以上。②75%酒精脱碘。有碘过敏体质者，可用75%酒精消毒60秒，待酒精挥发枯燥后采血。 3培养瓶的消毒 75%酒精擦拭血培养瓶橡皮塞，作用60秒；然后用无菌纱布或无菌棉签去除橡皮塞外表剩余酒精。 4采血戴乳胶手套固定静脉防止静脉滑动，注意手套不可接触穿刺点。用无菌注射器穿刺取血。成人采血量每次10～2021，儿童3～5ml。血液与培养基的比例应为1∶5～1∶10。 5标本运送标本采集后应立即送检，对于不能立即送检的标本需室温保存或置35℃孵箱中，切勿冷藏。 6接种血液和骨髓标本采集后直接注入需氧瓶和厌氧瓶中，其他无菌体液标本在采集量少的情况下，也可划线接种血平板、麦康凯平板和不含万古霉素的巧克力平板。 7其他无菌体液胸腹水、脑脊液、心包积液、胆汁等穿刺取得后都可按照无菌操作注入血培养瓶内送检。 【考前须知】 1血液标本应在病人发热1～2 天内或发热顶峰采集培养为宜，此时阳性率较高。 2培养基与血液的比例为5∶1～10∶1 。 3用无菌注射器穿刺取血后，勿换针头〔如果进行第二次穿刺，应换针头〕，直接注入已消毒好的血培养瓶。
细菌标本片的制备及染色
细菌标本片的制备及染色 目的要求能利用不同的材料进行细菌标本片的制备，会进行常规染色，并认识细菌的不同染色特性。 仪器及材料酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)、细菌病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等。 方法与步骤 4大步：涂片→干燥→固定→染色 （一）病料触片、美兰染色 1．触片(抹片)用剪刀和镊子 将剪刀和镊子在火焰上灼烧灭菌，稍冷却后，用镊子固定病料一角，剪刀剪下，将切面在玻片上涂抹或压印。 剪刀和镊子用完后一定要灭菌；整个操作过程始终在酒精灯附近进行。 2．干燥触片涂面向上，置火焰上方约20cm处加热干燥。 3．固定固定的方法因染色方法不同而异。美兰染色和革兰氏染色用火焰固定。 (1)火焰固定是最常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上方约10cm处来回通过数次，以手背触及玻片微烫手为宜。 (2)化学固定血片、组织触片用瑞氏或姬姆萨氏染色时，用甲醇固定。 固定的目的是使菌体蛋白质凝固，形态固定，易于着色，并且经固定的菌体牢固黏附在玻片上，水洗时不易冲掉。兼有灭菌作用。 4．染色在经火焰固定的抹片上，滴加美蓝染色 液覆盖整个涂面，染色2～3min，水洗，晾干或吸水 纸轻压吸干，镜检。 结果：病料和细菌都呈蓝色。 （二）细菌培养物涂片、革兰氏染色 1．涂片取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取1～2环的无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，无菌操作从固体细菌培养物上挑取菌落或菌苔少许，与生理盐水混匀，作成直径1cm的涂面。 接种环使用前后都需灼烧灭菌。整个操作过程始终在酒精灯附近进行。
细菌标本片的制备及染色
一、细菌标本片的制备 1.抹片 （1）固体培养物：取洁净的玻片一张，把接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌后，取1-2环无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm的涂面。接种环用后需要灭菌。 （2）液体培养物：可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液1-2环，在玻片上作直径1cm涂面。 （3）液体病料（血液，渗出液，腹水）：取一张边缘整齐的载玻片，用一端蘸取血液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上，一45°角均匀推成一薄层的涂面。 （4）组织病料：以无菌剪刀、镊子剪去被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做3-5个压印或涂抹成适当大小的一薄层。无论何种方法，切忌涂抹太厚，否则不利于染色和观察 2.干燥 涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂片涂面向上，置于火焰高处微加热干燥。 3.固定 （1）火焰固定。是常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（4-6次），以手背触及玻片微烫手为宜。（2）化学固定。有的血片，组织触片用姬姆萨染色时，要用甲醇固定3-5min 二、常用的细菌染色法 1.美蓝染色法：在经火焰固定的涂片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2-3min，水洗，晾干或吸水纸轻压吸干镜检，结果，菌体呈蓝色
2.革兰氏染色法。 （1）在固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，染1- 3min，水洗 （2）加革兰氏碘液媒染，作用1-2min，水洗 （3）加95%酒精脱色约30s至1min，水洗 （4）加稀释石碳酸复红或沙黄水溶液复染30s左右，水洗，吸干后镜检 3.瑞士染色法 细菌抹片自然干燥后，滴加瑞士染色液于涂片上以固定标本，1-3min后，再滴加与染色液等量的磷酸盐缓冲液或中性蒸馏水与玻片上，轻轻摇晃使染色液混合均匀，5min左右水洗，干后镜检，菌体呈蓝色，组织细胞的胞浆呈红色，细胞核呈蓝色4.姬姆萨染色法。血片或组织触片自然干燥后，用甲醇固定3-5min，干燥后在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的缸里，染色30min，或者染色数小时或24h，取出水洗，吸干或烘干，镜检。细菌呈蓝青色，组织细胞浆呈红色，细胞核呈蓝色 （此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内 容，供参考，感谢您的配合和支持）