技能训练2 细菌标本片的制备和染色法
细菌抹片的制备及染色
实验二 细菌抹片的制备及染色
一、目的要求： 1、掌握细菌抹片的制备方法 2、掌握革兰氏染色法
二、实验材料：普通光学显微镜 、香柏油、二甲苯、擦镜纸、载
玻片、接种棒、酒精灯、火柴、蒸馏水、菌种（大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、嗜水汽单胞菌）
实验内容
2、制片及染色步骤：取干净玻片→ 抹片→干燥→固定→染色→干燥镜 检
3、革兰氏染色法 （1） 草酸铵结晶紫染液1-2分钟，水洗 （2） 革兰氏碘液媒染1-3分钟，水洗 （3） 95%酒精脱色30秒-1分钟，水洗 （4） 沙黄水溶液复染10-30秒，水洗 （5） 吸干，镜检 4、的意义何在？固定时应注意什么问题？ 3、革兰氏染色的原理及关键步骤是什么？ 2、绘出你所观察到的细菌形态。
细菌抹片的制备：
（1）固体培养物 用经酒精灯火焰烧过的接种环，蘸取生理盐水（或者 蒸馏水）1-2环于清洁无油脂的载玻片中央，再勾取细菌的固体培养物少 许混于生理盐水中，涂抹成直径为1-1.5cm大小的均匀的抹片 （2）液体培养物 可直接用灭菌接种环勾取细菌培养物，涂抹于玻片上即 可。但要注意将管底沉淀物摇匀，以免影响涂片效果。 （3）组织涂片 用灭菌的剪刀、镊子取被检组织一小块，以其断面在玻片 上压印或涂抹成适当大小的薄片。如为脓汁、血液、乳汁等可直接涂抹 于玻片上。 （4）无论何种方法切忌涂片太厚，否则不利于染色和观察。
固定 （1）目的: a 、除去抹片上的水分，使涂抹材料能很好地附着在 载玻片上，以防染色过程中被水冲掉 b、使抹片易于着色，变性的蛋白质着色力强 c、能杀死抹片中的部分微生物 （2）方法： a、火焰固定 将已干燥的抹片菌膜向上，以钟摆速度 在酒精灯火焰上通过数次（以不烫手背为宜） b、化学固定 加数滴甲醇于玻片上，固定 2-3 分钟， 自然晾干
细菌标本片的制备及染色方法PPT精选文档
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实训目标
能利用不同的材料进行细菌标本片的制备 掌握常规的染色方法，并认识细菌的不同染色特性
2
仪器材料
酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美 蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、 染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜 纸、细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌等）、细菌 病料、无菌镊子和剪刀、特种铅笔等
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（2）组织抹片的制作 待检尸体经无菌手术切开胸腹腔后，用经火焰灭菌的 镊子夹起组织，用灭菌剪刀剪下小块组织，将组织切 面在载玻片上等距离轻压几下，使其留有组织切面的 压迹。
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（二）常用的细菌染色方法
1．美蓝染色法 2．革兰氏染色法 3．瑞氏染色法
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1．美蓝染色法
在已固定好的抹片 上，滴加适量美蓝染色 液覆盖涂面，染色2～ 3 min， 水 洗 ， 吸 水 纸 轻压吸干或晾干和镜检， 结果菌体呈蓝色。
（2）卢戈氏碘液 碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml。将碘化钾放入研钵 中，加入少量蒸馏水，使其溶解，再放入已磨散的碘片，徐徐加 水，同时充分磨匀，待碘片完全溶解后，把余下的蒸馏水倒入， 再装入瓶中。
（3）石炭酸复红稀释液 取碱性复红酒精饱和溶液（碱性复红10g溶于 95%酒精100ml中）1ml和5%石炭酸水溶液9ml混合，即为石炭酸 复红原液。再取原液10ml和90ml蒸馏水混合，即成石炭复红稀释 液。
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3．瑞氏染色法
细菌抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于涂片 上以固定标本，1～3min后，再滴加与染色液 等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻 轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗， 干后镜检，结果菌体呈蓝色，组织细胞等物呈 其他颜色。
细菌标本片的制备及染色法.
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块 病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触3~5个压迹。
细菌病料触片及美兰染色
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 室温下自然干燥或将标本片 的涂面向上，置酒及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
• 滴加瑞氏染色液于涂片上 以固定标本，1～3min后， 再滴加与染色液等量的磷 酸缓冲液或中性蒸馏水于 玻片上，轻轻摇晃使与染 色液混和均匀，5min左右 水洗，干后镜检
• 注：瑞氏染液含甲醇，无需另 行固定
瑞氏染色镜检结果
细菌（蓝色） 细胞
(2)液体培养物 可直接用灭菌接种环钩
取细菌培养液1～2环，在玻片上作 直径1cm的涂面
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
• 室温下自然干燥或 将标本片的涂面向 上，置酒精灯火焰 高处微烤加热干燥。
细菌培养物涂片及革兰氏染色
1 涂片 2 干燥 3 固定 4 革兰氏染色
水洗 水洗 水洗
革兰氏染色镜检结果
葡萄球菌（G+菌，蓝紫色）
大肠杆菌（G-菌，红色）
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
45°
• 取一张边缘整齐的载玻片，用其一端醮取血 液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上， 以45°角均匀推成一薄层的涂面。
血涂片及瑞士染色
1 推片 2 干燥 3 瑞氏染色
– 组织病料（肝脏）：触片及美兰染色 – 固体细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌）：涂片及革
兰氏染色 – 液体病料：血涂片及瑞士染色
3. 镜检结果 4. 注意事项
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法
技能训练2 细菌标本片的制备和染色法一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法二、设备材料病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。
三、操作方法细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。
(一)细菌涂片的制备1．液体培养物及液体病料(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。
(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。
火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。
此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。
(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。
2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。
(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。
(三)细菌的染色法1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。
(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。
(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
细菌标本片的制备及染色方法
细菌标本片的制备及染色方法1.材料准备-细菌培养物：选择代表性的细菌培养物，如液体培养物、固体培养物、接种物等。
-玻片：选择无痕的玻片，经高温消毒或与有机溶剂清洗后晾干备用。
-液体固定剂：如95%乙醇、甲醛等。
-染色剂：如碘酒、靛蓝溶液、絮状靛蓝等。
-水：经蒸馏水或高纯水处理。
2.细菌标本片制备(1)涂薄法：采取适量的培养物，滴于玻片上，使用无菌铁环将培养物涂匀于玻片表面，待溶液蒸发，自然晾干。
(2)刮刀法：将细菌培养物取下适量，用棉签或刮刀将菌落刮到玻片上，制成薄层。
(3)叠片法：将细菌培养物滴于玻片上，然后使用另一片玻片压在上面，使培养物均匀分布在两片玻片之间。
然后慢慢滑动两片玻片，使液体薄层均匀分布。
3.细菌标本片固定(1)液体固定法：加入同等体积的液体固定剂于细菌标本片上，浸泡5-10分钟。
固定剂能使细菌细胞变硬，保持细胞原态形态。
(2)干燥法：将细菌标本片放置在室温下，自然晾干，使细菌固定在玻片上。
此方法适用于脆性细菌。
4.细菌标本片染色(1)碘酒染色：取适量碘酒滴于细菌标本片上，置于室温下静置10-20秒。
然后用水冲洗，使过多的碘酒洗掉。
(2)靛蓝溶液染色：取适量靛蓝溶液滴于细菌标本片上，置于室温下静置10-20秒。
然后用水冲洗，使过多的靛蓝洗掉。
5.透明化处理(1)絮状靛蓝法：将细菌标本片在300倍以下的低倍率镜下观察，确定细菌形态无误后，将玻片倾斜，滴入絮状靛蓝液。
待颜色由淡到重，停在合适的颜色时，用水冲洗玻片上多余的靛蓝。
(2)水透明化法：可使用蒸馏水或高纯水将细菌标本片浸泡5-10分钟，然后取出晾干。
透明化后，细菌会变得透明，观察细胞内部结构会更清晰。
6.滴水封片在制备完成的细菌标本片上滴一滴蒸馏水或高纯水，将盖片平放在上面。
用纸巾或吸水纸轻轻按压玻片两侧，使水均匀分布。
然后将封片剂滴于玻片四周，使玻片与盖片紧密结合，定期晾干即可。
实验二 细菌抹片的制备及染色
实验二细菌抹片的制备及染色一、提前十分钟进入实验室，抄写板述。
上课，点名入座。
板述内容：一）、目的要求1、掌握细菌抹片的制备方法2、掌握细菌的革兰氏染色法二）、实验内容1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。
2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。
3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌）4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教）三）作业1、叙述细菌抹片的制备方法2、叙述革兰氏染色的方法3、绘出细菌形态图并注明染色方法二、总结上次实验作业，有两个突出问题。
1、多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。
2、有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。
三、实验第一部分：抹片的制备1、实验的目的和意义细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。
2、细菌抹片的制备进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：（1）玻片准备载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。
如有油渍，可按下列方法处理：A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。
B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。
（2）抹片所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。
A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。
实验二 细菌抹片的制备及染色
实验二细菌抹片的制备及染色一、提前十分钟进入实验室，抄写板述。
上课，点名入座。
板述内容：一）、目的要求1、掌握细菌抹片的制备方法2、掌握细菌的革兰氏染色法二）、实验内容1、每人做一张葡萄球菌的固体抹片，用美兰染色。
2、每人做一张大肠杆菌与葡萄球菌的混合抹片，并用革兰氏法染色。
3、油镜观察自制的玻片及真菌标本片，（烟曲霉、黄曲霉、酵母菌）4、组织抹片，并用瑞氏染色液染色（示教）三）作业1、叙述细菌抹片的制备方法2、叙述革兰氏染色的方法3、绘出细菌形态图并注明染色方法二、总结上次实验作业，有两个突出问题。
1、多数同学画的是书上的细菌图，细胞臂、荚膜清晰可见，而镜检时只能看到细菌的大致形态，如大肠杆菌是一个两端钝圆的杆状轮廓，另外，镜检时菌毛和鞭毛是不能观察到的，除非用特殊的染色方法。
2、有的同学没有用圆规画图，图片绘制得过大或过小。
三、实验第一部分：抹片的制备1、实验的目的和意义细菌细胞微小，无色而半透明，原样直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色之后，则能较清楚地显示其形态和特殊构造，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。
2、细菌抹片的制备进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：（1）玻片准备载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。
如有油渍，可按下列方法处理：A、滴上95%酒精2-3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻拖过几次。
B、若上法仍未能去除油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。
（2）抹片所用材料情况不同，抹片方法亦有差异。
A、液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
B、非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。
实验二：细菌涂片的制备和染色镜检
提高实验效率
在这次实验中，我们发现了一些 可以改进的地方，希望在未来的 实验中能够通过改进提高实验效
率。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
有助于判断细菌的分类。
细胞质结构
观察细菌细胞质的颜色、颗粒 大小、分布等特征，有助于判 断细菌的种类和生长状态。
鞭毛等特殊结构
观察细菌是否有鞭毛、菌毛等 特殊结构，有助于判断细菌的
致病ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ和分类。
细菌分类的初步判断
革兰氏染色法
通过革兰氏染色法可以将细菌分 为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌 两大类，有助于初步判断细菌的
实验细节注意不够
在染色过程中，我发现自己对一些细节问题没有给予足够的重视， 导致染色效果不佳，未来应更加注重细节。
对未来实验的展望
探索更多染色方法
我希望在未来的实验中，能够探 索更多不同的染色方法，以了解
各种方法的优缺点。
深入研究细菌种类
通过这次实验，我对细菌有了更 直观的认识，希望在未来的实验 中能够深入研究更多种类的细菌。
01
02
03
涂片制备
在洁净的载玻片上滴一滴 无菌水，用接种环取少量 细菌样品与水混合，然后 涂抹均匀，制成涂片。
干燥
将涂片放在实验台上自然 晾干，大约需要10-15分 钟。
固定
将干燥后的涂片放入火焰 中加热，使细菌固定在载 玻片上，防止在染色过程 中脱落。
染色镜检
染色
脱色
选择适当的染色液（如结晶紫、番红等） ，将涂片浸入染色液中，染色时间根据染 色液和细菌种类而定。
常用染色方法
革兰氏染色、抗酸染色、荧光染色等。
染色镜检的观察方法
显微镜观察
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技能训练2 细菌标本片的制备和染色法
一、目的要求：正确掌握细菌培养物涂片的制作和常用染色法
二、设备材料
病料、细菌培养物、接种环、玻片、酒精灯、染色缸、染色架、染色液等。
三、操作方法
细菌标本片制作的基本步骤为：涂片或触片→干燥→固定→染色→镜检。
(一)细菌涂片的制备
1．液体培养物及液体病料
(1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。
(2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40cm处适当加热干燥。
(3)固定分为火焰固定和化学固定两种。
火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度；化学固定时，可将干燥好的玻片浸入甲醇中2～3min后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后自然挥发干燥。
此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。
(4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。
2．固体培养物用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央→用接种环挑取一个菌落于生理盐水中混合→均匀地涂布成适当大小的薄层→干燥→固定→染色。
(二)细菌触片的制备将固体病料(病变组织)作无菌切开→用切面在玻片的中央接触一下或稍用力印压成一薄层→干燥→固定→染色。
(三)细菌的染色法
1．单染色法又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。
(1)美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液1—2min后，水洗，干燥(吸水纸吸干或自然干燥)，镜检。
(2)瑞特氏染色法在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥，可适当多加一些，或视情况补充滴加，1—3min后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓
冲液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3—5min后，直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3—5min后直接用水冲洗，吸干或烘干后镜检。
(3)姬姆萨氏染色法先将姬姆萨染色液原液稀释成常用的姬姆萨染色液(取5—10滴原液于5ml新煮过的中性蒸馏水中，混合均匀)，在经甲醇固定好的涂片上滴加足量的染色液，或将涂片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30min或浸染数小时至24h后取出，水洗，吸干或烘干后镜检。
2．复染色法应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。
(1)革兰氏染色法在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染色1～2min后→水洗→再加革兰氏碘液，作用1～2min后→水洗→加95％酒精脱色0.5～lmin后→水洗→加稀释石炭酸复红(或沙黄、番红)染色液复染0．5min后→水洗→干燥→镜检。
(2)抗酸染色法常用的有萋一尼氏染色法和沙黄一美蓝染色法(因此法主要用于布氏杆菌的染色，故又称为布氏杆菌染色法)。
①萋一尼氏染色法在已于燥、固定好的涂片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，酒精灯
火焰上方微微加热至冒出蒸气并维持3～5min，水洗；再用3％盐酸酒精脱色至无染液流出，充分水洗；然后用碱性美蓝染液复染约lmin，水洗，吸干，镜检。
②沙黄一美蓝染色法在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的沙黄染色液，酒精灯火焰上方微微加热使冒蒸气3—5次，维持1～2rain，水洗；再用3％盐酸酒精脱色至无染液脱出，充分水洗；然后用碱性
图实6 细菌涂片的制备和单染色法
1.接种环灭菌2．滴生理盐水3．钩菌4．涂布5．干燥6．固定7．滴加染色液8．染色9．水洗10．干燥
美蓝染液复染约lmin，水洗，吸干，镜检。
注意事项：
1．作细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。
2．固定必须确实，火焰固定时不宜温度过高，以免造成菌体结构破坏。
3．每种染液染色的过程中应保持染色液不干，尤其加热染色的染液，在染色过程中应随时添加，以免蒸发干，影响染色效果。
4．每种染液染色后，应用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。
四、技能考核评分标准
优能熟练进行细菌培养物涂片制备和染色
良能比较熟练地进行细菌培养物涂片的制备和染色
及格操作技术一般
不及格操作技术较差。