临床标本细菌培养鉴定常见的15个疑问
细菌培养标本的_采集、运送与处理
痰标本的处理
培养基：血琼脂、麦康凯琼脂、嗜血杆菌巧克 力琼脂和沙保弱琼脂。
划线方法：分四区划线，每次划下一区前都要 烧灼接种环，待冷却后再划。下一区与上一区 要相交4-6次。
35℃5%-10%二氧化碳中培养24-48h。
咽拭子及口腔拭子
采集前患者应用冷开水反复漱口， 拭子的选择：要求无菌、不含抑制剂； 预先沾湿拭子（非常重要）； 由检查者将舌向外拉，使腭垂尽可能向外牵引，将棉
霍乱弧菌培养：
记录收到标本时间和病人电话 碱性蛋白胨水35℃培养 6-8小时后转种4号平板（四区划线） 继续35 ℃培养
生殖道、尿道标本采集
男性患者:
尿道标本:
2h不排尿 清洗龟头后,用碘伏等消毒后,挤出分泌物或以专用细拭子
插入尿道口1-2cm旋转采取分泌物立即送检。
前列腺液标本: 应由医师按摩前列腺,以无菌操做自尿道
隔不少于60分钟。
采血方法
采血部位的局部皮肤应严格消毒。将采集的血 液注入血培养瓶前，应更换针头或过火消毒针 头。
血培养瓶口也要消毒，并待酒精挥发后（建议 用酒精灯烧灼瓶口）再注入血样, 。
采血量
每次采血量成人5～10ml，婴幼儿1～2ml， 培养基与血液之比以10：1为宜，以稀释血液 中的抗生素。
疑似细菌性心内膜炎时，以肘动脉或股动脉采 血为宜。
多次采血时, 应在不同部位进行。 不要从血管插管内采血。 切忌在静滴抗菌药物的静脉处采取
血标本。
采血次数与间隔
急性感染患者： 从两臂分别采2份血样。 感染性心内膜炎患者: 24h内采血3次, 每次间
隔不少于30分钟。 发热原因不明患者: 24-48h后可再采血2次,间
细菌培养标本的 采集、运送与处理（需氧）
临床细菌培养鉴定流程及报告.介绍
3．分离培养 ⑴一般培养: 用定量接种环或无菌微量 加样器取尿液0.001ml或0.01ml(已使用 抗生素患者),接种于血平板和麦康凯/中 国兰平板,不能定量时需用倾碟法记数， 35～37℃培养18～24小时。 (2)特殊培养: 对临床要求真菌、淋病奈 瑟菌及结核菌等培养者，根据细菌所需 条件接种相应特殊培养基，放臵相应条 件下进行培养。
(三 ) 尿 尿路感染是指尿道内有大量微生物繁殖 而引起的尿路炎症。从肾脏排泌出来的 尿液正常情况下是无菌的，如果在尿液 中分离出细菌（排除污染因素）即为菌 尿，同时伴有感染症状者称为尿路感染。 根据感染部位可分为上尿路感染（肾盂 肾炎）及下尿路感染（膀胱炎），男性 还可出现前列腺炎。
1.尿中常见分离菌
⑵采血时间及采血量 采血培养应该尽量在使
用抗菌药之前进行，在24小时内采集2～3份血
培养（一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视
为单份血培养）。对间歇性寒战或发热应在寒 战或体温高峰到来之前0.5～1小时，采集血液， 或于寒战或发热后1小时进行。成人采血量8～ 10ml，儿童1～5ml。血液和肉汤之比1：5 ～1：
(2)标本采集 a.清洁中段尿 最好是晨尿，是临床上 最常留取尿标本的方法 b.耻骨上膀胱穿刺法 是评估膀胱内细 菌感染的“金标准” c.直接导尿法 d.小儿收集包 e.留臵导尿
(3)标本运送 标本采集后应及时送检， 2小时内进行接种，否则应臵4～8℃冰箱 保存，冷藏保存标本时间不得超过8小时。
(2)报告方式 初步报告：在分离出细菌后，进行革兰 氏染色，作出初步报告。 最终报告：有意义的阳性结果报告，应 报告菌落计数、细菌种名及药敏结果。 无意义的阳性结果报告，报告菌落 数、革兰氏染色形态特征，并注明是纯 培养或是混合菌生长。 阴性结果报告:应报告无菌生长和菌落计 数＜1000cfu/ml或 ＜100cfu/ml尿。
微生物检验报告中常见疑义解析
微生物检验报告常见疑义解析徐州市第六人民医院检验科李继刚在临床上，常见的致病菌或条件致病菌有很多种类，根据对氧气的需求可以分为需氧菌、微需养菌、兼性需养菌、兼性厌氧菌、厌氧菌；根据对培养基的要求可以分为苛养菌和非苛养菌。
苛养菌对培养条件要求苛刻，例如流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌艰难梭菌等，非苛养菌对培养条件要求不高，一般实验室可以做到。
目前大多数实验室只能针对需氧菌中的非苛养菌进行培养、鉴定及药敏试验，这就引发了一系列的问题，例如细菌涂片镜检报告与细菌培养报告结果矛盾，细菌培养报告与临床不符等。
因此，我科微生物室工作人员特就这些问题做出解答，并提出一些解决方案。
1.问：临床经常发现脑膜炎疑似患者，而脑脊液培养结果常为阴性，为什么？答：引起脑膜炎的常见细菌为脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、结核杆菌等等，脑膜炎奈瑟菌的培养需要5%的二氧化碳和巧克力培养皿，流感嗜血杆菌需要特殊的营养因子，结核杆菌需要专用培养基，这些条件多数医院无法做到。
临床在采集脑脊液标本时，可以另外留取一部分做细菌、结核菌和真菌涂片检测，如果确实需要做培养，需要根据培养的种类另外交费，送外院检验，我们医院开展的是普通细菌培养。
2.问：临床常见的脓肿，抽出来的脓液常为恶臭味，但细菌培养结果为无细菌生长，为什么？答：脓肿的原因多种多样，有病毒、肿瘤、寄生虫等引起的无菌性坏死，也有真菌感染或自身免疫原因引起的坏死，但这些一般没有恶臭味，最常见的原因是细菌感染。
厌氧菌和苛养菌培养目前大多数实验室都没有条件开展，建议同时进行细菌涂片检验和细菌培养，如果细菌涂片阳性而细菌培养阴性，则为厌氧菌或其他苛养菌感染，如果细菌涂片阴性而细菌培养阳性，则为污染。
3.问：严重腹泻患者粪便培养大多数为阴性，为什么？答：正常粪便中的菌群多种多样，包括乳酸杆菌、双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、枯草杆菌、葡萄球菌、链球菌、肠杆菌、酵母菌等，其中主要为革兰阳性杆菌，占80%左右，其次为肠球菌。
临床标本的细菌检验
痰标本临床通常将正常人喉以上部位称之为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌或仅有少量细菌侵入。
在呼吸道标本细菌学检验中，上呼吸道标本（咽拭子）由于有正常菌群的存在，不易判断出何为与疾病有关的细菌，进行普通培养无特别意义《插入表上呼吸道存在的正常菌群》。
下呼吸道感染是最常见的呼吸道感染症，临床常取痰液标本进行细菌学检验，以明确感染病原及其药敏结果，有助于疾病治疗、流行病学调查和医院感染的监测。
痰标本须经上呼吸道排出，常受该处正常菌群的污染，因此，判断下呼吸道分泌物中是否有病原菌存在，须对上呼吸道的正常菌群有所了解。
上呼吸道的正常菌群有α、γ链球菌、微球菌、拟杆菌、梭杆菌、厌氧球菌、表皮葡萄球菌、奈瑟菌、嗜血杆菌、棒状杆菌。
标本的验收遇有不合格标本，应及时与临床联系，报告不合格标本拒收的具体理由。
拒收标准：a.肉眼观察痰标本呈水样或唾液样。
b.标本涂片白细胞数＜10/低倍镜和鳞状上皮细胞数＞25/低倍镜，表示该标本已污染正常菌群，建议重送标本。
c.容器错误标本容器必须符合规定，溢漏、无盖者拒收。
分离培养1．痰标本培养前处理（均质化）2．分离培养（1）一般细菌培养应同时划区接种（痰半定量原则）痰半定量方法：用接种坏将痰液在血平板和巧克力平板上作三区划线接种标本，进行培养。
痰半定量培养的临床意义三区划线法：首先用无菌棉签挑取痰液的脓或血性部分（或将接种坏通过火焰灭菌，冷却后挑取标本少许，尽量取有脓或血部分）然后将其涂布在平板第一区，并作数次划线，再在二、三区依次用接种环划线，每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。
1）血平板（5%CO2环境）适用于分离肺炎链球菌和其他细菌。
2）巧克力平板（5%CO2环境）适用于分离嗜血杆菌。
3）麦康凯/中国蓝平板（需氧环境）适用于分离革兰阴性杆菌。
（2）分离培养血平板和巧克力平板置5%CO2环境，麦康凯平板/中国兰平板置普通孵箱，35℃孵育。
临床常见标本的细菌学检验
痰液的采集
采集指征
下呼吸道感染者可有发热、咳嗽和咳痰 可伴有胸痛、气急甚至呼吸困难，肺部可闻及湿罗音；
X线检查肺部有炎性浸润或胸腔积液 严重可致感染性休克和呼衰。
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痰液的采集和运送
采集方法
自然咳痰法 支气管镜采集法 防污染毛刷采集 法 支气管肺泡灌洗法 胃内采痰法 小儿取痰法
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痰液的采集和运送
涂片检查 生化试验 血清学鉴定 药敏试验 动物试验 报告
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尿液的检验
菌落计数
定量接种尿液培养标本 根据细菌在平板上的生长情况 定量报告每毫升尿液中所含有的细菌数（CFU/ml）
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尿液标本常见的病原菌
病原菌
正常 菌群
G+
金葡 化脓性链球菌 肠球菌 结核分枝杆菌 葡萄球菌 枯草杆菌 非致病性棒状杆菌
注意培养时间
加做无菌对照
涂片染色检查
结合培养细菌的生长特点对照判断
8
（四）检验程序
标本选择 采集（保存运送）
观察、前处理
直接 涂片
报告
快速 检验
报告
分离培养 （需、厌氧、CO2培养）
可疑菌落 (必要时先做培养)
增菌(需氧、厌氧、 CO2培养)
涂片检查 生化试验 血清学鉴定 药敏试验 动物试验 报告
难辨梭菌
杆菌
G-
沙门菌 大肠埃希菌
志贺菌 霍乱弧菌 副溶血弧菌
弯曲菌 小肠结肠炎耶尔森菌
变形杆菌
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粪便检验的临床意义
肠道致病菌
霍乱弧菌-霍乱，志贺菌-细菌性痢疾，伤寒沙门菌-伤寒；
食物中毒
沙门菌、弯曲菌、葡萄球菌、副溶血弧菌。
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第二节 临床常见标本的细菌学检验
临床医学检验：临床细菌学学习资料
临床医学检验：临床细菌学学习资料1、单选用于霍乱弧菌培养的选择性培养基是()A．SS琼脂B．麦康凯培养基C．LB琼脂D．蛋白胨水E．庆大霉素琼脂正确答案：E2、单选?患者王某某，男，36岁，有肺结（江南博哥）核病史，现持续性膀胱炎，经一般抗菌药物治疗后症状不缓解，怀疑为肾结核。
结核分枝杆菌培养最常用的固体培养基是()A．SS培养B．中国蓝培养基C．MAC培养基D．改良罗氏培养基E．巧克力琼脂正确答案：D3、单选与大肠埃希菌比较，伤寒沙门菌在糖发酵方面的主要差别是伤寒沙门菌不分解()A．葡萄糖B．乳糖C．蔗糖D．麦芽糖E．山梨醇正确答案：B4、问答题简述白喉毒素的致病与免疫机制。
正确答案：白喉棒状杆菌是白喉的病原菌，因患者咽喉部粘膜具有灰白色假膜而名。
传染源为患者和带菌者，以飞沫和玩具等为媒介传染，引起急性呼吸道传染。
本菌不侵人血液，在粘膜局部定植并产生白喉毒素，引起局部炎症和侵入血液形成毒血症，致全身中毒症状。
白喉毒素具有强烈细胞毒作用，可使局部粘膜上皮细胞产生炎症、渗出和坏死反应，渗出的纤维素和局部细菌、炎症细胞、坏死粘膜紧密结合在一起形成假膜，不易拭去。
若假膜延伸并脱落于气管，可致患者于疾病早期窒息死亡。
白喉毒素是一种酶原，经酶蛋白降解后，分成A、B两个多肽片段，B肽链无酶活性，有1个受体结合区和1个转位区，与易感细胞表面受体结合，显示其选择性亲和力；A肽链有酶活性，但不能单独侵入细胞；通常A肽链由B肽链携带，附着于细胞膜受体并转运入胞质内。
A肽链使细胞内延伸因子Ⅱ(EF-2)失活，易感细胞蛋白质合成障碍。
常见的易感细胞有心肌、外周神经、肝、肾、肾上腺等组织，可引起相应的临床症状。
免疫机理：人类对白喉毒素有一定耐受性，足量白喉毒素可激发机体产生充分的免疫应答，故病后可获得以体液免疫为主的牢固免疫力。
5、判断题葡萄糖氧化-发酵试验不能用于鉴别需氧菌和厌氧菌。
()正确答案：对6、单选结核分枝杆菌具有以下特征()A．细胞壁含有大量脂质B．生长缓慢C．专性需氧菌D．传染性免疫E．以上都是正确答案：E7、单选?如图所示为细菌的触酶试验结果，下列对于该图的描述正确的是()A．1和2均为触酶阳性B．1和2均为为触酶阴性C．1为触酶阴性，2为触酶阳性D．1为触酶阳性，2为触酶阴性E．要据细菌的菌落形态综合判断正确答案：D8、单选关于铜绿假单胞菌的培养特性，错误的是()A．需氧生长，生长温度范围广B．营养要求较高C．最适生长温度为35℃D．在血琼脂平板上产生透明溶血环E．能产生水溶性色素正确答案：B9、填空题副溶血性弧菌在含______NaCl的培养基上生长良好。
从临床标本分离、鉴定细菌的基本要领
从临床标本分离、鉴定细菌的基本要领
1．重视标本送检申请单
标本送检申请单上通常均注明标本的来源及患者的主要临床情况，检验者应予以重视。
这样，可有目的的去检出病原菌，避免走弯道。
2．注意选择适宜的培养基
各种标本初分离应选用的培养基类别参见下表。
各种标本初分离细菌应选用的培养基
3．认真识别污染菌
在从标本中分离出细菌时，应特别注意区分是否是人体正常菌群成员。
并且要识别是否是污染菌，其识别法通常有以下几点：
（1）观察菌落是否在划线上。
（2）结合拟培养细菌的生长特点去对照判断（如菌落的形状、大小、边缘、透明度、湿润度、溶血现象等）。
（3）注意观察培养时间。
非致病菌与致病菌的生长速度不同。
例如布鲁菌与结核分枝杆菌生长缓慢。
（4）涂片染色检查，观察是否与目的菌一样。
值得提出的是机体的某些部位通常是无菌的，若检出细菌，应视为致病菌（如血液、骨髓、脑脊液等）。
临床标本的细菌学检查汇总
二 生殖道标本
正常的内生殖器是无菌的，而外生殖器 （包括男性尿道口和女性阴道）有多种细 菌寄生。 查见病原菌提示有细菌感染。 常见的病原菌主要有葡萄球菌、肠球菌、 链球菌、淋病奈瑟菌、大肠埃细菌、变形 杆菌等。
（一）标本采集 1.女性生殖道标本 2.男性生殖道标本 3.梅毒螺旋体标本
第五节 泌尿、生殖道标本
一 尿液标本
中段尿培养加计数对于泌尿道感染的诊断有重要 价值。细菌培养必须结合菌落计数辨别是否为病 原菌。 有致病菌或条件致病菌生长，菌落计数>105/ml， 提示感染（膀胱炎，肾盂肾炎、肾或膀胱结核 等）。 常见病原菌主要有大肠埃希菌、葡萄球菌、链球 菌、变形杆菌和伤寒沙门菌等。
（2）男性
（一）标本采集
1. 中段尿标本采集法 （1）女性：
（3）儿童、婴儿
（4）两侧肾盂尿
（5）膀胱穿刺
（二）检验方法和操作流程 ■1.涂片检查 （1）一般细菌及淋病奈瑟菌 （2）念珠菌 （3）结核分枝杆菌 ■ 2.一般细菌培养 如培养2d无细菌生长，即可弃 去。 （1）倾注平板法 （2）平板接种环法 （3）标准接种环法：若定量接种环含量为.001ml， 则整个平板菌落数超过100个，可报告“菌落数 >105/ml”。 （4）Uricult 半定量法
法尿 和液 操标 作本t 操作步骤
Uricult 菌落比密图
Uricult 细菌种类标准模式 图
4.特殊菌落培养 （1）淋病奈瑟菌培养 （2）厌氧菌培养 （3）结核分枝杆菌培养 5.报告方式 培养48h无细菌生长，报告“2 天无细菌生长”。查见细菌，报告菌名及 其菌落计数（菌落数/ml）和药敏结果。
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问题1：如何正确应用药物敏感结果？
正确运用药敏试验结果应考虑以下3个方面：
首先要确定病原菌，如未找到真正的致病菌，药敏实验不但不能指导用药甚至可能误导临床；
重视耐药监测，这是经验用药的一个重要的参考；
考虑到药敏试验的局限性：体外报告敏感的药物体内治疗不一定有效，而体外报告耐药的药物体内治疗不一定无效。
问题2：是否MIC越低的药物越好？
不一定。
因为不同药物对同种细菌，同一药物对不同细菌的折点均可不同，并且若细菌产生某些特殊耐药机制时，即使体外敏感也应报耐药，另外尚需考虑药动学和耐受性。
因此，不能单纯比较MIC值而认为MIC越低的药物就一定越好。
MIC只表示一种药物对某一株细菌抗菌作用的强弱，MIC越低（离中介值越远）说明该药物对相应的病原菌的作用越强。
只能比较同一种药对同一株菌，若MIC值升高，可认为其耐药性提高。
问题3：是否所有报告的细菌均为病原菌？
不一定。
原因如下：
所报告细菌为污染菌或定植菌，细菌培养结果的临床意义大小与所取标本有关。
如为血液等无菌标本则临床意义较大，但即使血培养阳性也可能为污染菌。
某些标本易受污染如痰标本易于受咽喉部携带菌的污染，尿培养易受下尿道、尿道口寄居菌污染。
可能为应用抗菌药后的菌群交替或菌群失调。
特别是原为复数菌感染时，针对优势菌治疗一段时间后可能非优势上升为优势菌，或广谱抗菌药治疗后可
能出现真菌感染。
有２种以上病原菌时因生长速度不同、营养要求不同，培养结果不能真实反映病原菌的种类、数量。
问题4：为什么有时痰涂片结果与痰培养结果不一致？
由于痰标本进行培养和涂片时选取的部位不一致；
某些快生长菌所占比例并不多，但由于生长速度快、营养要求低，能在培养过程中迅速变为优势菌而掩盖其他菌的生长；
标本从采集到接种的时间过长，造成部分苛养菌死亡，在涂片中看到的只是菌的残骸而非活菌。
问题5：我们想用的药物在药敏试验中没有做？
1.天然耐药
2.可能是药物的敏感性被其他药物所预报
问题6：为什么有的菌报告很多种药物，有的仅报告几种药物？
报告的药物种类根据细菌种类的不同而有所不同，如铜绿假单胞菌报告的药物较多，而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药敏较少。
问题7：是否能将所用的药都做药敏试验?
1.没有必要：通过耐药机制和标志性药物可以预测其他抗菌药物的敏感性
2.没有可能：不是所用药物都可以做药敏试验（需要药物在体外稳定，需要有操作标准和解释标准）
问题8：选择药敏报告敏感的药物，为什么临床治疗无效？
①体外药敏试验只能预测体内治疗效果，并不等同；一般来说，耐药＝治疗无效；敏感≠治疗有效；
②可能不是真正的致病菌（污染或定植菌）；
③细菌本身因素（如诱导耐药，生物被膜）；
④感染部位与药代动力学因素；
⑤细菌的MIC，给药剂量和用药方式；
⑥敏试验药物中有些药物单独使用无效，但可以与其他药物联合用药；
⑦药物剂型及生物利用度（纯品、商品）。
问题9：涂片镜检结果与培养结果不吻合？
①涂片镜检是报告所有检见的细菌，而培养的目的是检出致病菌,因此会产生涂片和培养结果不一致的情况；
②一些苛氧菌需在特殊的环境或培养基上才能生长，因此可能在培养后才能得到。
问题10：取的明显就是脓液标本，为何鉴定报告为无菌生长？
①我们做的是有氧培养，脓液可能为厌氧菌感染。
②可能细菌被大量的中性粒细胞吞噬。
问题11：鉴定结果明明写着四联球菌、革兰氏阳性杆菌，为何没有药敏结果？
①四联球菌为微球菌，一般不引起人体致病，为非致病菌，故考虑污染可能；
②药敏结果参照CLSI标准，目前革兰氏阳性杆菌没有参照标准，故暂不能做药敏试验，若需治疗可参照阳性球菌用药。
问题12：一般培养不是三天出结果吗，今天第四天了怎么还没出来？
一般培养经48小时后，即第三天出报告，若需分离致病菌的则第四天出报
告。
细菌生长慢，生长需要适宜的条件。
细菌一般以二分裂法进行无性繁殖，在适宜条件下，多数细菌分裂一次需
要20-30分钟，结核分枝杆菌需18-20小时才分裂一次。
对数期（鉴定、药敏
常用该期的培养物）一般在培养后8-18小时。
普通细菌培养一般需48小时（培养需12-24小时，鉴定药敏需要12-24小
时）；酵母样真菌阳性报告需要2-3天，阴性报告需5天；丝状真菌（霉菌）
阴性报告需2-4周；血培养阳性报告需3天以上，阴性报告需5-7天。
问题13：今天的培养结果怎么与前天的不一样？
①取材是否规范。
②痰标本，有时选优势菌做，就可能导致两次不一样。
③抗生素的使用
问题14：明显稀便，培养结果为何正常？
①大便普通培养，通常只能鉴定志贺菌、沙门菌感染，致病性大肠杆菌
②怀疑霍乱时，需开霍乱弧菌培养；
③可能病毒感染(轮状病毒)。
问题15：为什么阳性率太低，临床符合率差?
不合格的标本直接导致病原菌分离率降低。
操作程序不规范，未进行直接涂片，未严格执行拒收制度等也是重要原因。
微生物和人体关系复杂。
致病和条件致病，定植和感染等，导致细菌室判
断病原菌困难，要证明培养结果与感染相关性是临床微生物检验所面临的难题。
已使用抗菌药，病原菌受到伤害，不能正常生长。
实验室条件有限，苛养菌漏检，常规培养不能检测厌氧菌、结核杆菌、衣原体、支原体、病毒等.。