穿刺液标本细菌学检验标准操作规程
脑脊液标本细菌学检验标准操作规程
脑脊液标本细菌学检验标准操作规程1.目的规范脑脊液标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2.适用范围脑脊液培养。
3.标本3.1标本类型脑脊液。
3.2 标本采集由临床医师以无菌要求做腰椎穿刺，抽取脑脊液2-3ml，盛于无菌容器中送检。
脑膜炎奈瑟菌离体后能产生自溶酶，迅速自溶，肺炎链球菌及流感嗜血杆菌离体后也易于死亡。
因此，脑脊液无论涂片或培养，必须于采集后立即送检。
3.3 标本拒收标准3.3.1 标本标识与化验申请单不符。
3.3.2 标本未用无菌试管留取。
3.4 标本保存采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置于室温，放置时间不应超过2小时，切勿放冰箱，否则影响检出率。
4. 试剂、仪器4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、麦克凯平板、相关生化试剂等。
．4.2 VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GPS）、药敏纸片、TBA板条等，有效期及储存条件参见试剂说明书。
4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱等。
5. 细菌鉴定和药敏质控参见《质量管理程序》6. 检验步骤接收标本后，立即对标本进行编号、登记。
6.1 涂片检查6.1.1 一般细菌涂片检查外观浑浊或脓性脑脊液可直接涂片，无色、透明的脑脊液，应3000r/min离心10-15分钟后取沉淀物涂片、革兰染色、就、镜检。
根据染色及形态特征，常可初步提示细菌的种类。
6.1.2 结核分枝杆菌涂片检查参见《分支杆菌属检验标准操作规程》6.1.3 新生隐球菌涂片检查取脑脊液的沉淀物作墨汁负染色，或取脑脊液的离心沉淀物接种于沙氏培养基，置于35摄氏度培养2~5日，根据菌落特性，涂片染色镜检作出报告。
必要时可作生化反应进一步鉴定。
分离培养6.2．6.2.1用接种环挑取混浊脑脊液或经离心沉淀的沉淀物，分别接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯平板，置于5%~10%CO2环境中35摄氏度培养18~24小时，观察细菌生长情况，根据菌落特点、形态与染色及生化反应鉴定细菌，并作药敏试验。
血液及骨髓液标本细菌学检验
血液及骨髓液标本细菌学检验标准操作程序1.检验目的规范血液及骨髓标本细菌学检验，确保检验结果准确可靠。
2.适用范围血液及骨髓液培养3. 标本采集与运送3.1 标本采集3.1.1 无菌操作采集静脉血标本无需更换针头直接注入血培养瓶中。
3.1.2 釆血时间3.1.2.1 发热初期或高峰期时抽血；3.1.2.2 使用抗生素之前。
已使用抗生素者，下一次使用之前。
3.1.3 采血频率3.1.3.1 急性脓毒症：10min内从不同部位采集2-3套。
3.1.3.2 急性心内膜炎：1-2h内从3个不同体位采集3套。
3.1.3.2 亚急性心内膜炎：从3个分离部位采3套，间隔≥15min，如24h为阴性，要再采3套。
3.1.3.3 原因不明发热：从不同体位采2-3套，间隔≥60min，如24h为阴性，要再采3套。
3. 1.4 采血量以培养基的1/10-1/5为宜,新生儿一次采血0.5m1，儿童1-5ml，成人8-10m1。
3.1.5 骨髓标本严格无菌操作，对穿刺一侧部位准备同外科切口，用骨髓穿刺针从髂骨采集。
采集量一般为1-2ml。
3.2 标本运送3.2.1 采集标本后立即送到细菌室，不能及时送检可置室温，切勿放于冰箱。
3.2.2 冬季血培养瓶送检过程应采取一定的保温措施。
3.2.3 在细菌室下班时间，标本应送急诊化验室进行标本保温。
4. 检验步骤4.1 培养：扫描血培养瓶的条码，将血培养瓶置BACT／Alert 3D全自动血培养系统中培养。
4.2 阳性血培养瓶转种：当有菌生长时，仪器发出阳性报警，立即在生物安全柜中用无菌注射器抽取瓶内培养液直接涂片革兰染色，镜检，以电话方式告知临床医生镜检结果并登记危急值登记本。
同时转种血平板。
4.3 培养：血平板置于35℃培养箱培养18一48h。
4.4 培养结果观察：正常人的血液是无菌的，有菌落形成即为可疑致病菌，从琼脂平板上挑取可疑致病菌落进行涂片染色镜检。
除极少引起感染的微球菌和需氧芽孢杆菌外，均需要进行细菌鉴定和药敏。
临床常见标本的细菌学检验
痰液的采集
采集指征
下呼吸道感染者可有发热、咳嗽和咳痰 可伴有胸痛、气急甚至呼吸困难，肺部可闻及湿罗音；
X线检查肺部有炎性浸润或胸腔积液 严重可致感染性休克和呼衰。
44
痰液的采集和运送
采集方法
自然咳痰法 支气管镜采集法 防污染毛刷采集 法 支气管肺泡灌洗法 胃内采痰法 小儿取痰法
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痰液的采集和运送
涂片检查 生化试验 血清学鉴定 药敏试验 动物试验 报告
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尿液的检验
菌落计数
定量接种尿液培养标本 根据细菌在平板上的生长情况 定量报告每毫升尿液中所含有的细菌数（CFU/ml）
31
尿液标本常见的病原菌
病原菌
正常 菌群
G+
金葡 化脓性链球菌 肠球菌 结核分枝杆菌 葡萄球菌 枯草杆菌 非致病性棒状杆菌
注意培养时间
加做无菌对照
涂片染色检查
结合培养细菌的生长特点对照判断
8
（四）检验程序
标本选择 采集（保存运送）
观察、前处理
直接 涂片
报告
快速 检验
报告
分离培养 （需、厌氧、CO2培养）
可疑菌落 (必要时先做培养)
增菌(需氧、厌氧、 CO2培养)
涂片检查 生化试验 血清学鉴定 药敏试验 动物试验 报告
难辨梭菌
杆菌
G-
沙门菌 大肠埃希菌
志贺菌 霍乱弧菌 副溶血弧菌
弯曲菌 小肠结肠炎耶尔森菌
变形杆菌
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粪便检验的临床意义
肠道致病菌
霍乱弧菌-霍乱，志贺菌-细菌性痢疾，伤寒沙门菌-伤寒；
食物中毒
沙门菌、弯曲菌、葡萄球菌、副溶血弧菌。
42
第二节 临床常见标本的细菌学检验
实验十三 脓汁标本的细菌学检验一
五、试验内容
1.革兰染色 2.分离培养
血平皿及麦康凯平皿
四 步骤和方法
1.标本的采集： 注意防止正常菌群的污染 ①封闭性脓肿 ②开放性脓肿 ③胸，腹水 ④大面积烧伤的创伤分泌物 ⑤瘘管
封闭性脓肿： ①封闭性脓肿 在病灶局部外表消毒后，以 无菌注射器抽取脓液5-10ml 置无菌试管中送检。若怀疑 厌氧菌感染时，抽取脓液后 立即排尽注射器内的空气， 刺入无菌橡皮塞中送检。
开放性脓肿： ②开放性脓肿 先消毒病灶周围，用无菌生 理盐水或70%的酒精擦去表 面渗出物，然后用无菌棉签 采取病灶深部脓液及分泌 物，置无菌试管中送检。 （采集两个拭子，一个做革兰染色，一个做 分离培养）
腹水： ③胸，腹水 由临床医生无菌采集胸腔或腹 腔积液5-10ml，置无菌试管中 送检。（一般应先在无菌试管 中加入灭菌肝素0.5mg,防止标 本凝固）
实验十三 脓液及穿刺 液脓液及穿刺液的标本采集方法 2.掌握脓液及穿刺液标本的细菌学检验程序 和方法
二、器材
1.标本： 脓汁模拟标本 2.培养基：BA 、Mac 3.试剂： 革兰染色液 3. 4.其他： 玻片、接种环、酒精灯、显微镜等
三、常见致病菌
1、革兰阳性需氧菌: 金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、肠球菌等 2、革兰阴性需氧菌: 肠杆菌科细菌、假单胞菌属等 3、厌氧菌: 拟杆菌属及其它厌氧杆菌、梭状芽胞杆菌、 厌氧球菌 4、其他： 放线菌、诺卡菌、白色念珠菌
② 如做厌氧培养，应用厌氧运送系统运送。 标本在2小时以内到达实验室。
2.检验程序 2.检验程序
脓液、 脓液、创伤分泌物及穿刺液
涂片
需氧培养
厌氧培养
隔绝氧气运送
革兰染色 抗酸染色 厌氧琼脂平板 BA 、 Mac
临床微生物SOP-穿刺液涂片标准操作规程
1．目的
规范穿刺液标本涂片标准操作规程。
2．适用范围
穿刺液标本，包括胸腔积液、腹水及胆汁等。
3．检验步骤
3.1 胸腔积液、腹水及胆汁：将标本经3000 r/min离心10min后取沉淀物涂片。
涂片自然干燥或烘片机烘干后进行革兰染色或抗酸染色。
3.2 镜检与结果报告：标本涂片经革兰染色，根据染色特性、形态排列，初步
报告“找到革兰阴性或革兰阳性球菌或杆菌”。
3.2.1 在镜下找到革兰阳（阴）性球菌，可报告“找到革兰阳（阴）性球菌”。
3.2.2在镜下找到革兰阳（阴）性杆菌，可报告“找到革兰阳（阴）性杆菌”。
3.2.3 如镜检未找到细菌可报告“未查见细菌”。
3.3 真菌涂片检查：参见《真菌涂片标准操作规程》、《墨汁染色标准操作规程》。
3.4 抗酸染色：参见《抗酸染色标准操作规程》。
3.5 质控：每张涂片均做革兰阳性和阴性菌对照。
4．注意事项
胸腔积液、腹水及胆汁标本涂片可以为单一菌种，也可为混合菌种。
5．危急值
无菌体液查见细菌或真菌均需按危急值报告，并记录。
参考文献
[1] 中国合格评定国家认可委员会．CNAS-GL42医学实验室质量和能力认可准则在临床微生物学检验领域的应用说明．2014.
[2] 周庭银编著．临床微生物学诊断与图解，第3版，上海：上海科学技术出版社,2012
[3] Versalovic J, Carroll KC, Funke G, et al. Manual of Clinical Microbiology. 10th ed. Washington: ASM Press, 2011.。
普通细菌培养鉴定操作规程
普通细菌培养鉴定操作规程1检验目的做疾病的病原学诊断，查找于疾病有关的病原菌以及了解微生物与疾病的关系，指导临床治疗及预后和流行病学的调查。
2原理人体很多部位与外界相通，存在栖息菌群，但不致病，当菌群失调或分离到致病菌则具有临床意义；另外机体某些部位是无菌的，如检出细菌则视为致病菌。
并排除采样及操作污染。
3标本要求(1)标本类型：血液，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等体液；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。
(2)标本采集：见标本采集手册(3)标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。
人泌尿生殖道标本如白带前列腺液等需临床标本接种于巧克力平板或特殊的运送培养基并置保温设备中送检。
(4)标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。
4容器和添加剂类型均使用灭菌器InI盛放标本5试剂(1)试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、麦康凯平板、相关生化试剂等(2)试剂生产厂家：XX生物技术有限公司6仪器设备：(1)接种针、接种环、酒精灯、(2)BACTTST黑马微生物鉴定系统。
(3)显微镜、GNP-P270隔水式恒温培养箱、SWYJTF超净工作台、MCoT5A三洋牌二氧化碳培养箱、0414-1台式离心机、FA1004电子天平7校准程序(送XX市计量质量检测研究所校准)8操作步骤(1)血液、骨髓、脑脊液等标本按照培养目的增菌培养12T8小时后盲目接种或待自动分析仪报警后接种。
(2)接种：以上增菌标本及其他临床标本用接种环取标本接种环划线血平板及其他选择性培养基上,35℃培养过夜，观察结果。
(3)涂片：肉眼见细菌生长，取生长物涂片做革兰氏染色；(4)纯培养：根据需要接种血平板、巧克力、中国蓝/麦康凯或厌氧平板过夜培养以获得纯培养。
(5)鉴定：按照鉴定仪要求调配菌液浓度，细菌的鉴定见BACTTST黑马微生物鉴定系统10质量控制：参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动11生物参考区间血液，骨髓，脑脊液等无菌部位采取的标本未见细菌生长；其他标本如大便，痰液为正常菌群或未见致病菌。
规范血液及骨髓标本细菌学标准操作规程
1.目的规范血液及骨髓标本细菌学标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2.适用范围血液及骨髓。
3.标本3.1 标本类型血液及骨髓。
3.2 标本采集3.2.1 采血时间抗菌药物治疗前，发热初期或高峰时抽血。
3.2.2 采血频率对怀疑菌血症的成人患者，推荐同时在不同部位采集2~3套（每套包括一瓶需氧瓶，一瓶厌氧瓶或者两套需氧瓶）对感染性心内膜炎和真菌血症则应多次采集；婴幼儿患者，推荐同时在不同部位采集2套，可不做厌氧培养。
3.2.3 采血量以无菌方法从患者肘静脉或股动脉采血。
采血量以培养基的1/10为宜，成人一次采血10-20ml，儿童为3-5ml。
血液抽出后，立即以无菌操作注入血培养瓶，充分混合后送检。
3.2.4 骨髓标本用骨髓穿刺针从髂骨采集1-2ml,立即以无菌操作注入血培养瓶，由于骨髓标本量少可选择小儿需氧瓶及厌氧瓶。
3.3 标本拒收标准3.3.1 血培养瓶破裂或有明显污染。
3.3.2 培养瓶标识与化验申请单不符。
3.3.3 用过期的培养瓶采集标本，采血量不足等。
3.3.4 对于不合格标本，应及时通知采集人员重新留取标本。
3.4 标本保存采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置室温，切勿放冰箱。
冬季血培养瓶在送检过程应采取一定的保暖措施。
4.试剂、仪器4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、巧克力平板、中国蓝平板、沙保罗平板相关生化试剂等。
4.2 BACT 9050全自动血培养系统、ATB Expression鉴定及药敏分析仪。
成人需氧血培养瓶，厌氧血培养瓶、儿童血培养瓶、TDR系统鉴定卡及药敏板。
4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2 培养、生物安全柜等。
4.4 试剂的有效期和使用参照试剂说明书。
5.细菌鉴定和药敏质控参见《微生物组室内质量的控制程序》。
6.检验步骤接收标本后，立即用Lis系统签收对标本进行编号、登记。
门诊病人要同时登记联系电话等病人信息。
6.1 自动化培养6.1.1 置全自动血培养仪中。
穿刺液标本
穿刺液标本穿刺液主要包括脑脊液、胸水、腹水、心包夜、胆汁、关节液及鞘膜液等。
在正常人体中，上述体液是无菌的，在排除污染的情况下，一旦检出的细菌均视为病原菌。
一、脑脊液标本的采集（一）标本的采集与运送1.送检指征成人：发热、头痛、恶心、呕吐、颈强直和反射增强等等症状，怀疑为脑膜炎的患者。
儿童：儿童和新生儿的临床表现不明显，因此对于婴幼儿不明原因发热，应怀疑为脑膜炎，采集脑脊液送检。
2.采集时间当怀疑患者脑膜炎时应立即采集脑脊液，并尽量在用抗生素之前采集脑脊液。
3.采集方法及采集量脑脊液通常是经腰椎穿刺采集（注意严格无菌操作），如果用于检测细菌或病毒，脑脊液量应大于或等于1ml，如果用于检测真菌或抗酸杆菌，脑脊液量应大于或等于2ml。
4.标本的运送标本采集后应在15分钟内送至实验室。
若延误送检，标本应置于室温保存，但保存时间不得超过24小时，但送检延迟可能对苛氧菌的检出有影响。
脑脊液标本不可防冰箱保存，以防某些细菌死亡（如脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和嗜血杆菌）。
（四）注意事项1.最好在抗菌药物治疗前采集标本。
2.穿刺过程中姚严格无菌操作，防止污染。
3.采集脑脊液的试管不需要加入防腐剂。
4.做脑脊液培养的同时，建议做血培养。
5.厌氧菌几乎不引起脑膜炎，常规不要求做脑脊液的厌氧菌培养。
但是脑脓肿，硬膜下积脓及硬膜外脓肿的患者需要做厌氧培养。
二、胆汁标本（一）标本的采集1.送检指征腹痛、黄疸、右上腹压痛，肌紧张、胆囊区深吸气时有触痛、常有恶心、呕吐和发热，尿少且黄，中毒或休克等。
2.送检时间怀疑感染存在，应尽早采集，一般在患者使用抗菌药物之前或停止用药后1~2日采集。
3.采集方法一般胆汁采取的方法有3种，即十二指肠引流法，胆囊穿刺法及手术直接采取法。
（1）十二指肠引流法：十二指肠引流液包括十二指肠液（D 液，无色或淡黄色，透明或微浑）、胆总管液（A液，金黄色，透明）；胆囊液（B液，深褐色，透明）和肝胆总管液（C 液，透明）；实际上，是十二指肠液、胰液、胆汁、少量胃液的混合物。
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穿刺液标本细菌学检验标准操作规程
1.目的
规范穿刺液标本细菌学检验标准操作规程，确保检验结果准确可靠。
2.适用范围
穿刺液标本培养。
3.标本
3.1 标本类型胸水、腹水、心包液、关节液、鞘膜液等。
3.2 标本采集采用无菌方法采集体内可疑感染部位的液体约2ml，注入无菌试管，或抽取穿刺液1-2ml注入多功能液体培养瓶，或抽取穿刺液2-5ml注入血培养瓶，混匀，立即送检。
如怀疑厌氧菌感染，应做床边接种或接种运送培养基。
3.3 标本拒收标准
3.3.1 标本标识与化验申请单不符。
3.3.2 标本不是无菌留取，容器不符合要求。
3.4 标本保存采集标本后立即送到实验室，不能及时送检可置于室温，放置时间不超过2小时。
4.试剂、仪器
4.1 革兰染液、氧化酶试剂、3%触酶、血琼脂平板、
巧克力平板、麦克凯平板、相关生化试剂等。
4.2 VITEK鉴定系统；革兰阴性菌鉴定卡（GNI+）、革兰阴性菌药敏卡（GNS）、革兰阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰阳性菌药敏卡（GPS）、真菌鉴定卡（YBC）、药敏纸片、TBA板条等，有效期及储存条件参见试剂说明书。
4.3 接种针、接种环、电热灼烧器、显微镜、孵育箱、CO2培养箱等。
5. 细菌鉴定和药敏质控
参见《质量管理程序》
6. 检验步骤
接收标本后，立即对标本进行编号、登记。
6.1 涂片检查脓性标本直接涂片。
浆液性标本先离心（3000r/min）15分钟，取沉淀物涂片作革兰染色，观察有无细菌，以及细菌的形态。
6.2 分离培养
6.2.1 一般细菌培养接种于接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯（或EMB、中国蓝）琼脂平板，置于5%-10%CO2环境中，35°C培养18-24小时，根据菌落及染色形态特点，作出初步判断。
6.2.2 增菌-分离培养法将多功能体液培养瓶颠倒混匀使液体覆盖整个固体面，然后置35°C孵育培养箱（固体面在
上，液体在下）。
次日观察固体表面菌苔生长及瓶中液体是否浑浊。
如发现有菌生长，立即涂片镜检、生化鉴定和药敏试验。
此法可提高阳性检出率。
6.2.3 厌氧菌培养床边接种或从厌氧菌运送培养基转种后，立即置于厌氧环境中，35°C培养24-48小时；挑取可疑菌落作耐氧试验，确定为厌氧菌。
6.2.4 结核分枝杆菌培养：参见《分支杆菌属检验标准操作规程》。
7．结果报告
培养48小时无菌生长，报告“培养2日无细菌生长”。
查见细菌，报告菌名和药敏结果。
注意事项
标本的采集一定要严格履行无菌操作技术，避免污染。
加入抗凝剂的标本（如胸腹水）采集后要与抗凝剂充分混匀并及时送检。
体液均需做厌氧培养，故运送过程严格厌氧环境。
临床意义
各个部位穿刺液（胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等）的细菌学检查对于确定该部位是否有细菌感染具有重要的诊断价值。
正常穿刺液是无菌的，若从病人穿刺液中查见致病菌或条件致病菌则提示该部位有细菌感染。
胸腔感染
的病原菌以结核分枝杆菌多见，其次是金黄色葡萄菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等，腹腔感染的病原菌以肠道细菌如大肠埃希菌、溶血性链球菌、粪肠球菌，以及结核分枝杆菌多见；心包炎和关节炎以金黄色葡萄菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌等多见。
10．危急值报告
涂片发现细菌或培养阳性均需要及时向临床报告结果。