Cre LoxP系统介导的位点特异性重组技术 陈双喜
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在病毒感染性疾病治疗中的应用
基因敲除技术能够消除病毒复制所需的宿主细胞内基因从而阻止病毒的复制和感染。
基因敲除技术可以用于开发新型抗病毒药物通过抑制病毒复制或干扰病毒生命周期的关键环节 来治疗病毒感染。
基因敲除技术可以用于基因治疗通过将正常基因导入宿主细胞替代缺陷基因恢复细胞功能达到 治疗目的。
CRISPR-Cs9与病毒载体的联用
Cre-loxP技术用于控制基 因表达
CRISPR-Cs9技术用于编 辑基因
病毒载体在基因敲除中的重 要作用
Cre-loxP、CRISPR-Cs9 技术与病毒载体的联用原理
三者联用的优势与挑战
优势：Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体在基因敲除中的联用可以实现高效、精准 的基因敲除有助于研究基因功能和疾病治疗。
基因敲除技术简介 Cre-loxP系统在基因敲除中的应用 CRISPR-Cs9系统在基因敲除中的应用 病毒载体在基因敲除中的联用
基因敲除技术在癌症治疗中的应用
基因敲除技术能够精准地编辑人类基因为癌症治疗提供了新的手段。
通过敲除致癌基因或激活抑癌基因基因敲除技术可以有效抑制癌症细胞的生长和扩散。 基因敲除技术在癌症治疗中具有个体化、精准化的特点可以降低治疗副作用和提高治疗 效果。 目前基因敲除技术在癌症治疗领域仍处于研究阶段但已取得了一定的成果和进展。
基因敲除技术还可以用于疫苗开发通过消除病毒基因中的关键位点降低病毒的毒力或致癌性从 而开发出更安全、更有效的疫苗。
06
未来展望与研究方向
Cre-loxP、CRISPR-Cs9技术与病毒载体联用技术的发展 前景
技术改进：随着 基因编辑技术的 不断进步CreloxP、 CRISPR-Cs9与 病毒载体的联用 技术将得到进一 步优化提高敲除 效率和应用范围。
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理Cre-loxp系统是一种常用的基因敲除技术，用于特定区域的基因敲除。
该系统是通过两种转基因技术相互配合实现的，即Cre重组酶和loxp位点。
Cre重组酶是一种由细菌噬菌体产生的酶，能够识别和剪切含有loxp位点的DNA序列，从而实现特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统的原理如下：1. Cre重组酶的表达：首先，使用基因工程技术将Cre酶的编码基因嵌入到转基因小鼠的基因组中，使其能够在特定的组织或细胞类型中产生。
通过引入特定的启动子或组织特异性表达的促进子，可以实现Cre重组酶在目标组织或细胞中的表达。
2. 基因敲除载体：在目标基因的启动子或内含子区域，插入一对loxp位点。
loxp位点是一种特殊的DNA序列，约有34个碱基对，呈倒向重复，用于诱导Cre重组酶的作用。
3. Cre重组酶的介导：一旦Cre重组酶在目标组织或细胞中表达，它能够识别和结合含有loxp位点的DNA序列，并结合在loxp位点上。
Cre重组酶在loxp位点间发生酶活性，通过识别和切割这两个loxp位点间的DNA链，将目标基因位点裂解。
4. 基因敲除效应：一旦目标基因位点被裂解，无法继续正常转录和翻译，从而导致目标基因的敲除。
这样，就实现了在特定区域的基因敲除。
Cre-loxp系统具有以下特点和优点：1. 灵活性：Cre-loxp系统可以在不同的组织或细胞类型中实现基因敲除，由于Cre重组酶的表达是由特定启动子或组织特异性表达的促进子控制的，因此可以实现组织或细胞特定的基因敲除。
2. 高效性：Cre重组酶的催化作用很高效，能够在较短的时间内进行特定区域的基因敲除。
3. 精确性：Cre重组酶只能识别和剪切含有完整loxp位点序列的DNA链，因此能够实现精确的目标基因敲除，而不会对其他基因产生影响。
4. 可逆性：如果需要在特定的时期或特定的组织中恢复目标基因的表达，只需停止Cre重组酶的表达即可。
Creloxp重组系统介导转基因绒山羊标记基因删除的研究的开题报告
Creloxp重组系统介导转基因绒山羊标记基因删除的研究的开题报告一、研究背景和意义转基因绒山羊是一种非常有价值的动物模型，可以用于生物医学研究、基因功能分析等方面。
然而，随着生物医学研究的发展，越来越多的功能基因被发现，需要进行进一步的研究。
这些基因的研究需要建立相应的转基因绒山羊模型，但由于现有的转基因技术都存在一定的局限性，因此需要寻找新的方法来改进这一情况。
Cre-loxP重组系统是一种高效、原理简单的基因编辑技术，具有精准、可控、快速等特点，被广泛应用于哺乳动物基因工程技术中。
利用Cre-loxP重组技术可以实现基因敲除、替换等功能，为研究基因在细胞、组织、器官、器系等不同层次的生理和病理调节机制提供了强有力的工具。
二、研究内容和方法本研究将利用Cre-loxP重组技术对绒山羊进行基因敲除，主要包括以下内容：1. 构建ploxP -neomycin-loxP质粒首先设计、合成ploxP -neomycin-loxP质粒，并纯化得到高质量的DNA。
此质粒在Cre-loxP重组系统中起到重要的作用，是实现基因敲除的关键。
2. 优化Cre-loxP重组体系Cre-loxP重组体系是实现基因敲除的基础，需要建立一个高效、稳定、可重复的体系，才能实现对绒山羊基因的准确编辑。
优化Cre-loxP 重组体系，包括传递Cre重组酶，优化重组载体构建等方面。
3. 运用Cre-loxP重组技术敲除绒山羊标记基因选定目标基因进行敲除后，将构建好的质粒ploxP -neomycin-loxP导入到绒山羊胚胎细胞中，然后通过Cre酶介导基因重组，实现对目标基因的敲除。
随后利用PCR、Western印迹和T7E1等技术验证敲除效果。
三、预期结果本研究的预期结果包括：1. 成功构建Cre-loxP重组体系，实现对绒山羊基因的敲除。
2. 验证基因敲除效果，明确目标基因在绒山羊生长发育、健康状态等方面的影响。
3. 探究Cre-loxP重组体系的优缺点，为之后的研究提供参考。
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统
条件性基因敲除的基本原理Cre／loxP重组系统条件性基因敲除的基本原理 Cre ／ loxP 重组系统条件性基因敲除主要是通过Cre／10xP或者Ftp／FRT重组系统来实现的。
这两个系统都是位点特异性重组酶系统，已发展成为在体内、外进行遗传操作的有力工具。
这两个系统的应用，可以使靶基因的表达或缺失发生在试验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官。
此外，若与控制Cre或Flp表达的其他诱导系统相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
1．Cre／loxP系统的原理Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。
该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
这段34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X―over in P1)。
②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。
任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
Cre／loxP系统的作用机制2．Cre／loxP系统优点Cre／10xP系统之所以在基因敲除中获得了非常广泛的应用，是由该系统的诸多优点决定的：①Cre重组酶与具有loxP位点的DNA片断形成复合物后，可以提供足够的能量引发之后的DNA重组过程，因此该系统不需要细胞或者生物体提供其他的辅助因子；②loxP位点是一段较短的DNA序列，因此非常容易合成；③Cre重组酶是一种比较稳定的蛋白质，因此可以在生物体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用；④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一点。
cre_loxp基因敲除系统解读
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599, G525R)
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
电穿孔或是显微注射方法将构 建好的打靶载体导入ES细胞
（3）阳性克隆筛选
随机整合
定点整合 没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
基因敲除 Knock Out
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES，成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物 细胞中发现并实现了同源重组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体（sisபைடு நூலகம்er chromatin) 之间或
Cre—loxp系统的构建及在牙釉质发育中的应用
Cre—loxp系统的构建及在牙釉质发育中的应用Cre-loxp系统是近年来广泛应用在各领域的重组酶系统。
该系统由组织特异性重组酶cre和loxp位点组成。
可以通过对特定的DNA序列进行准确的切割及连接，达到在基因水平上对生物体进行定向遗传改造的目的。
牙釉质的发育离不开各种转录因子的作用，利用该系统对各转录因子的缺失或突变的研究，探讨特定时间、特定部位目的基因的异常改变对牙釉质发育的影响。
[Abstract] Cre-loxp system is recombinant enzyme systems，widely used in various fields in recent years.The system consists of a tissue-specific recombinase cre and loxp site components.Through specific DNA sequences accurate cutting and connection，at the genetic level to achieve the purpose of orienting genetically engineered organisms.Enamel development is inseparable from the role of various transcription factors，utilization of the system for each missing or mutated transcription factors，investigate the effect of abnormal changes in a particular time parts of the gene of enamel development.[Key words] Cre-loxp system；Loxp site；Recombinase cre；Transcription factors随着国民经济的日益发展，人们对口腔保健的意识也越来越强。
creloxp基因敲除系统
Loxp site
34bp反向重复序列
Flp/Frt重组系统
P1噬菌体
（1）重组方式
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
基因敲除机理 （续）
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001).
（3）阳性克隆筛选
随机整合 定点整合 没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
小鼠的遗传背 景取决于ES和 囊胚细胞
（5）嵌合体小鼠
（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种 Loxp2小鼠品系建立完成
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
MerCreMer融合蛋白
Cre-loxpsystem
Cre-LoxP重组酶系统目录Cre重组酶和LoxP序列Cre-LoxP系统的特性Cre-LoxP重组酶系统在基因打靶中的应用策略编辑本段Cre重组酶和LoxP序列Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。
Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超基因家族。
Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp（EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。
是一种位点特异性重组酶，能介导两个LoxP位点（序列）之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
LoxP（locus of X-over P1）序列：来源于P1噬菌体，是有两个13bp 反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。
Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。
其序列如下：5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3'3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'编辑本段Cre-LoxP系统的特性Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分成三种情况：1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；2、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；3、如果两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。
另外，Cre不仅可以识别LoxP的2个13bp的反向重复序列和8bp的间隔区域，而且当一个13bp的反向重复序列或者8bp的间隔区发生改变时仍能识别并发生重组。
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C r e/L o x P系统介导的位点特异性重组技术陈双喜 许守明(河南大学生命科学学院生物工程研究所,河南开封 475004)摘 要:C r e/L o x P系统是一种对转入基因进行定点操作的基因重组系统,在遗传操作中具有重要作用。
该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定D N A片断删除。
关键词:C r e/L o x P;定点整合;特异性重组中图分类号 Q813.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)15-27-02S i t e-s p e c i f i c R e c o m b i n a t i o n T e c h n i q u e Me d i a t e d b y C r e/L o x PS y s t e mC h e nS h u a n g x i e t a l. (I n s t i t u t e o f B i o e n g i n e e r i n g,C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e,H e n a n U n i v e r s i t y,K a i f e n g475004,C h i n a) A b s t r a c t:C r e/L o x Ps y s t e mi s i m p o r t a n t t o g e n e t i c o p e r a t i o n,u s e d f o r s i t e-s p e c i f i c r e c o m b i n a t i o n o f t r a n s f e r r e d g e n e.Wi t h t h e s y s t e m,e x o g e n o u s g e n e i s i n t e g r a t e d t o s p e c i f i c s i t e o f c h r o m o s o m e,o r s p e c i f i cD N Af r a g m e n t i s d e l e t e d.K e y w o r d s:C r e/L o x P;s i t e-s p e c i f i c i n t e g r a t i o n;s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o n 位点特异性重组技术是通过对D N A的特定序列进行准确切割和重新连接,从而在基因或染色体水平上对生物进行遗传改造的一种技术。
该系统有很多种,目前已得到应用的有C r e/L o x P系统、F L P-F R T系统、R-R S系统以及I-S c e I系统,但是应用最多的还是C r e/L o x P系统。
该系统能够进行定点基因插入、控制转入基因的拷贝数、可进行组织特异性表达、按照人们的意愿定时对目的基因进行表达启动与关闭。
1 C r e/L o x P重组系统的发现噬菌体P1在大肠杆菌内处于溶源状态时是以单拷贝形式整合在宿主菌基因组上的,它编码一个位点特异性重组系统。
这个系统包合一个L o x P位点和一个称为C r e的基因,该系统负责将噬菌体整合到或脱离宿主菌基因组。
其另一个主要作用是降低基因组内外源基因的拷贝数,直至一个拷贝为止;同时还有助于在感染组织中使P1D N A 环化,以及D N A复制后形成的二聚体的分离,保证噬菌体子代在细胞分裂时只有一个P1的存在,但具体机制不详。
C r e重组酶以高效方式进行组织特异性、位点特异性和可遗传方式对基因组D N A进行重组。
C r e和F L P(也是一种重组酶,其作用的位点是F R T)相似,不含有核定位信号,可能是通过融合或有丝分裂时核膜破裂进入核内,所重组的D N A长度一般为20k b,有时可达70k b以上。
目前已经得到了C r e蛋白,它在真核细胞内也可以发挥良好的D N A重组作用。
2 C r e重组酶结构C r e重组酶是整合酶家族的一员,它是从噬菌体P1中提取出来的。
整合酶识别特定的核苷酸序列,通过D N A 和蛋白质的瞬间结合,发挥其重组作用。
依据序列同源性,来自细菌和酵母的重组酶可以分为整合酶家族和解离酶-转化酶家族。
这两个家族采用两个截然不同的重组机制,但均是通过酪氨酸残基与靶D N A共价结合,借助一系列标定剪切位点裂解D N A底物。
大于60个成员的重组酶家族成员间除4个用于催化反应的严格保守的残基外,其余的序列同源性较差。
这种非同源性反映了重组酶在遗传重组时功能和形式的多样性。
C r e活性区包含保守的催化三联体残基,A r g173、H i s289和A r g292,还有保守的亲核T y r324和T r p315。
其中之一的T r p315常被H i s取代,但是H i s能够控制形成与T r p相类似的氢键,这种功能特性是保守的。
C r e是一个38k D的蛋白质,调节L o x P位点的分子内(切除、反接)和分子间(整合)的特异性重组。
C r e的作用与酵母中的F L P重组酶作用相似,但又有所不同。
在体外状态下,无辅助因子、拓扑异构酶和D N A不复制时也可发挥其生理作用。
C r e重组酶折叠成两个不同的区域,并通过一个较短的分隔区相连。
N末端由20～120个氨基酸组成5个α螺旋,C、D、E形成反平行束;A、B螺旋垂直于三个反平行束。
A、E区负责4聚体的形成;B、D区与L o x PD N A大沟半个回纹结构相连接;C末端N螺旋远离其他螺旋,有助于C r e亚基间接触。
C r e的C端结构与λ和H P1整合酶的催化区较为相似,但2个与L o x P结合的C r e分子间C 末端构象出现较大的偏差,这种偏差说明只有一个亚基具有剪切活性。
3 C r e重组酶所作用的序列C r e所作用的序列L o x P位点34b p,包括被8b p间隔的两个13b p反向重复,每个反向重复及其临近的4b p构成一个C r e蛋白的结合区,如图1所示。
一个C r e分子结合一个重复序列或者二聚体结合两个反向重复序列,链间的交换可发生在间隔区的8b p之间,一旦C r e重组酶介导的D N A剪切作用发生便产生一作者简介:陈双喜(1973-),男,河南开封人,副教授,从事生物化工方向的研究和教学工作。
收稿日期:2009-06-18个突出的5'末端。
该间隔区是非对称性的,这种非对称性决定了L o x P 位点具有方向性,从而最终决定了重组的拓扑学结果:非连锁分子间的重组能够形成共整合分子;同一分子内同向的两个L o x P 位点间的D N A 会由于重组的发生而被切除,并保留后边一个L o x P 位点,而反向重复L o x P 位点间的重组则导致D N A 倒位。
图1 C r e 蛋白结合区4 C r e /L o x P 系统的应用在基因组中L o x P 序列自然发生的概率极低,其它相关序列引起的重组活性可以忽略不计。
因此在应用该系统时就需要首先向目的系统中引入L o x P 序列,然后通过一定的途径激活C r e 重组酶的活性,以实现在L o x P 位点的特异整合或重组。
基于这一原理,C r e /L o x P 系统已在发育生物学、遗传学、基因工程及分子生物学领域得到了有效的利用。
4.1 外源基因在宿主染色体上的定点整合 当外源基因随机整合到宿主染色体上时,由于染色体的位置效应或是基因的拷贝数不同,会造成外源基因表达水平存在一定的差异,并且可能导致宿主本身所含基因的失活。
在高等真核生物中,外源基因在染色体上整合时,随机整合的机率要高于同源重组102～105倍。
虽然在苔藓、酵母等低等真核生物中基因打靶比较有效,而在高等的动、植物中却并非如此。
不过若引入L o x P 位点到这些生物的基因组中,C r e /L o x P 就成为了一种较为有效的基因靶位操作体系。
该技术利用含单个L o x P 序列的环状质粒与同样含L o x P 序列的基因或染色体间精确的重组,就可以将外源基因整合到L o x P 位点上,它既可以提高外源基因的整合效率又可以提高整合位置的准确性,而且可以利用这一定位整合的技术避免宿主自身基因的失活。
研究表明:C r e /L o x P 系统可以在酵母、哺乳动物、高等植物等细胞中实现特定D N A 片段的定点整合。
4.2 特定基因的删除 在分子生物学研究中,有时需要控制特定组织里的特定基因在特定时间内的表达或是将该基因删除,从而研究这一基因在发育或病原感染过程中的功能。
这一方法的应用一般分为两步:(1)通过置换型载体进行同源重组,向基因组靶位点引人选择标记基因,并在其两侧引入两个同向排列的L o x P 位点;(2)通过C r e 重组酶介导的L o x P 位点特异重组,切除位于两个L o x P 位点间的所有序列从而达到靶位基因不同的修饰。
长期以来人们一直担心转基因产品的安全性问题,其中最主要的是转基因产品中带有的一些选择标记基因,可能会影响人类健康或导致环境的基因污染。
由于这些选择标记基因在转化完成之后就不再起作用,它不但会妨碍在下一轮转化遗传转化中应用该选择标记基因,而且还可能会影响其邻近基因的表达,所以这就有必要将其除去。
如果在进行外源基因转化或使某个基因失活时将选择标记基因两侧装上两个同向排列的L o x P 序列,就可以在基因转化成功之后,通过诱导重组酶表达,促使两个l o x P 位点间和选择标记基因被删除。
4.3 C r e /L o x P 系统在诱变技术中的应用 人们将C r e /L o x P 系统与转座子插入诱变技术相结合,发展出了新一代的插入诱变座子系统。
如大肠杆菌中M i n i -M u 型转座子M u d L o x 及M i n i -T n 3型大肠杆菌酵母穿梭诱变转座子m T n 3-L a c 2/L E U 2。
这些转座子内装有一个L o x P 位点,转座子中间体共整合体的解离借助C r e 蛋白介导的两个L o x P 位点之间的重组来完成,从而提高了诱变效率。
当转座子序列引入到酵母染色体的目的基因内部后,通过C r e 蛋白介导两个L o x P 位点间的重组,使得转座子内部的选择标记基因和r e s 解离位点等元件都被切离下来,只留下约270b p 的一段序列,内含一个L o x P 位点和流感病毒血凝素表位(H A )D N A 序列。
若此时H A 表位的密码子阅读框与目的基因的阅读框相同,该基因的蛋白产物会含有H A 表位,可用抗H A 表位的抗体检测出来.这种技术就称为表位标签技术(e p i t o p e -t a g g i n g t e c h n i q u e )。