第1节位点特异性重组
分子生物学：重组和转座
转座子的特点
转座子是不必借助同源序列就可以移动的片断,即转座作用与供体 和受体的序列无关;
原核生物和真核生物都有转座子; 转座序列可沿染色体移动,甚至在不同染色体间跳跃(跳跃基因) 转座子对基因组而言是一个不稳定因素，它可导致宿主序列删除、
倒位或易位，并且其在基因组中成为“可移动的同源区”。位于 不同位点的两个拷贝转座子之间可以发生交互重组，从而造成基 因组不同形式的重排。 有些转座子与基因组的关系犹如寄生，它们的功能只是为了自身 的扩增与繁衍，因此被称为是自私的DNA。
转座中涉及的机制依赖于DNA 链的切割和重接，因此 （branch migration）
Cro蛋白抑制C I基因的转录，它占优势噬菌体即进入繁殖周期，并导致宿主细胞裂解。
与重组过程联系起来。 二者含有共同的核心序列15bp（O区）。
DNA转座子上携带作为重组位点的DNA序列，以及参与重组的蛋白质的基因（转座酶基因）。 同源重组 (homologous recombination )或普遍性重组（generalized recombination ）
复制式转座 如 Tn3
非复制式转座 如 Tn10
类病毒反转录转座子/反转录病毒
带有反向终端重复序列.反向终端 重复序列嵌入在较长的正向排列的 重复序列(长末端重复序列, long terminal repeats LTR)中；
带有靶位点重复序列； 类病毒反转录转座子编码两种移位所需的蛋白：转座酶和反转录酶。 类病毒反转录转座子和反转录病毒的区别在于：反转录病毒的基因
径的歧化做好准备。
位点特异性重组与同源重组的区别
带有2个基因ORF1和ORF2；
同源重组 (homologous recombination )或普遍性重组（generalized recombination ）
第七章遗传重组
图 23－8 Holiday 重组模型。
b
12
B 3’ 5’ 5’ 3’
3’ 5’ 5’ 3’
3’ 5’ 5’ 3’ 移动联会 3’ 5’
5’ 3’ 交叉连接
3’ 5’ 5’ 3 链交叉
B 3’ 5’ 5 3’
点移动
(8)
A
B
两臂旋转
b a
(9)
A
B
b a
(10)
A
B
A B
b a
(11) A
B
a
b
24
4、RecA蛋白的作用方式
RecA蛋白首先与单链DNA结合（约每分子可结合５个核苷 酸），形成一条DNA－蛋白质细丝（需消耗ATP），RecA 蛋白即被活化； 活化的RecA将双螺旋解旋和分离，同时试图将其结合的单 链与被解旋区域退火，如此继续，直到找到互补顺序。 一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供应的能量就会继 续驱使配对反应趋于完成，其方向是５’→３’（单链部 分）。 新的杂交双链形成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。
A
B
a
b
b a
A
b
a
B
A
b
a
B
图 23－8 Holiday 重组模型。
7）Holliday中间体拆分 （二次切断），可以有 两种情况： Holliday中间体二次切 割发生在原断裂的两条 单链上，称为非交换型 重组，双链中存在异源 区域(图10, 11, 12)； Holliday中间体二次切 割发生在另外两条单链 上，称为交换型重组 (图10’, 11’, 12’)。
25
26
RecA蛋白促进的各类DNA分子间的联会
参与联会的DNA分子可以 是多种不同的形态分子 的组合； 但无论那种组合，其中 一个分子是单链分子， 或者有足够长度的单链 区。
分子生物学第7章 DNA的重组与转座
7.2.1 λ phage DNA的整合与切除 1、实现机制：
均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组
2、特定位点-----附着位点（attachment site att）
◘ 整合过程需要λ整合酶 （integrase Int）（λ编码）
和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用
◘ 整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’）
溶菌周期 （lysis）
溶源性细菌 原噬菌体 (lysogen)
4、整合分子机制
5’
5’
b
3’
酶切
(8)
A
B
两臂旋转
b a
(9)
A
B
(3) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(4) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(5) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(6) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(7)
A
B 3’
5’
b
5’
b
3’
游离端移动联会
B 3’
(10)
A
5’
B
5’
b 3’ 游离端交叉连接
一、位点特异性重组（ site-specific recombination） 1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间 的重组
噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组
2、特征：
在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接---产生精确的DNA 重排 都具有整合作用的两个基本特征
最新华中农业大学生物化学本科试题库第14章DNA的复制、修复与重组
第14章 DNA的复制、修复与重组单元自测题（一）名词解释1、复制2、半保留复制3、前导链与滞后链4、半不连续复制5、冈崎片段6、光复活7、切除修复8、重组修复9、DNA突变 10、同源重组 11、特异位点重组 12、转座因子（二）填空题1、DNA复制时，前导链的合成是的，复制方向与复制叉移动的方向，后随链的合成是，复制方向与复制叉移动的方向。
2、在真核细胞的DNA切除修复过程中，受损伤的碱基可由和切除，并由和共同作用将缺失的碱基补上。
3、在线粒体中的环状基因组是通过合成方式复制。
滚筒式复制的特点是由。
4、DNA复制和RNA的合成都需要酶，在DNA复制中该酶的作用。
5、DNA聚合酶Ⅰ是一个多功能酶，其主要的功能是，和作用。
6、DNA聚合酶Ⅲ的活性使之具有功能，极大地提高了DNA复制的保真度。
7、染色体中参与复制的活性区呈Y型结构，称为。
8、在DNA复制和修复过程中修补DNA螺旋上缺口的酶称为。
9、如果DNA聚合酶出现错误，会产生一对错配碱基，这种错误可以被一个通过甲基化作用来区别新链和旧链的特别系统进行校正。
10、可被看成一种可形成暂时单链缺口（Ⅰ型）或暂时双链缺口（Ⅱ型）的可逆核酸酶。
11、在大肠杆菌中发现了种DNA聚合酶。
DNA修复时需要DNA聚合酶。
12、在DNA修复过程中，需要第二种酶，，作用是将DNA中相邻的碱基起来。
DNA聚合酶具有外切核酸酶的活性。
有两种外切核酸酶活性，它们分别从和降解DNA。
DNA聚合酶只有外切核酸酶活性。
13、途径可以切去任何造成DNA双螺旋大片段改变的DNA损伤。
14、在中，基因交换发生在同源DNA序列间，最常见是发生在同一染色体的两个拷贝间。
15、在交换区域，一个DNA分子的一条链与另一个DNA分子的一条链相互配对，在两个螺旋间形成一个。
16、大肠杆菌的染色体配对需要；它与单链DNA结合并使同源双链DNA与之配对。
17、一般性重组的主要中间体是，也用它的发现者命名为。
分子生学技术-第七章 DNA的重组与转座
2、复合式转座子
它是一类较复杂的转座子，由两个重复序列 夹着一个或多个结构基因组成。除了含有转位相 关的功能外，还带有一些其他基因，如抗药性基 因、抗重金属离子基因等。 它们都具有末端反向重复序列、可编码基因 和插入位点的正向重复序列
TnA转座子：
结构较复杂，长度约5000bp。两端没 有IS结构，仅含有两个末端反向重复序列， 一般约38bp。内部通常含有转位相关的基 因和抗药性基因等，插入位点约5bp。
②果蝇中的转座子—P转座子 两端有31bp的反向重复序列,靶位点产生8bp 的正向重复序列,有四个外显子和三个内含子， 在体细胞中,只有前两个内含子被切除,产生一个 转座阻遏蛋白;在卵细胞中,三个内含子全部被切 除,可产生转座酶,导致P转座子转座和后代不育。
四、转座的遗传学效应
a、转座引起插入突变 各种IS、Tn转座子都可引起突变 b、转座产生新的基因 转座上存在一些抗药性基因或抗重金属基因 等
一、霍利迪结构(Holliday Structure)
霍利迪结构：它是DNA重组过程中的一个中间体， 重组时两个DNA双链体以四股DNA在连结点形成的十字 形DNA分子构象。
异源双链 (Hetero duplex)：指在重组部位，每条双 链中均有一段DNA链来自另一个双链中的相对链。
分支迁移（Branch migration）：一旦两个重组的 DNA分子形成霍利迪结构，交叉连接点很容易像拉链一 样移动，从而扩大异源双链体区域，这一过程叫分支迁 移。
2、Rec BCD核酸酶 Rec BCD蛋白具有DNA解螺旋酶、核 酸内切酶和外切酶的活性。它可以帮助有游 离末端的DNA形成单链DNA片段，从而有 利于RecA 蛋白作用。 它识别并切割Chi序列：5'GCTGGTGG-3'
位点特异性重组解析
位点特异性重组我们可以看到，同源重组一般都在染色体内仍按DNA序列的原来排列次序。
但是在所谓位点特异性重组（site-specific recombination）中，DNA节段的相对位置发生了移动，从而得到不同的结果─DNA序列发生重排。
位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性（虽然亦可有很短的同源序列），而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。
这些特异的酶能催化DNA链的断裂和重新连接，它们能发动位点特异性重组作用.而在同源重组中，DNA链的切断完全是随机的，结果暴露出一些能与RecA这样的蛋白质相结合的顺序，从而发动交叉重组。
λ噬菌体DNA能通过重组作用整合进E.coli染色体的特异位点，成为前病毒（provirus，或称前噬菌体，prophage）。
λ的整合作用有两个特点：①这种交换是可逆的，原先存在的DNA顺序全部被保存下来，并无丢失；②噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的同源序列，重组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸。
这两个特点也就是位点特异性重组的共同特点。
一、λ噬菌体的整合（integration）λ噬菌体编码λ整合酶（integrase）。
这个酶能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。
这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组，将两个环状DNA分子变成一个大环。
在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。
这种作用可用体外模型来进行实验。
用四种成份混合起来组成反应系统：纯的整合酶；来自 E.coli的一种辅助蛋白，称为整合作用宿主因子（IHF，integration host factor）；镁离子；和含有噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点（称为attP和attB，att源自attachment）的DNA片段。
对于这个DNA片段，一个简单的制备方法就是人工构建含attP和attB两者质粒。
当整合反应发生时，即在attP和attB处发生交叉重组，产生两个较小的环状DNA。
分子生物学—同源重组、位点专一性重组、转座
分⼦⽣物学—同源重组、位点专⼀性重组、转座同源重组遗传交换、染⾊体上基因重排、断裂DNA的修复（1）同源重组的形式常发⽣在同源染⾊体之间（分⼦间重组）也可发⽣在同⼀DNA分⼦内（分⼦内重组）（2）Holliday 模型解释同源重组的⼀个经典模型基于重组过程中有⼗字形的中间产物（3）RecBCD重组途径存于E. coli中，需要RecBCD蛋⽩（RecBCD protein，recB、recC、recD基因的产物）参与DNA损伤造成的双链断裂以及外源DNA线性分⼦的DNA断端。
RecBCD是⼀种具多功能的酶，依赖于DNA的ATPase(⽔解ATP, 为DNA的解螺旋提供能量)；DNA helicase; DNA nuclease,可作⽤于单链或双链DNA, 切割χ位点（GCTGGTGG）χ(chi): crossover hotspot instigator RecBCD的切点与底物的序列有关，可在χ位点3’端4 ~ 6 ntRecA ：38 kD 的蛋⽩质，具多种功能，在重组中促进同源DNA单链的交换（主要是⼀单链与⼀双链中的同源单链交换）；交换过程需ATP。
RuvA和RuvB ：RuvA和RuvB均具DNA helicase活性，RuvB还有ATPase活性；RuvA特异性识别并结合到Holliday junction，并促使RuvB蛋⽩结合到这⼀位点；RuvB⽔解ATP，提供能量，促使分⽀迁移RuvC ：解开Holliday junction的核酸内切酶，特异地与Holliday junction结合，在特异位点切开Holliday junction。
RuvC是⼆聚体，有2个活性位点，能切开Holliday junction的两条链，切割位点有特异的序列，必须等branch migration 到达特异序列后，RuvC才能起作⽤，以何种⽅式解开Holliday junction取决于RuvC切割位点在两对同源单链上的频率。
位点特异性重组的一些基本概念
位点特异性重组，与同源重组不同的地方是，虽然它也需要在重组位点存在同源的核苷酸序列，但是，同源的核苷酸序列并不长。
噬菌体phage是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。
✧而大肠杆菌染色体本来就有专门整合位点，位于gal 操纵子和bio操纵子之间，被称为附着位点名为attB。
attB只有30 bp长，中央含有15 bp的保守区域，重组反应就发生在该区域，该区域通常被称为BOB'，其中B 和B' 分别表示细菌DNA在这段保守序列两侧的臂。
✧噬菌体的重组位点称为attP，其结构较为复杂，它的中央也含有与attB一样的15 bp保守序列，以POP‘表示，P和P’分别表示两侧的臂。
然而，attP两翼的序列非常重要，因为它们含有一系列参与重组反应的蛋白质结合位点。
P臂长150 bp，P'臂长90 bp。
✧λ噬菌体整合需要1种自身编码的蛋白质—整合酶（Int）和1个宿主蛋白—整合宿主因子（IHF）。
两种蛋白质结合在P臂和P'上，形成一种复合物，使attP和attB 的15 bp保守序列能正确地排列。
Int催化了重组过程的所有反应，包括一段7 bp长的分叉迁移。
具有鞭毛相变换的特征,这与其毒力和逃避宿主免疫监视有关。
图中，H1和H2是其鞭毛蛋白抗原，rH1为H1的阻遏蛋白基因。
H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。
H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。
这就实现了鞭毛相转变在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(RSS)。
此重排的重组酶基因别产生蛋白质RAG1和RAG2。
载体：（1）能够自我复制，并带动外源基因一起复制（2）具有合适的限制性酶切位点（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）细胞内稳定性高转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第六章位点特异性重 组和DNA转座
P319
Introduction
1.保守性位点特异性重组（conservative site-specific recombination, CSSR）
2.转座重组（transpositional recombination）
P320
P320
1.保守性位点特异性 重组（CSSR）
2.2.3 聚腺苷酸(poly-A)反转录转座子
P340
2.2转座因子的类型
2.2.1 DNA转座子 2.2.1.1自主转座子（autonomous transposon） 2.2.1.2非自主转座子（nonautonomous
transposon）
2.2转座因子的类型
2.2.1.1 DNA自主转座子 ① 反向重复序列（具有转座酶识别序列） ② 转座酶基因
1.保守性位点特异性重组（CSSR） P321
1.1重组位点
During λ intergration, recombination always occurs at exactly the same nucleotide sequences within the two recombination sites, one on the phage DNA and the other on the bacterial DNA.
P341
④DNA聚合酶和DNA连接酶修复缺口
2.3DNA转座的剪切-粘贴机制
①转座酶识别并聚集转座子两端的反向重复序列，形 成转座体
②将DNA转座子从原始位置切除
③DNA单链交换，即转座子的3′-OH与靶DNA的5′-P 相连
④DNA聚合酶和DNA连接酶修复缺口
总结
1.转座因子或转座子 2.转座因子的类型 3.DNA转座的剪切-粘贴机制
1.保守性位点特异性重组（CSSR） P321
1.1重组位点
①重组酶识别序列
对称分布
②交换区（crossover region）
①
② ①
①
② ①
重组位 点
重组位 点
1.保守性位点特异性重组（CSSR） P321
1.2重组结果 ①DNA片段的插入
1.保守性位点特异性重组（CSSR） P321
1.2重组结果 ②DNA片段的缺失
②另外一个断裂DNA的-OH攻击重组酶与DNA磷酸二酯键， 重新形成DNA的磷酸二酯键，丝氨酸重组酶释放DNA
Байду номын сангаас
1.3.1.3丝氨酸重组酶特异位点重组功能
P322
①丝氨酸重组酶的4个亚基分别切断2个DNA分子的4 条链，并且重组酶通过磷酸二酯键与DNA断裂端相 连
1.3.1.3丝氨酸重组酶特异位点重组功能
1.保守性位点特异性重组（CSSR）
1.3.1丝氨酸重组酶 1.3.1.1结构
R2
R1
R3 R4
Li W, et al. Science. 2005, 309(5738):1210-1215.
1.3.1丝氨酸重组酶
P322
1.3.1.2功能
①重组酶丝氨酸残基的-OH攻击交换区特定磷酸二酯键，重 组酶通过磷酸二酯键与DNA断裂端相连
P322
③DNA链上-OH攻击重组酶-DNA磷酸二酯键，重新 形成DNA磷酸二酯，释放重组酶，完成重组
1.3.1.3丝氨酸重组酶特异位点重组功 能
①丝氨酸重组酶的4个亚基分别切断2个DNA分 子的4条链，并且重组酶通过磷酸二酯键与 DNA断裂端相连
②重组酶二聚体亚基旋转进行DNA片段交换
③DNA链上-OH攻击重组酶-DNA磷酸二酯键， 重新形成DNA磷酸二酯，释放重组酶，完成 重组
2.3DNA转座的剪切-粘贴机制
P341
①转座酶识别并聚集转座子两端的反向重复序列，形 成转座体
2.3DNA转座的剪切-粘贴机制
P341
②将DNA转座子从原始位置切除
2.3DNA转座的剪切-粘贴机制
P341
③DNA单链交换，即转座子的3′-OH与靶DNA的5′-P 相连
1 2
2.3DNA转座的剪切-粘贴机制
2.2转座因子的类型
2.2.1.2 DNA非自主转座子 ① 反向重复序列（具有转座酶识别序列）
2.2转座因子的类型
P340
2.2.1 DNA转座子
2.2.1.1自主转座子 ① 反向重复序列（具有转座酶识别序列） ② 转座酶基因
2.2.1.2非自主转座子 ① 反向重复序列（具有转座酶识别序列）
2.2转座因子的类型
P340
2.2.2 LTR 反转录转座子
①两端有LTR (long terminal repeat) ②LTR中含有反向末端重复序列 ③转座酶基因和反转录酶基因
2.2转座因子的类型
P341
2.2.3 聚腺苷酸(poly-A)反转录转座子
①5′-UTR: untranslated region
②3′-UTR (聚腺苷酸序列的A-T碱基对)
总结
1.重组位点 2.重组结果 3.丝氨酸重组酶
2.转座
2.转座
P337
2.1转座因子（transposable element）或转 座子（transposon）
从DNA上的一个地方移位到另外一个地 方的遗传因子。
2.2转座因子的类型
P339
2.2.1 DNA转座子
2.2.2 LTR (long terminal repeat) 反转录转座 子
P322
②重组酶二聚体亚基旋转进行DNA片段交换
1.3.1.3丝氨酸重组酶特异位点重组功能
P322
②重组酶二聚体亚基旋转进行DNA片段交换
R2 R1
R2 R3
R4
R3
R4
R1
Li W, et al. Science. 2005, 309(5738): 1210-1215.
1.3.1.3丝氨酸重组酶特异位点重组功能
作业
1.简述丝氨酸重组酶促使位 点特异性重组的机制
2.简述DNA转座的剪切-粘贴 机制
③ORF1: 编码RNA结合蛋白
open reading frame
④ORF2: 编码的蛋白质同时具有反转录酶和核酸内切酶功能
P341
2.3DNA转座的剪切-粘贴机制
①转座酶识别并聚集转座子两端的反向重复序列，形 成转座体 ②将DNA转座子从原始位置切除 ③DNA单链交换，即转座子的3′-OH与靶DNA的5′-P 相连 ④DNA聚合酶和DNA连接酶修复缺口
1.保守性位点特异性重组（CSSR） P321
1.2重组结果 ③DNA片段的倒位
1.保守性位点特异性重组（CSSR）
1.2重组结果 ①DNA片段的插入 ②DNA片段的缺失 ③DNA片段的倒位
1.保守性位点特异性重组（CSSR） P322
1.3重组酶 1.3.1丝氨酸重组酶 1.3.2酪氨酸重组酶