2010DNA重组与克隆讲授

接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation)
转导作用 (transduction)
#位点特异的重组(site-specific recombination)
#转 座 (transposition)
异常重组
6.1、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组。
溶菌周期 （lysis）
溶源性细菌 (lysogen)
原噬菌体
4、整合分子机制
◘ 核心序列O全长15bp，富含A-T
◘ 发生在O内的重组交换位点相距 7bp
◘ attP位点的负超螺旋为重组所必须---加强了Int和IHF的亲和力 -----高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构 ◘ 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同) ◘ Int结合 ----核心序列的反向位点（切割位置） ----结合在att臂上（臂与核心区靠近）
沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变 DNA 启动序列 启动序列 I H1
hin
H2
H2鞭毛素
Hin重组酶 阻遏蛋白 H2 I H1
hin
转位片段
H1鞭毛素
7.3、转座成分概述
1、转座子(元)或转座元件(transposon or transposable element): 基因组上不必借助于同源序列就可以移动的DNA片段，它们可以直 接从基因组的一个位点移到另一个位点（供体和受体） 转座（transposition）：转座元的转移过程（不十分确切） 2、发现和发展 ◘ 1914 A. Emerson 1936 Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉层花斑突变 ◘ 1947 冷泉港实验室（美） Barbara McClintock
• Holliday 模型提出了同源重组的基本模式， 但对于基因重组具体细节，异源双链的形 成细节不清楚。 • 在Holliday基础上提出了单链断裂模型和双 链断裂模型，两个模型的区别在于解释重 组期间DNA的修复的具体过程不一样。有 供体受体之分。（受体：发生链断裂的分 子P138-139）
细菌的基因转移与重组
噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组
2、特征：
◘ 在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接 ----产生精确的DNA重排 ◘ 都具有整合作用的两个基本特征 a、 典型的保守性重组---交换是相互的和保存原先的DNA b、 发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的专一性核苷酸上
二、λphage的整合与切除（溶原和裂解状态） 1、实现机制：
图 15-3 转导作用
转导(transduction)
转导：当病毒从被感染的供体细胞释放出来，再次
感染另一受体细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之 间的DNA转移及基因重组即为转导作用
*转染(transfection)
转染是转化的一种特殊形式。 由transformation （转化）和 infection（感染）两词构成。 原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导 入受体细胞的过程。 通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致 宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染。 将任何类型DNA转移至动物细胞内的过程均可叫 转染。
细菌的细胞融合
• 由于细胞质膜融合导致的基因转移和重组。 • （原生质体融合）
细菌的同源重组的酶学机制
1、RecBCD（外切核酸酶Ⅴ）和 Chi 位点
具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、 核酸外切酶活性、 序列特异性的单链内切酶活性 单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生 具有游离末端的单链 －－－RecA的作用位点 RecBCD有固定切割位点´
3´ 5´ 5´ 3´
DNA 连接酶
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´
Holiday中间体
目录
片段重组体 （见模型图左边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组
体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本
DNA。 拼接重组体（见模型图右边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源
体外切段连接点以拆分重组体
◘ E.coli 重组的各阶段 （损伤修复）
损伤DNA复 制产生缺口
RecA链交换
第二次链交换
DNApol通过DNA 合成填满缺口 RuvA,B分枝迁移
RuvC切割 Holliday连接点
真核生物同源重组机制自学
7.2、位点专一性重组（ site-specific recombination） 1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间 的重组（包括一些基因表达调节、发育过程中DNA重排）
F 因子编码表面排斥蛋白、切口酶、解螺旋酶、DNA转移通道蛋白等、
F 因子可以与细菌染色体发生交叉连接而重组整合入细菌染色体
二、转化作用（transformation)
通过自动获取或人为地供给外源DNA，
使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
分离
DNA
RH 型 肺炎双球菌
感受态细胞 高浓度钙可以诱导感受态
SH 型 肺炎双球菌
例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。
三、转导作用（transduction)
当病毒从被感染的细胞（供体）
释放出来，再次感染另一细胞（受体） 时，发生在供体细胞与受体细胞之间 的DNA转移及基因重组。
细菌
噬菌 体
感 染
溶 菌
感 染
重 组
转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞 之间的DNA转移及基因重组
是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和
再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单
链或双链片段的交换。
以E.coli的同源重组为例，了解同源重组 机制的Holliday模型。
Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤
①两个同源染色体DNA排列整齐
②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链 连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA（立体异构） ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体 DNA，分别为：
（但其靶 DNA 必须有缺口－－结合DNA）
RecA引发链侵入模型
RecA 被置换连
入侵单链
RecA引起的链交 换和Holliday结构 的生成
（2）RecA 蛋白催化双链和单链 DNA 的反应阶段 a、 联会前阶段（缓慢） RecA 与单链结合
b、 单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子
例（二）细菌的特异位点重组
沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变
hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在
Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有 两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向
时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1
不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。
P197
第 六 章
DNA重组与克隆
• DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新 组合称遗传重组或或基因重排。 • 重组产物称为重组体。 • 基因重组主要发生在减数分裂时同源染色 体之间的交换。（形式多样） • 重组与进化关系密切，增加群体的遗传多 样性，利于突变的优化组合。
DNA重组
#同源重组 (homologous recombination)
Holliday（5‘侵入） c、 从双螺旋结构中缓慢置换一条链产生一段长的异源双链 DNA
反应结束时，RecA 结合到双链上
◘ 其中—单链同化有固定的方向 入侵单链进入的方向是5’－3‘， 双链 DNA 的互补链是3’ －5‘
◘ RecBCD 和 RecA 的共同作用
RecBCD产生游离单链---
RECA 因子接到重组反应
3、原核同源重组的其它蛋白 需要 E.coli 中三个基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的产物
a、 RuvA 识别 Holliday 结构的连接点
b、 RuvB 为分枝迁移提供动力（ATPase 10～20bp/s） c、 RuvC 核酸内切酶---专一性识别 Holliday 结构的连接点
• 低等生物也可以以转化、转导、结合等多 种方式实现细胞间的基因转移。 • 具体方式：接合、转化、转导、细胞融合。 • 外源基因的命运：降解、暂时保留、与内 源基因置换、整合。
一、接合作用（conjugation)
当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接
触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至 另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。
5´
5´3´ 3´
3´ 5´ 3´
5´
DNA。
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´
内切酶
3´ (recBCD)
3´ 5´ 5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
3´ 5´ 5´ 3´ 5´ 3´
DNA侵扰 (recA)
5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´ 5´ 3´
5´ 3´ 3´ 5´
分支迁移 (recA)
均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组
2、特定位点-----附着位点（attachment site
◘ E.coli attB 含BOB’三序列 23bp
att）
◘ λphage attP 含 POP’三序列 240bp ◘ 核心序列 “O”完全一致 （同源部分） ---位点特异性重组发生的地方 B,B’,P,P’---臂
◘
3、整合过程
◘ 整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’） ◘ 整合位点---attB、attP 切除位点---attL、attR ◘ 整合过程需要λ整合酶 （integrase Int）（λ编码） 和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用