4重组表达质粒的构建——基因的克隆
重组表达质粒的构建——基因的克隆
长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。
选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。
原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种：
1）酶切连接
这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。
2）TA克隆
TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3′末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3′末端A正好匹配。这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3′末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。
3）TOPO克隆
TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。主要原理是在T载体的T碱基上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，其克隆效率提高数倍，并且操作极其简单，整个反应体系不需要在添加连接酶成分。如果在线性化平端载体上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，平端连接将不再是难题，如果再配合一个致死基因ccdB （Control of cell death）使用，凡是没有插入外源核酸序列的空载体自连，转入大肠杆菌可以正常表达ccdB蛋白，破坏细菌DNA gyrase(促旋酶)，造成细菌染色体降解而死亡；而插入外源核酸序列的会干扰ccdB蛋白的正常表达，细菌可以正常存活，平端克隆高背景问题这样得以完美解决。
4）Gateway技术
该技术所依赖的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应。需要限制酶切回收、T4 Ligase连接；该方法一步就可以完成，只需要将基因克隆到入门载体（Entry Vector）,依赖载体上的特定的重组序列和重组酶，将外源基因克隆到具有相同重组序列的载体上；入门载体一般包含两个attL1和attL2,中间夹杂一个ccdB自杀基因，自连的空载体在转入大肠杆菌中都不会存活。入门载体构建成功之后，就可以轻松地将入门载体和目的载体质粒混合加入重组酶即可发生重组，生成所需要的融合质粒，当然还有一个副产品质粒。这种克隆方法适合于将一个基因批量化构建到不同载体系列中进行功能测试。这种技术也适合于大批量的文库构建，具体细节在此就不做赘述。
该技术主要的缺点是：该技术系统使用的酶非常昂贵，而且酶非常不稳定；其次，适合于gateway技术的载体非常少，只有一个厂家生产而且昂贵，来源受限；对于大片度（>10Kb）的效率很低，与传统的酶切-T4连接技术相比没有优势。
5）Infusion技术
这个是目前比较流行的克隆技术，可以任意载体任意基因片段快速实现多片段、长片段定点定向克隆，
最大的优点在于不依赖于酶切位点进行克隆，操作时间也非常短，只需要10～15min；缺点是：载体和外源片段连接处的重叠15bp必须坚持末端原则，不能“甩出”，这也限制了定点克隆的“任意发挥”。
6)Frdbio SimpleClone技术
本克隆技术是在福因德生物基础团队在Infusion技术上的升级，除了兼具Infusion技术的全部优势外，还具有以下特点：克隆片段重叠区可以少于15bp,最短可以至10bp,反应温度50℃，载体线性化之后，重叠区可不必末端对齐，可以“允许末端甩出”，实现真正意义上的任意位点克隆。
下面介绍两种比较常用的构建方式：
A 酶切连接法构建载体
1）50 μl酶切体系: PCR回收产物/载体～2μg,限制性内切酶A 1μl (10U), 限制性内切酶B 1μl (10U),双酶切Buffer 5μl，H2O补充至50μl；37℃连接4～6h。
2）10 μl连接体系:酶切PCR回收产物与酶切线性化载体摩尔比为10:1，Ligase 0.5μl，10*Ligase Buffer 1μl, H2O补足至10μl（体系中线性化载体浓度不低于10ng/μl），16℃连接过夜。
连接产物可用于转化大肠杆菌。
B Simpleclone重组酶法构建载体
1）载体线性化：
载体线性化同上文“SOP3酶切连接法构建载体”。
2）外源片段的获得：参照Simpleclone重组酶说明书设计引物并扩增获得，保证两端分别与线性化载体末端有15nt重叠区。
3）反应体系的配制(10μl)：
实验组：线性化载体50ng，外源插入片段50ng，5×Simpleclone重组连接反应液2μl，补足水至10μl；
阴性对照组：线性化载体50ng，外源插入片段50ng，补足水至10μl；
阳性对照组：线性化载体pUC19 Control Vector20 ng，外源插入片段2 kb Control Insert fragment 50ng，5×Simpleclone重组连接反应液2μl，补足水至10 μl ；
4）将以上体系配置好在PCR管底部（阴性对照和阳性对照实验可选做），配好后放在PCR仪上或水浴锅中50℃ 15min。
同源重组和基因工程
同源重组（Homologus Recombination) 是指发生在染色体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合，同源重组需要一系列的酶催化。 !!!是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： 片段重组体(patch recombinant) 拼接重组体(splice recombinant) 片段重组体： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) ：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 基因工程(genetic engineering) ：实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程。 工具酶功能 限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA DNA连接酶催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3′末端 Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5'→3'聚合、 3'→5'外切活性，而无5'→3'外切活性。常用于cDNA第二链合成， 双链DNA 3'末端标记等 反转录酶①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶切除末端磷酸基 基因载体：
基因工程原理讲义：基因克隆的质粒载体
第六讲基因克隆的质粒载体 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
基因克隆的质粒载体 一、导言 1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体 其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。2．质粒的类型多种多样 F质粒：F因子或性质粒(Sex plasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的 寄主受体细胞中去。 R质粒：通称抗药性因子(Resistant factor, R factor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒 的适宜的受体细胞中去。 Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素可使不带Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 3．质粒载体 70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。
二、质粒的一般特性 1．质粒DNA(细菌质粒定义) *1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖 于寄主提供核酸酶及蛋白质。 *2.质粒DNA分子大小 文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD *3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系 一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
4重组表达质粒的构建——基因的克隆
重组表达质粒的构建——基因的克隆 长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。 选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。 原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种： 1）酶切连接 这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。 2）TA克隆 TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3′末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3′末端A正好匹配。这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3′末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。 3）TOPO克隆 TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。主要原理是在T载体的T碱基上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，其克隆效率提高数倍，并且操作极其简单，整个反应体系不需要在添加连接酶成分。如果在线性化平端载体上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，平端连接将不再是难题，如果再配合一个致死基因ccdB （Control of cell death）使用，凡是没有插入外源核酸序列的空载体自连，转入大肠杆菌可以正常表达ccdB蛋白，破坏细菌DNA gyrase(促旋酶)，造成细菌染色体降解而死亡；而插入外源核酸序列的会干扰ccdB蛋白的正常表达，细菌可以正常存活，平端克隆高背景问题这样得以完美解决。 4）Gateway技术 该技术所依赖的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应。需要限制酶切回收、T4 Ligase连接；该方法一步就可以完成，只需要将基因克隆到入门载体（Entry Vector）,依赖载体上的特定的重组序列和重组酶，将外源基因克隆到具有相同重组序列的载体上；入门载体一般包含两个attL1和attL2,中间夹杂一个ccdB自杀基因，自连的空载体在转入大肠杆菌中都不会存活。入门载体构建成功之后，就可以轻松地将入门载体和目的载体质粒混合加入重组酶即可发生重组，生成所需要的融合质粒，当然还有一个副产品质粒。这种克隆方法适合于将一个基因批量化构建到不同载体系列中进行功能测试。这种技术也适合于大批量的文库构建，具体细节在此就不做赘述。 该技术主要的缺点是：该技术系统使用的酶非常昂贵，而且酶非常不稳定；其次，适合于gateway技术的载体非常少，只有一个厂家生产而且昂贵，来源受限；对于大片度（>10Kb）的效率很低，与传统的酶切-T4连接技术相比没有优势。 5）Infusion技术 这个是目前比较流行的克隆技术，可以任意载体任意基因片段快速实现多片段、长片段定点定向克隆，
原核生物的同源重组
原核生物的同源重组 在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。同源重组的频率与DNA或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。 3.1.1 原核细菌的基因转移程序 原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种： 1．Ca2+诱导转化法 1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收 噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。 2．原生质体转化法 在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。此时，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，均匀混合。通过
第8章 细胞重组与克隆技术
第8章细胞重组与克隆技术 8.1细胞重组 8.1.1细胞重组定义 指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。 8.1.2细胞重组的特点与意义 8.1.3细胞重组方式 细胞重组的方式基本分为以下三种： （1）胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种。 （2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体。 （3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。 8.1.4细胞重组材料的获得 8.1.4.1 胞质体（cytoplast)的获得 定义：是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 制备方法：用细胞松弛素B处理体外培养细胞能诱发其排核。借助细胞松驰素的这种作用，结合高速离心可以得到胞质体。 制取容器及条件 结构特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置。 8.1.4.2 核体的获得 定义：与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。 制备方法： 8.1.4.3 微细胞(microcell)的获得 定义：又可被称为微核体，是只含有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体。 制备方法：秋水仙素及其衍生物和长春花碱等有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。 将从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞作为材料，通过显微操作技术，在光学显微镜下用显微操纵器把材料重新归合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇（PEG）等融合因子，经过一段时间的作用，可以把它们重新装配成新的活细胞。 8.1.5 显微操作技术 借助显微操作仪进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各种物质的注入、测量微电位的变化等等操作。 8.2克隆技术 植物界——吊兰 动物界——孙悟空 8.2.1 克隆(clone)的定义 本意——是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体。目前——指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无性繁殖（或无性繁殖操作）。关键技术——核移植。 克隆的三个层面 分子克隆：分子水平上的克隆。如基因克隆。 细胞克隆：细胞水平上的克隆。如制备单克隆抗体的杂交瘤细胞的克隆。 动物克隆或植物克隆：个体水平上的克隆。如利用营养繁殖和组织培养技术生产的植物。8.2.2 克隆的理论基础 细胞全能性。 细胞的分化。 植物界 *克隆现象在植物界普遍存在，既可以是自然的，也可以是人工的。
gateway重组技术
河南农业大学牧医工程学院 1 Gateway 基因克隆 Gateway 基因克隆是由Invitrogen 公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。该技术利用专有的重组序列使得DNA 片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA 转移成为可能。 这一技术在插入的目的DNA 片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone ）。据Invitrogen 宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA 保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA 片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology ）。 一、Gateway 基因克隆的原理及机制 Gateway 被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector ）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector ，目的载体）上。 Gateway 的原理是建立在噬菌体DNA 定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF 、Int ）的作用下，lambda 的attP 位点和大肠杆菌基因组的 attB 位点可以发生定点重组，lambda 噬菌体DNA 整合到大肠杆菌的基因组DNA 中，两侧产生两个新位点：attL 和attR 。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis 和IHF 、Int 的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB 和attP 位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
克隆载体与表达载体教程文件
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
Gateway重组克隆技术
Gateway? 重组克隆技术 经典的克隆工作流程包括许多步骤，尤其是传统的限制性内切酶克隆方法。这种传统的方法限制了克隆的成功率。 例如，当其可能会在目的基因内部进行切割， 从而截短插入片段，并使得基因无法用于下游表达时，某些限制性内切酶是不能使用的。采用传统的克隆方法， 需要额外的片段回收步骤，而且在克隆大片段DNA 时，将会遇到重组效率降低， 从而需要浪费费很多时间以筛选到所需的克隆的问题- 所有这些步骤都会耗费大量的时间和精力，而且成功还无法得到保障。 而Gateway? 重组克隆技术则不存在这些问题。 极好的通用性 相反，Gateway? 重组克隆技术则规避了这些克隆限制，使您几乎能够使用任何表达系统。Gateway? 重组克隆采用了99% 有效且可逆的一小时重组反应， 并且不使用限制性内切酶、连接酶、亚克隆步骤，也不需要对不计其数的菌落进行筛选，从而节省您的时间、金钱和精力。Gateway? 技术自推出后便为研究界广泛采用， 仅参考文献便超过1500 篇。此技术使跨学科研究的合作变得简单方便，而且能从这些研究团体中获得众多载体用于真正的多学科科学研究。 最后，MultiSite Gateway? 技术等最新进展使得Invitrogen 的 Gateway? 克隆成为蛋白质表达和功能分析的理想克隆方法。 Gateway? 技术的优点 只需一小时，室温克隆反应便能快速产生您所需的克隆，效率高达99% 以上 无需使用限制性内切酶或连接酶便能保持片段正确的插入方向和阅读框，从而，获得可直接进行表达的克隆 从靶标鉴定到验证始终使用同一个克隆，无需重新测序，从而确保结果在整个实验过程中一致 使DNA 插入片段从一个表达载体穿梭到另一个表达载体，既提高了灵活性，同时还简化了克隆工作流程
基因克隆的质粒载体
基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。
第四章克隆策略与体外重组.
第四章克隆策略与体外重组 一、填空题 1．克隆策略有三层涵义：(1)第一层是—--------------—； (2)第二层涵义是—----------------—； (3)第三层涵义就是-------------------- 。 2．假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件： (1)—-----------------—(2)——------------------ (3)—------------------—。 3．现有的基因克隆策略大体上分为三类：—--------------—、—------------—、—--------------—。 4．受体细胞的感受态是—--------------—。 5． DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)—---------------—(2)—------------— (3)————————————（4)—--------------------—。 6．平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比黏性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端DNA连接的效率。常用的凝聚剂是--------------——。 7．一个细菌的表面大约有—-----------—个同DNA结合的位点。 8． 1984年,Hung和Wesink发现如果两个不同的5’黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端，即可有效地相互连接：(1)—---------------—(2)—----------------— (3)——----------------。 9．将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个—-------------—，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个—---------------—。 10．将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个—----------—，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个—-------------------—。 11．在构建cDNA克隆之前，可以用—-----------—来富集一特殊的核苷酸序列。做法是用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA 分子杂交。 12．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用——技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。 13．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用—---------—可以将这段DNA进行百万倍的扩增。 14．SD序列是mRNA分子中同——结合的序列，其结构特征是—----------—的全部或一部分。
一种高效构建同源重组DNA片段的方法_融合PCR
中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2007,27(8):53～58 技术与方法 一种高效构建同源重组D NA 片段的方法 ———融合PCR 李 敏 杨 谦 3 (哈尔滨工业大学生命科学与工程系 哈尔滨 150001) 摘要 融合PCR 技术(fusi on PCR )采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR 产物,通过PCR 产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA 片段连接起来,此技术在不需要内切酶消 化和连接酶处理的条件下实现DNA 片段的体外连接,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。对原有的融合PCR 技术进行改进,以3个同源重组线性DNA 片段的构建为例,详细论述了改进的融合PCR 技术的反应过程及技术体系。结果表明,改进的融合PCR 技术可以同时进行3个片段及4个片段的融合反应,产物长度均在4.5kb 以上,各同源重组片段在扩增过程中均无 突变发生,获得的片段可以用于后续实验分析。关键词 融合PCR 重组片段 同源臂 抗性基因 中图分类号 Q784 收稿日期:2007204217 3通讯作者,电子信箱:yangq@hit .edu .cn 随着大规模的基因组测序计划的完成及大量表达序列标签数据库(dbEST )的建立,基因组研究已由结构基因组逐渐转向了功能基因组研究 [1] 。以同源重组技 术为基础,通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体并取代基因组中野生型的等位基因,进而研究目的基因与表型性状间的关系,是研究动物、植物、微生物基因功能的一种非常有用的遗传操作方法 [2～4] 。 同源重组的发生依赖于载体与目的片段间存在一定的DNA 序列同源片段,同源片段越长越有利于同源重组事件的发生。传统的同源重组载体的构建以限制性内切酶和DNA 连接酶为基础,通过一系列的酶切连接反应将各片段逐步连接起来。这种方法费时费力,不但在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列,而且对于长片段的连接有时难以找到合适的酶切位点。为了克服传统的同源重组载体构建方法的缺陷,出现了以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术———融合PCR 技术(fusion PCR )。融合PCR 技术在 不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下,采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。现有的融合PCR 技术一般包括两步PCR 反应:(1)应用特异性引物,对各片段进行独立扩增,特异性引物的5′末端带有一段相邻片段的互补序列;(2)在同一反应体系中加入各片段的混合物,以一对外侧引物进行融合片段的全长扩增。由于融合PCR 技术正处于初步发展阶段,在应用过程中还存在很多方面的问题,如融合产物长度一般在4.0kb 以下、待融合片段的个数一般不超过3个、产物特异性差等。Robert 等 [5] 应用融合PCR 方法进行了3个片段的融合反应,获得了3个融合产物,融合产物长度最大为 4.2kb 。Majid 等 [6] 在进行4 个片段的连接时,首先将425bp 的alcA 启动子片段和 1.9kb 的pyr4基因片段连接到pUC19载体上,得到一 个2.1kb 的pyr4ΟalcA 表达盒,再通过两步PCR 将 2.1kb 的pyr4ΟalcA 表达盒与两个长度分别为410bp 和513bp 的片段进行了融合,最终才获得了一个由4个片 段组成的长3.0kb 的融合产物。
无缝克隆,同源重组克隆 (1)
1.1.1Gibson assembly 简介（INTRODUCTION） 原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。 装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）, 高 保真DNA聚合酶。（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。下面是组装的示意图。 材料（MATERIALS） ?试剂（REAGENTS） NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH ，50% PEG-8000，mg/ mL Tag ligase，μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB 平板（相应抗性） ?实验前准备（SETUP） 于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。 4x isothermal assembly buffer NAD 20 mg
一步法构建同源重组载体
一步法构建同源重组载体 王海艳 （中国农业大学） 同源重组载体构建需要分别克隆目的片段两端的同源臂（长度~1kb），并与Marker基因进行连接。传统的构建方法是两段同源臂分别克隆构建到目的载体， 费时费力。在本例中，本人已经成功应用汉恒生物科技（上海）有限公司的 HB-Infusion TM无缝克隆试剂盒，将同源臂及Marker基因一步成功构建到载体上， 现将实验过程及结果分享如下： 1. 目的片段引物的设计 用NEB builder（https://https://www.360docs.net/doc/3e2659570.html,/watch?v=8_-t5xtJ3y8），或snapgene，genome compiler等软件，将三个目的片段的基因序列、线性化载体的基因序列按照软件使用说明依 次填入，将自动生成所需要的引物序列（如下表）。将引物提交华大基因进行合成。 引物序列列表 Primers Seq Tm GC(%) Len Fragment dDNA-P1 attgggtaccgggccctctagATATACTCGACAGGGCCCGC 73.5 61 41 3'-flank dDNA-P2 gtcactgtacGTGTGGCATTGCCCAGTCA 64.3 55 29 dDNA-P3 aatgccacacGTACAGTGACCGGTGACTCTTTCTG 66.8 51 35 5’-flank dDNA-P4 atcggtgcTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG 65.7 59 29 dDNA-P5 atctccactcgaGCACCGATGTCGCCACGC 68.5 63 30 Marker fragment dDNA-P6 aagggaacaaaagctggagctGTAGTAGAGAACTTGGACTTCGGCG 70.8 50 46 2. 目的片段的扩增 反应体系 DNA(248ng/μL) 1 μL
目的基因片段与克隆载体质粒的连接操作步骤
连接反应总体积为10μL，体系组成如下： 回收纯化的PCR扩增目的基因片段 7.0μL 10×Ligation buffer 1.0μL T载体（10ng/μL） 1.0μL T4 DNA ligase 1.0μL 共10.0ul 混均后，4℃连接18-24小时，连接所得克隆载体命名为TA-VP4-STI。 转化操作方法 1）取一管-80℃保存的感受态细胞，置冰上融化； 一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以100ul为例： 2）加入连接物（50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；
3）将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟，该过程不要摇动离心管； 4）向每个离心管中加入500ul液体LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。 5）将离心管内容物混匀，吸取100ul已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上（含50 ug/ml氨苄青霉素），用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。 涂布用量可根据具体试验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul 转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心 （4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）
克隆技术
基因克隆 科技名词定义 基因克隆 经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。 从基因组或DNA中分离单个基因，并在细胞中复制拷贝的过程。 基因克隆(gene cloning) 是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进行"外科手术"。 基因克隆-基因 基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓"种瓜得瓜，种豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。 基因克隆-基因克隆技术 基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性繁殖、基因操作、重组DNA
无缝克隆,同源重组克隆
简介（INTRODUCTION） 原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。 装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）, 高保真DNA聚合酶。（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。下面是组装的示意图。 材料（MATERIALS） 试剂（REAGENTS） NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000， 2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而 定）、LB平板（相应抗性） 实验前准备（SETUP） 于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。 4x isothermal assembly buffer NAD 20 mg H2O 300 μL 1 M MgCl2300 μL 1 M DTT 300 μL 10 mM dNTP mix 600 μL 1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL
目的基因的克隆转化及重组子筛选
目的基因的克隆、转化及重组子筛选 一．实验目的： (1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。 (2)学习DNA连接的有关技术。 (3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。 (4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 (5)掌握质粒提取的基本方法。 (6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。 二．实验原理： (1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。 (2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。 (3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。 三．实验材料： 大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2DNA割胶回收试剂盒，试管，Amp/IPTG/X-Gal，三角玻璃棒，玻璃珠，牙签，1μl pMD19-T Vector、质粒提取试剂盒。 四．实验步骤、现象、结果及分析： (1)cDNA电泳及胶回收 1. 提取总RNA，反转录cDNA，用设计好的引物扩增出不同的目的片段。取目的基因产物进行琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。 2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。 表一：cDNA琼脂糖凝胶重量 空管2管3管 重量（g）0.9045 1.2280 1.2961 净重（g）0.3235 0.3916 3.按1g/1ml 的量，大致各加入400μl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）； 4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液； 5.在柱子中加入300μl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液； 6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液； 7.10000g 离心1min（去乙醇）； 8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20μl。室温放置1min，10000g 离心1min。