实验四、PCR产物的T载体克隆和转化
T载体连接获得重组DNA实验报告
T载体连接获得重组DNA实验报告引言在分子生物学研究中，重组DNA技术是一项十分重要的技术手段。
通过将不同来源的DNA片段组装到载体中，可以构建出具有特定功能的重组DNA。
本实验旨在通过T载体连接方法，将目标基因片段与T载体连接，进而获得重组DNA。
实验材料•T载体（已线性化）•目标基因片段DNA•T4 DNA连接酶•T4 DNA连接酶缓冲液•ATP酶活化缓冲液•DNA酶切酶•DNA酶切缓冲液•PCR扩增反应体系实验步骤1.提取目标基因片段DNA。
可通过基于PCR的方法扩增该基因片段，然后进行酶切，获取所需的DNA片段。
2.线性化T载体。
将T载体进行酶切，使其线性化以便与目标基因片段连接。
3.准备连接反应体系。
将线性化的T载体与目标基因片段DNA以1:3的摩尔比加入到连接反应中。
加入适量的T4 DNA连接酶、T4 DNA连接酶缓冲液和ATP酶活化缓冲液。
4.进行连接反应。
在适当的温度下，进行连接反应，使T载体与目标基因片段DNA发生连接。
5.酶切验证。
取连反应体系的一部分进行酶切验证，使用适当的限制性内切酶，如EcoRI等，将连接后的T载体和目标基因片段DNA进行酶切。
通过琼脂糖凝胶电泳，验证连接反应的成功与否。
6.验证重组DNA。
将连接后的T载体与目标基因片段DNA进行测序验证，确定重组DNA的正确性。
实验结果通过酶切验证，确认连接反应成功，目标基因片段与T载体成功连接。
通过测序分析，确认重组DNA的正确性和完整性。
实验讨论通过T载体连接方法，在本次实验中成功将目标基因片段与T载体连接，获得重组DNA。
实验中需要注意的是，选取适当的酶切酶和连接酶，以及优化反应条件，能够提高连接反应的效率和成功率。
结论本实验通过T载体连接方法，成功将目标基因片段与T载体连接，获得重组DNA。
该方法可以应用于分子生物学研究中的基因克隆、基因工程等领域。
参考文献待补充以上实验报告以Markdown文本格式输出，满足1200字的要求。
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
pcr产物连接t载体
pcr产物连接t载体PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，可在体外迅速扩增特定DNA片段。
常见的应用之一是将PCR产物连接到T载体上，以便进一步研究和分析。
本文将介绍PCR产物连接T载体的步骤和注意事项。
一、材料准备1. PCR产物：经PCR扩增得到的目标DNA片段。
2. T载体：一种载体，其末端具有“T”碱基（胸腺嘧啶）的一对互补序列，可与PCR产物进行连接。
3. T4 DNA连接酶：用于催化连接反应的酶。
二、PCR产物连接T载体步骤1. 酶切T载体：将T载体进行线性化，以便与PCR产物进行连接。
按照酶切酶厂商提供的酶切条件，在适当的缓冲液中进行酶切反应。
2. 纯化线性化的T载体：通过凝胶电泳等方法纯化线性化的T载体，以去除酶切剂和副产物。
3. PCR产物末端处理：将PCR产物进行末端处理，以便与T载体连接。
这一步骤通常使用多聚核苷酸添入酶（如T4 DNA聚合酶）对PCR产物末端进行A尾化处理。
4. T载体与PCR产物连接：将线性化的T载体与末端处理后的PCR产物进行连接，通常在适当的缓冲液中，加入T4 DNA连接酶，进行连接反应。
5. 进一步处理：将连接反应混合液经过适当的热处理或其他方法，以便降低非特异性连接和副产物的生成。
6. 转化大肠杆菌：将连接后的混合物转化到大肠杆菌中，通过培养和筛选，获得含有PCR产物的重组质粒。
三、注意事项1. 杂交温度：连接反应中的杂交温度需根据T载体末端的“T”碱基特性来确定。
一般而言，约为55-65°C。
2. 酶切反应时间：酶切T载体的时间需根据酶切剂的推荐时间来确定，过长或过短的酶切时间都会影响连接效率。
3. 转化菌株的选择：应选择适合的大肠杆菌菌株进行转化，以获得较高的转化效率和选择性。
4. 正负对照：在进行PCR产物连接T载体时，可以设置正负对照实验，以确保连接结果的准确性。
总结：PCR产物连接T载体是一种常用的分子生物学技术，它为后续的DNA克隆和遗传工程研究提供了重要的工具和平台。
实验四_T_A_克隆及转化
PCR产物的连接及转化
一、实验目的
• • • • 弄清T载体的结构和T-A克隆的原理； 弄清蓝白斑筛选的原理； 学会PCR产物连接方法； 学会连接产物转化大肠杆菌感受态方法。
二、实验原理
• 1、T-A克隆原理
通过PCR的方法扩增目的基因片断，为了后续实验的需要，
往往需要将获得的目的片断通过TA克隆的方法，重组到T-载体 中。外源DNA与载体分子的连接称之为DNA重组，这样重新组 合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在T4 DNA连 接酶作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将载体分 子与外源DNA分子进行连接。
• • • • • • （低温、加温）水浴锅 离心机 PCR扩增仪 恒温培养箱 摇床 超净工作台等
主要试剂
• • • • pMD 18-T Vector试剂盒 PCR扩增回收纯化的片段 200 mg/ml的IPTG 过滤除菌 20 mg/ml的X-gal 溶于二甲基甲 酰胺，避光保存。（低温、加 温）水浴锅 • LB培养基（ 含IPTG，X-gal， 50mg/ml 氨苄青霉素)
四、实验步骤
• 1、
产生不同末端的DNA聚合酶
• α互补 原理
许多载体（包括pMD18-T）都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码 其N端氨基酸（α肽链）的片断基因。宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。当 二者产物组合在一起，就具有活性酶的产生，此现象称为α互补。由α互补形成 的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal显色测定出来，它能将无色的化合 物X-gal切割成半乳糖和蓝色底物。当外源DNA片断插入到多克隆位点后，就会
破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽
TA克隆简述
生物秀论坛『中国生物科学论坛』PCR产物的T载体克隆（一）重组T质粒的构建一．原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能，一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。
对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。
为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。
一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。
通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。
对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。
双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
实验十三、PCR产物的纯化与克隆
三、载体加dT尾方法：
实验步骤：
1. 将1ul pUC19用Sma I全酶切。 2. 在小管中按上述PCR反应，加入各种混合物，其中4ul4种dNTP改 为4ul 25 mmol/L dTTP. 3. 加入1ul（5单位）的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2小时。 4. 用酚：氯仿：异戊醇抽提两次。 5. 加入两倍体积无水乙醇，在-20℃下沉淀1小时。 6. 离心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10 ul ddH2O中。
目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产CR产物与载体粘末端连接
1. 在7ul PCR产物中加1ul带dT尾的pUC质粒 (T-Vector)。 2. 加1ul T4DNA连接酶，1ul 10X连接缓冲 液，混匀，16℃连接过夜。 3. 取5ul连接产物转化感受态细胞并筛选重 组子。
实验十三、PCR产物的纯化与克隆
一、概述
扩增的PCR产物如利用T-Vector可直接进行克隆。如用自 备的平末端或粘性末端载体连接，往往需要将产物纯化。克 隆的主要方法有： 1、平末端连接： 由于TaqDNA聚合酶往往在PCR产物3’端加 上多余的非模块依赖碱基，在用平末端连接克隆PCR产物前， 可用Klenow片段或T4DNA聚合酶处理补平末端。 2、在PCR产物尾部加dT或ddT：TaqDNA聚合酶会在3’端加 上多余的非模块依赖碱基，而且对A优先聚合，所以PCR产 物末端的多余碱基大部分都是A。利用这一特点，载体平末 端用酶加上dT或ddT，使载体在PCR产物末端互补并进行连 接。载体末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或 ddTTP。 3．粘性末端连接：利用引物中附加在5’端的限制酶位点，直 接将PCR产物经适当的限制性内切酶切割后产生粘性末端， 与载体连接，产生重组DNA。
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接) PCR实验技术
PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)
【实验原理】
1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。
切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。
商品化的T载体有很多。
本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。
这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。
由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。
【试剂与器材】
（一）试剂
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
2.TAE电泳缓冲液
3.琼脂糖（Agarose）
4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。
1 / 9。
T载体克隆连接原理、制备及载体序列
T载体克隆连接原理、制备及载体序列T载体的定义：T载体（T-Vector）是一种髙效克隆PCR产物（TA克隆）的专用质粒载体，为线性化载体，无需酶切可直接与具有A末端的PCR产物连接，属于非定向克隆。
T载体的作用原理：大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都具有在PCR产物的3'末端添加一个“A”的特性（下图红色框内所示位置）。
因此，人们在线性化平末端载体的两端分别又人工加上一个额外的T碱基（下图两个红色箭头所示），从而可与PCR克隆产物的A末端互补配对，提髙了PCR产物连接和克隆的效率。
T载体进行TA克隆的优势：相对于另一种非定向克隆平末端克隆，使用T载体进行TA克隆是一种快速、髙效、一步到位的非定向克隆法。
有研究曾证明，平末端克隆的连接效率仅为粘端连接的1/50，且自身环化率髙。
T载体的制备：1商业化T载体：一般来说，商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶（如EcoRV）将克隆载体进行线性化，然后再单独加入dTTP和Taq酶72〜751反应，进行末端的加T。
2自制T载体：一种常见的自制方法是利用限制性内切酶制造出具有单个T末端突出的片段,最常用的内切酶为Xcml,其识别和切割特点如下：其中XcmI的识别序列分别为两端的CCA和TGG，而切割序列则为中间三角箭头所指的N（N代表任意碱基）。
由于N可以是任意碱基，所以如果将切割位置的N设置为T，那么在该酶的切割下，就可以产生一个3'T末端。
相似的，在其互补链上设置另一个相同或者类似的XcmI酶切位点（保证切割位点为T即可）就可以产生另一个T末端。
一般可以在商业化的T载体基础上进行改造，通过PCR或者合成Oligo的方式插入上述两个XcmI位点。
连接成功的质粒可按需要自行扩增和保存，使用时用XcmI进行完全酶切（这里的酶切必须保证完全，否则载体易自连，所以XcmI酶最好过量，或者适当延长消化时间），就可以制备得到T载体。
[3]常见T载体及序列：虽然上面提到可以自制T-Vector，但实际上现在的商业化载体已经做到比较便宜，而且批次间稳定性保持的不错。
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3´
3´ A(A)nA
5´
5´ 3´ 末端转移酶 + dATP 5´ 3´A(A)nA 3´ T(T)nT 5´
5´
T(T)nT 3´
T4 DNA连接酶 15º C
重组体
四、外源DNA导入宿主细胞——转
受体菌条件： 安全宿主菌
限制酶和重组酶缺陷
处于感受态(competent) 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)
志比昆仑
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一、目
（三）PCR扩增特定基因
（四）人工合成
青海大学 Qinghai University
从基因组DNA文 库获取目的基因
组织或细胞染色体DNA
限带的所 有基因组DNA的集合
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青海大学医学硕士研究生课程
医用分子生物学 实验技术
青海大学 Qinghai University
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重组DNA技术操作步骤
青海大学 Qinghai University
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基本原理
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体细胞
外源基因与载体的连接 重组体的筛选
五、目的基因的筛选和鉴定——筛
外源基因导入宿主细胞后，筛选含有 目的基因的阳性克隆并加以扩增。
所用的方法主要有遗传学方法、免疫
学方法、核酸杂交法、PCR等。
1. 借助载体上的遗传标志进行筛选 (1) 利用抗生素抗性标志筛选 (2) 利用基因的插入失活/插入表达 特性筛选 (3) 利用标志补救筛选 (4)利用噬菌体的包装特性进行筛选 2. 序列特异性筛选
1.克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是
DNA水平上的操作。
2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
实验原理
• 普通Taq酶会在3´末端加一个A，这样所有PCR产 物都会在双链DNA的3´端均有一个单链状态的A； • T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3´端均有 一个单链状态的T；
克隆基因的表达
青海大学 Qinghai University
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主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞
④ DNA重组体的筛选和鉴定
⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究
青海大学 Qinghai University
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
克隆载体 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化菌
限制酶切位点
cos L R cos
真核生物染 色体DNA
限制酶消化
cos L 左臂
限制酶部分消化
除去中间片段
R cos 右臂
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
连接反应
体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌
目的基因片段与 T载体 DNA连接，达到克隆基因
的目的。
• 材料：目的基因片段（回收的PCR产物） • 药品：pEMG T-Vector (Promega公司)
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数千碱基对。常
有1 ~ 3个抗药
性基因，以利于 筛选。
质粒载体
基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。 这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主 细胞。宿主和载体编码的片段各自半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转 化成蓝色的代谢产物，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位 点上插入外源DNA片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有
目的片段（100ng/ul） pGEM-T Easy（50ng/ul） T4 DNA Ligase 2×Rapid Ligation Buffer Total • 备注：混合均匀，瞬时离心。 4℃连接16小时，-20储存或直接用于转化。 3μl 1μl 1μl 5μl 10 μL
说 明
1. 回收 DNA 片段可以用沉淀法，但是只适用于 PCR 扩增 产物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行；
（一）黏性末端 （二）人工接头的使用
（三）加入同聚体尾 （四）平端连接
（一）黏性末端
（二）人工接头
（三）加入同聚体尾
待克隆DNA片段
混合、退火
重组质粒
空白质粒
（四）平端连接
目的基因
5´ 3´ 5´ 限制酶或机械剪切 3´ 5´ λ-核酸外切酶 3´ 5´ 3´ 5´
载体DNA
限制酶 3´ 5´ λ-核酸外切酶 5´ 末端转移酶 + dTTP 3´
(1) RE酶切法
(4) DNA测序法
(2) PCR法
(3) 核酸杂交法
（一） 遗传学方法
1. 插入灭活法
插入失活筛选带有重组载体的克隆
志比昆仑
学竞江河
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2. 蓝-白筛选（α互补）
许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含
有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨
活性的β-半乳糖苷酶，结果菌落呈现白色。
α互补筛选（蓝-白筛选）
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PCR产物的T载体 克隆和转化
青海大学 Qinghai University
实验目的： 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。 实验要求：
掌握利用 T 载体克隆 PCR 产物的方法；复习连接
实验流程。
技术应用：
2.此种连接方法是根据普通 Taq酶会在3´末端加一个A的
原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的
Taq酶会自动切除末端的 A，所以，这种酶的扩增产物
需要补加A后再连接。 3.T- 载体的阳性克隆筛选同样可以使用录酶 cDNA
AAAA
逆转录酶
AAAA TTTT
复制
双链cDNA 载体
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
重组DNA分子受体菌 cDNASI核酸酶化学合成法获取目的基因
由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。
二、载体的选择与准备——选
几种常用克隆载体的比较
比较内容 质 粒 λ噬菌体 黏性质粒 M13噬
+
<22 kb
+ +
40～50 kb
+ -
<1 kb
-
亚克隆
序列分析 E.coli表达
+
+ +
+ +
-
+
+ -
注：+表示可用；-表示不可用
三、DNA分子的体外连接——接
• 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，
从而达到克隆的目的。
载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位
pGEM-T 载体的结构
pGEM-T Easy 载体的结构
实验步骤
（1）目的片段的制备--胶回收法回收PCR产物：
(2)连接实验：
在0.2ml PCR管加入以下试剂：