Gateway重组克隆技术
Gateway克隆技术,简单易操作
Gateway克隆技术，简单易操作在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，在DNA连接酶的作用下，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。
但是现如今我们再提到克隆的时候，远远不再只有传统的限制酶克隆一种选择。
其中Gateway克隆技术作为一种可以快速、高效将DNA 序列转移到载体上的克隆方法已经流行开来。
不要觉得Gateway克隆技术高深莫测，其实了解一下你就能懂。
Gateway克隆方法是λ噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应的体外形式。
在体内，噬菌体（attP）和细菌（attB）的附着位点发生重组反应，噬菌体整合到细菌基因组中，两侧为两个新的重组位点（attL-left-和attR-right-）。
在某些条件下，attL和attR位点可以重组，导致噬菌体从细菌染色体上切除并重新生成attP和attB位点。
即Gateway技术依赖于下面描述的两个反应：BP反应和LR反应，通过BP反应获得入门克隆(有时候我们也说中间克隆)，再通过LR反应将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上，形成不同的表达载体。
GeneCopoeia的EZShuttle™重组克隆体系应用E.coli 和λ噬菌体特异位点的重组酶促体系使DNA片段在载体间相互转换，其原理与Gateway 克隆技术相同。
BP反应-构建入门载体：通过PCR将attB位点添加到目的DAN序列两侧，形成attB-PCR产物。
用attB-PCR产物或者含attB位点的供体质粒和含attP位点的质粒发生重组生成入门克隆。
EZRecombinase BP混合物，货号：RCBM-1002-020LR反应-构建表达载体：制作表达载体时，选择适合的目标载体非常重要。
这种选择取决于许多因素，如宿主类型，所需的表达水平和实验目的。
选定的attR表达载体与attL-入门载体重组以产生表达载体。
EZRecombinase LR混合液，货号：RCBM-1001-020。
Gateway 克隆技术背景原理及其应用
If the normal attB site is deleted from the chromosome, integrase can bind with lower affinity to secondary sites on thechromosome, resulting in integration of lambda at a different site. The frequency of integration into secondary sites is 100-1000 times rarer than integration into attB. The actual crossover occurs between homologous 15 bp core regions on the two sites, but surrounding sequences are required as they contain the binding sites for the recombination proteins (Landy, 1989).
Modifications to the att Sites
Mutations have been made to the core regions of the att sites to eliminate stop codons and to ensure specificity of the recombination reactions to maintain orientation and reading frame. Mutations have been introduced into the short (5 bp) regions flanking the 15-bp core regions of the attB sites to minimize secondary structure formation in single-stranded forms of attB plasmids (e.g. phagemid ssDNA or mRNA). A 43 bp portion of the attR site has been removed to make the in vitro attL x attR reaction irreversible and more efficient (Bushman et al., 1985).
gateway技术
Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
图1 Gateway技术的灵活性Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
二、一项强大而可靠的技术Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。
BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体
利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应，利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体，以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。
根据Gateway技术要求，设计含有attB接头的引物，使用NEB的Phusion超保真聚合酶，通过PCR方法，扩增SmNAC1基因的特异性片段。
通过BP重组反应，将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上，再通过LR重组反应，利用入门载体上的SmNACi 特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。
实验结果表明Gateway 载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上，为植物基因转化提供基础。
标签：RNAi；Gateway载体；BP和LR反应Gateway克隆技术是由invitrogen公司开发，基于λ噬菌体的位点特异性重组原理[1-2]，可以使DNA片段在不同的克隆载体之间实现转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。
λ噬菌体的位点特异性重组是在噬菌体和细菌的整合因子（INF，Int）的作用下，λ噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生2个新位点：attL，attR。
这是一个可逆的过程，在噬菌体编码蛋白Xis和细菌的整合因子IHF，Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB，attP位点。
这一过程受编码蛋白Xis和整合因子（IHF，Int）调控。
与经典基因克隆多个步骤相比，Gateway技术不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到表达载体（destination vector，目的载体）上，该方法只需一步生化反应便能达到目的，是高通量克隆基因的好方法。
关于TOPO和GATEWAY
Gateway®克隆的强大性和灵活性
在目的基因（go或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®入门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体，创建各种各种各样的表达克隆。当每一个基因具有进行Gateway®重组的att序列时它们就可能在载体间穿梭。
Gateway技术原理
Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个反应构成的（表2和图4）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
6）用10-50μl，涂于平板上，正放5min后，37摄氏度倒置培养过夜
7）直接进行PCR检测，或挑取菌落在50μl含有50μg/ml氨苄或25μg/ml Zeocin™的LB培养基（置于200μl微量离心管中）培养4h
或者：
Fresh PCR product1.33 µl(from Step 1)
Salt Solution0.33µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
TOPO Vector（载体）0.33 µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
FINAL VOLUME2.00µl
1)连接：按上表进行配制溶液后，轻轻混匀，室温静置5min
2）转化：将试管置于冰盒中进行冰浴5-30min
（图2）
TOPO克隆高效性原理
Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。
Gateway
Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。
由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。
在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。
ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。
需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。
同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。
当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。
Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统
Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统，大大简化基因克隆和亚克隆步骤，同时克隆效率高达95％,当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可保证正确的方向和阅读框。
Gateway技术基于λ噬菌体位点特异重组系统（attB ×attP →attL ×attR）。
BP和LR两个反应就构成Gateway技术，BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆；LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应，用于在平行的反应中把目的序列转移到一个或更多目的载体。
Gateway技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。
完成构建Gateway表达克隆仅需两步：⑴创建入门克隆，通过PCR将目的基因克隆进入门载体；⑵混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway LR Clonase，产生表达克隆（用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析）。
构建入门载体PCR重组克隆重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的一种方法。
通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育扩增PCR产物和pDONR载体(包含attP位点)及GatewayBP ClonaseTM酶混合物。
接着转化进大肠杆菌中，您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。
这个入门克隆可以与任何Gateway目的载体进行重组。
表达系统一旦您构建好Gateway入门克隆，就可以使用Gateway技术进入到几乎是无数种的表达系统。
Gateway技术为进行基因功能分析和蛋白表达提供了广泛深入的方法，通过把目的基因转移到优化构建的体外表达载体，pEXP1-DEST 或pEXP2-DEST，然后开始体外蛋白合成。
目前有很多具有不同启动子的大肠杆菌目的载体，提供一系列表达选择，Gateway目的载体也提供N端或/和C端融合标签的选择，简化表达蛋白的纯化和检测。
实验方案gateway
实验方案Gateway® 反应的基本原理∙BP反应—构建Gatew ay® 入门克隆∙LR 反应—构建Gatew ay® 表达克隆∙一管模式—从PCR 产物构建Gatew ay® 表达克隆∙Gatew ay® 载体转化—将您喜爱的克隆载体转化成Gatew ay® 载体TOPO® TA 克隆- 创建Gateway® 入门克隆∙∙步骤一–制备PCR 产物使用Taq 聚合酶和自己的方案生成PCR 产物。
通过最后7 到30 分钟的延伸步骤，结束PCR 反应。
步骤二- 进行TOPO® 克隆反应1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO® 克隆反应。
对于电穿孔，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释盐溶液。
试剂化学转染电穿孔法新鲜的PCR 产物0.5 至 4 µl 0.5 至 4 µl盐溶液 1 µl --稀释盐溶液-- 1 µl无菌水至终体积为 5 µl 至终体积为 5 µlTOPO® 载体 1 µl 1 µl总体积 6 µl 6 µl∙2. 轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟。
3. 置于冰上，然后开始转化One Shot® 化学感受态 E. coli，步骤如下步骤三- 转化One Shot® 化学感受态E. coli1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶One Shot® E. coli 细胞。
2. 在一小瓶One Shot® 化学感受态E. coli 中加入 2 µl TOPO® 克隆反应液，轻轻混匀。
3. 在冰上孵育 5 至30 分钟。
4. 将细胞置于42°C 下热休克30 秒，不振荡。
立即将试管转移至冰上。
5. 加入250 µl 室温S.O.C. 培养基。
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Gateway® 重组克隆技术
经典的克隆工作流程包括许多步骤，尤其是传统的限制性内切酶克隆方法。
这种传统的方法限制了克隆的成功率。
例如，当其可能会在目的基因内部进行切割，
从而截短插入片段，并使得基因无法用于下游表达时，某些限制性内切酶是不能使用的。
采用传统的克隆方法，
需要额外的片段回收步骤，而且在克隆大片段DNA 时，将会遇到重组效率降低，
从而需要浪费费很多时间以筛选到所需的克隆的问题- 所有这些步骤都会耗费大量的时间和精力，而且成功还无法得到保障。
而Gateway® 重组克隆技术则不存在这些问题。
极好的通用性
相反，Gateway® 重组克隆技术则规避了这些克隆限制，使您几乎能够使用任何表达系统。
Gateway® 重组克隆采用了99% 有效且可逆的一小时重组反应，
并且不使用限制性内切酶、连接酶、亚克隆步骤，也不需要对不计其数的菌落进行筛选，从而节省您的时间、金钱和精力。
Gateway® 技术自推出后便为研究界广泛采用，
仅参考文献便超过1500 篇。
此技术使跨学科研究的合作变得简单方便，而且能从这些研究团体中获得众多载体用于真正的多学科科学研究。
最后，MultiSite Gateway® 技术等最新进展使得Invitrogen 的
Gateway® 克隆成为蛋白质表达和功能分析的理想克隆方法。
Gateway® 技术的优点
只需一小时，室温克隆反应便能快速产生您所需的克隆，效率高达99% 以上
无需使用限制性内切酶或连接酶便能保持片段正确的插入方向和阅读框，从而，获得可直接进行表达的克隆
从靶标鉴定到验证始终使用同一个克隆，无需重新测序，从而确保结果在整个实验过程中一致
使DNA 插入片段从一个表达载体穿梭到另一个表达载体，既提高了灵活性，同时还简化了克隆工作流程。